Syntetisk biologi möjliggör konstruktion av proteiner med oöverträffade egenskaper med hjälp av co-translational införande av icke-kanoniska aminosyror. Vi presenterade här, hur en spektralt röd-skiftat variant av en GFP-typ fluorophore med romanen fluorescens spektroskopiska egenskaper, kallas ”guld” fluorescerande protein (GdFP), produceras i E. coli via selektionstryck inkorporering (SPI).
Fluorescerande proteiner är grundläggande verktyg för biovetenskap, i synnerhet för fluorescensmikroskopi av levande celler. Medan vildtyp och konstruerade varianter av grönt fluorescerande protein från Aequorea victoria (avGFP) samt homologs från andra arter redan täcker stora delar av det optiska spektrumet, finns en spektral klyfta i nära infraröda området, för som avGFP-baserade fluorophores är inte tillgängliga. Röd-skiftat fluorescerande protein (FP) varianter skulle väsentligen expandera toolkit för spektral minoriteter av flera molekylära arter, men naturligt förekommande röd-skiftat FPs härrör från koraller eller havsanemoner har lägre fluorescens kvantutbyte och sämre foto-stabilitet jämfört med varianter av avGFP. Ytterligare manipulation och eventuell utvidgning av kromoforens konjugerade system mot den mån spektrala-regionen är också begränsad av repertoaren av 20 kanoniska aminosyror som föreskrivs av den genetiska koden. För att övervinna dessa begränsningar, kan syntetisk biologi uppnå ytterligare spektrala röd-shifting via införandet av icke-kanoniska aminosyror i kromofor triaden. Vi beskriver tillämpningen av SPI på ingenjör avGFP varianter med romanen spektrala egenskaper. Proteinuttryck utförs i en tryptofan-auxotrophic E. coli stam och genom att komplettera odlingsmedier med lämplig indol prekursorer. Inuti cellerna, dessa prekursorer konverteras till de motsvarande tryptofan-analoger och införlivas med proteiner ribosomal maskineriet svar på UGG kodon. Byte av Trp-66 i den förbättra ”cyan” varianten av avGFP (ECFP) av en elektron-donera 4-aminotryptophan resulterar i GdFP med en 108 nm Stokes Skift och en starkt röd-skiftat utsläpp maximal (574 nm), medan det är thermodynamically stabilare än dess föregångare ECFP. Rester-specifika införlivandet av icke-kanoniska aminosyran analyseras av masspektrometri. GdFP spektroskopiska egenskaper kännetecknas av tid-löst fluorescens-spektroskopi som en av de värdefulla tillämpningarna av genetiskt kodade FPs i biovetenskap.
Sedan upptäckten av grönt fluorescerande protein i maneter Aequorea victoria (avGFP) i 19621 och första heterologa uttrycket i 19942 i andra eukaryota celler, har fluorescerande proteiner i familjen GFP blivit mycket värdefulla verktyg och mål inom life sciences. Omfattande genetisk och molekylär teknik ingår justeringen av artspecifika kodon användning, acceleration av vikning, förbättrad mognad, ökad ljusstyrka, förebyggande av oligomerisering och sömnad av spektral- och fotokemiska inklusive förmågan att reversibelt photoswitch3,4,5,6. GFP varar skyldig dess fluorescens från dess 4-(p– hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-en (HBDI) kromofor. Den senare bildas autocatalytically från så kallade kromofor triaden av aminosyror (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 i avGFP) efter bildandet av en ytterligare kovalent bindning inom peptid ryggraden under inflytande av molekylärt syre7. Resonantly stabiliserad konjugerade systemet samverkar dynamiskt med dess molekylära miljö, vilket möjliggör upptaget i det synliga området och karakteristiska grön fluorescens av dessa proteiner.
Inom kromofor Triaden är förekomsten av en aromatisk aminosyra obligatoriskt. Dock standard aminosyra repertoaren består av endast fyra aromatiska rester (hans, Phe, Trp och Tyr). Detta begränsar konventionella mutagenes strategier för att uppnå betydligt mer röd-skiftade avGFP varianter i förhållande till de mest röd-skiftat naturliga FPs såsom DsRed8 från Discosoma striata coralimorphs eller mKate/mNeptune9 från havsanemon Entacmaea quadricolor. Därför, den mån och nära infraröda delen av det optiska spektrumet över 600 nm är glest täckt av GFP varianter. Detta är naturligtvis en allvarlig begränsning för fluorescens mikroskopiska metoder som kräver spektral demultiplexning av flera fluorophore arter samtidigt. Till exempel lång våglängd markörer är också nödvändigt att göra använda av systemet låg absorption av hudvävnad mellan 700-1000 nm i inställningarna för djup vävnad imaging10.
Fluorescerande protein som härrör från avGFP är indelade i flera klasser baserat på spektroskopiska egenskaper och kemiska naturen av deras chromophores11. Med dess triad Ser-65/Tyr-66/Gly-67, vildtyp kromoforen finns som en skakad blandning mellan neutral, fenoliska form (λmax = 395 nm, ε = 21.000 M-1cm-1) och anjoniska phenolate form (λmax = 475 nm, ε = 7 100 M -1cm-1), och emissionsspektrum uppvisar en enskild topp på 508 nm. Hydroxylgruppen Ser-65 är av avgörande betydelse, som donerar en H-bond att Glu-222 i kromofor närhet (avstånd: 3,7 Å), som främjar joniseringen av denna bildas. Klass jag kännetecknas av en anjoniska phenolate kromofor, liksom i andra (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr; λmax = 488 nm, ε = 35,600 M-1cm-1λem = 509 nm). På grund av Ser-65-Thr(Ala,Gly) substitution, 395 nm excitation toppen av formuläret neutrala fenol är undertryckta och 470-475 nm toppen av de anjoniska phenolate är fem – till six – faldigt ökat och skiftade till 490 nm. Klass II består av proteiner med en neutral fenoliska kromofor, liksom i sapphire-GFP. Här Thr-203-Ile substitution nästan helt undertrycker 475 nm magnetiseringen, lämnar bara toppen på 399 nm. Eftersom anjon kromoforen inte kan vara korrekt solvatiserade, gynnas dess neutrala form. Klass III består av de ”gula” fluorescerande varianterna (EYFP; Ser-65-GLY/val-68-Leu/ser-72-Ala/THR-203-Tyr; Λmax ε = 514 nm, ε = 84, 600 M-1cm-1, λem = 527 nm) med π-stapling växelverkan av en aromatisk sidokedjan och phenolate, som åstadkommits genom Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr) substitutioner, som leda till upp till 20 nm röd-skiftat utsläpp maxima (Thr-203-Tyr). Ytterligare ersättning (Gln-69-Lys) resulterar i en annan 1-2 nm röd förskjutning till 529 nm, den mest röd-skiftade avGFP varianten känd11. Utbyte av fenol för en indol (Tyr-66-Trp) skapar klass IV, som i den cyan-fluorescerande ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24 800 M-1cm-1; λmax2 = 452 nm, ε = 23.600 M-1cm-1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). Inkvartering av den skrymmande indol aktiveras förmodligen som andra, kompenserande mutationer. De ECFP magnetisering och utsläpp maxima faller emellan de av proteiner med neutral eller anjoniska chromophores. Klass V proteiner harbor en Imidazol i stället för fenol (Tyr-66-hans), t.ex., blå fluorescerande proteiner som EBFP. Klass VI är producerad av en fenol-till-fenyl exchange gynnar formuläret neutrala kromofor uteslutande, vilket följaktligen leder till mest blå-skiftat excitation och utsläpp topp positioner (360 nm och 442 nm, respektive).
Klassiskt webbplats riktad mutagenes är särskilt lämplig för produktion av Roman avGFP kromofor varianter, av permutationen av 65-67 tripeptid och samverkande rester i ramen av de 20 aminosyrorna som kanoniska. Dessa möjligheter kan utökas ytterligare när icke-kanoniska varianter av aromatiska aminosyror införs under ribosomala proteinsyntes12. I princip finns det två sätt att åstadkomma detta. Den första strategin bygger på substrat toleransen av protein översättning maskiner, särskilt av aminoacyl-tRNA-synthetases (aaRSs) mot relaterade aminosyra analoger. Att uppnå detta med hög verkningsgrad, auxotrophic E. coli stammar som uttryck är anställda som inte kan syntetisera motsvarande naturliga aminosyran. Detta tillåter utbyte av den senare genom att lägga till lämpliga icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) eller prekursorer därav till odlingsmediet. Denna strategi, även känd som selektiv tryck inkorporering (SPI)13,14, kan rester-specifika ersättare, som resulterar i global införlivandet av ncAA. Den andra strategin använder stop kodon suppressor tRNAs som debiteras med ncAA av konstruerad aaRS enzymer. Detta resulterar i en genomläsning av i-frame stop kodon och tillåter platsspecifika ncAA inkorporering. Denna metod av stop kodon suppression (SCS) leder följaktligen till expansionen av den genetiska kod15. Via mutagenes placeras ett stop-kodon i målgenen på önskad plats. I princip kan SPI också användas att skapa rekombinanta peptider och proteiner bär en unik ncAA installation, med tanke på att sällsynta kanoniska aminosyror såsom Met eller Trp väljs för substitution. Med Trp, SPI metoder har visat sig fungera med ett stort utbud av analoger inklusive 4 – F-, 5 – F – och 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH – och 5-OH-Trp, samt 4- och 5-NH2– Trp eller ens β (thienopyrrolyl) alanin derivat16 ,17,18,19,20. SPI kan således vara mycket fördelaktigt för att ersätta aromatiska aminosyror av GFP chromophores av icke-kanoniska varianter att undersöka möjligheten för att ytterligare skräddarsy spectra och Stokes förskjutning av dessa FPs. När det gäller alla protein sequence ändringar prövas förenlighet med FP vikning och kromofor mognad experimentellt.
I detta arbete använder vi klass IV ECFP21, som bär i stället för den vildtyp avGFP Tyr, Trp rester inom dess kromofor triad. Med SPI, ersätts denna Trp-66 (och Trp-57, bara andra Trp återstoden i ECFP) av 4-amino-Trp. Förekomsten av den elektron-donera aminogrupp av 4-amino-Trp inom kromoforen gynnar resonans stabiliseringen av en långt rött-skiftat exciterat tillstånd proton överföring (ESPT) begåvad med en 108 nm Stokes SKIFT. Detta ”gold” fluorescerande protein (GdFP) utgör varianten med den största röda förskjutningen av fluorescensen maximal (574 nm) bland alla avGFP framställda proteiner. Vi beskriva metoden av GdFP proteinproduktion av SPI och ger protokollen för obligatorisk analys av de resulterande modifierade proteinerna av massa spektroskopi. Vidare visar vi hur GdFP kan användas och analyseras i tid-löst fluorescens-spektroskopi metoder.
För att uppnå mycket höga ncAA inkorporering effektivitetsvinster, bygger metoden auxotrophy-baserade SPI på användning av metaboliskt bakåtkompilerade värdceller, som inte klarar syntetisera den motsvarande naturliga motsvarigheten i ncAA. För E. coliär sådana stammar lätt tillgängliga. Även samtidiga införlivandet av flera ncAAs i samma protein är möjligt med hjälp av multiauxotrophic stammar. Rester-specifika funktionsläget av ersättning och kemiska repertoaren begränsas till liknande kemiska analoger kan ses som nackdelar. Dock kan ett stort antal protein varianter produceras som den naturliga bakteriella översättning apparaturen tål många aminosyra analoger. Exempelvis kunde mer än 50 ncAAs införlivas med proteiner med hjälp av in vitro- översättning, för cirka 73% av alla kodon av den genetiska koden ska vara tillgänglig för omtilldelning40. SPI kan dessutom också effektiv multisite märkning av de mål protein41. I princip SPI metoden är inte begränsad till E. coli, men kan arbeta i alla andra värdar och för varje av de kanoniska 20 aminosyrorna, förutsatt att auxotrophic stammar och definierade odling medier är tillgängliga. Till exempel finns två metionin analoger, azidohomoalanine (Aha) och homopropargylglycine (Hpg), kommersiellt tillgängliga och används för märkning proteiner och proteom i olika organismer. Aha kan dessutom producerade intracellulärt och därefter införlivas protein42. Detta ncAA är speciellt lämplig för bioorthogonal konjugationer såsom Klicka kemi som utvecklats av Tirrel och medarbetare: till exempel i plantera vävnad av Arabidopsis thaliana, Bombyx mori larver43, Drosophila celler44, larval zebrafiskar45 samt däggdjursceller inklusive nervceller46, proteiner kan märkas med Aha47,48. På samma sätt införlivades framgångsrikt Trp analoger av antimikrobiella peptider i Trp-auxotrophic Lactococcus lactis stammar49. SPI är också användbart för fältet i Xenobiology50,51, som undersöker alternativ till den grundläggande kemiska sammansättningen av liv. Till exempel utvecklades baserat på tidigare verk på E. coli52 och B. subtilis53, en E. coli -stam nyligen av en evolutionär strategi med selektiv tryck att använda thienopyrrole i stället för indol, vilket resulterar i proteomet-wide substitution av tryptofan genom thienopyrrole-alanin i den genetiska kod54. Generellt, den kanoniska aminosyran Trp, som kodas av en enda triplet (UGG), presenterar en lovande måltavla för proteinteknik på grund av de rika aspekterna av indol kemi, som erbjuder många kemiska varianter. Nyligen, och som ett alternativ till SPI-baserade införlivande, rapporterade en roman SCS plattform kapabel att införliva Trp analoger anläggningsvis i både bakteriella och eukaryota värdar har varit55. Detta breddar ytterligare verktygslådan för i vivo ncAA-baserade protein engineering, inklusive ändring av spektrala egenskaper.
Förutom användningen av auxotrophic uttryck värdar kräver SPI protokollet strikt jäsning förhållanden, både vad gäller mål uttryck timing och sammansättningen av mediet för att nå hög ncAA inkorporering effektivitet och protein avkastningsmålet 56. odling utförs med kemiskt definierade minimal media, som i huvudsak innehåller förutom stora salter källorna till kväve (ammoniumsalt) och kol (D-glukos), vitaminer och spårämnen. Även om inte strikt krävs i avsaknad av ytterligare auxotrophies, de återstående aminosyrorna (20 –n, om n aminosyror är bytas) läggs vanligen till främja bakterietillväxt57. Under en initial tillväxtfas före induktion av målet proteinuttryck läggs n kanoniska aminosyror bytas i begränsa halterna. Cellulära tillväxt fortsätter tills de rikta essentiella aminosyrorna är uttömda, så experimentellt indikeras av en stationär OD600. Därefter ersättas odlingssubstratet med färska medium som saknar utarmat aminosyran och innehåller ncAA i riklig koncentrationer. För ribosomal inkorporeringen av tryptofan analoger som visas i detta protokoll, matas en indol analoga, som blir intracellulärt konverteras till motsvarande tryptofan derivatan av tryptofan syntas58. Nästa, target proteinuttryck induceras. I detta skede är cellerna nära slutet av logaritmisk tillväxt, som en balans mellan antalet totala celler och kondition. Som närvaro och införlivandet av de kanoniska amino skulle leda till vildtyp proteinproduktion, är det viktigt att säkerställa att den essentiella aminosyran är helt urladdat före induktion. Likaså är det obligatoriskt att undersöka effektiviteten av ncAA införlivande i målproteinet, vanligen genom masspektrometri. Vid påtaglig närvaro av kanoniska aminosyran odling villkor behöver justeras, t.ex., genom att ändra koncentrationen av den grundläggande amino acid(s) för den första tillväxtfasen eller varaktigheten av den senare. Vid låg aaRS aktivitet mot ncAA, kan överuttryck av enzymet endogen eller samtidig uttryck för en annan aaRS, som är mer aktiv mot ncAA, vara genomförda59.
Kanoniska aminosyran Trp begåvas med tre anmärkningsvärda funktioner: (i) dess naturliga överflöd i proteiner är låg; (ii) dess biofysiska och kemiska egenskaper är unika (t.ex., är det oftast dominerande ursprunget till den inneboende fluorescensen av proteiner och peptider), och (iii) det bidrar till en mängd biokemiska interaktioner och funktioner inklusive Π-stapling, H-bindning och katjon-π interaktioner. Alla dessa funktioner är radikalt vid Trp → 4-amino-Trp substitution GdFP. bortom tvivel, utformningen av en ”guld” klass av avGFPs är ett anmärkningsvärt exempel för tekniska skräddarsydda autofluorescent proteiner. Med distinkta spektrala egenskaper, kan FPs stämmas mot vissa spektrala windows via mutagenes och ncAA inkorporering. Vid GdFP sker detta genom ett enkelt kemiskt utbyte H → NH2 i ramen av indol-ring i ECFP kromofor triaden. Figur 5 visar effekterna av ncAA inkorporering inom kromoforen. Införandet av gruppen elektron-donera med ursprung från 4-amino-indol (intracellulärt konverteras till 4-amino-Trp) möjliggör en mängd mesomera strukturer som kan förklara en stabiliserad exciterat tillstånd. Spectroscopically, dess utvidgade Stokes Skift och röd-skiftat fluorescens utsläpp resultera från dessa distinkta egenskaper det utökade konjugerade systemet. Som rapporterats tidigare, förbättrad intramolekylära kostnad överföring inom GdFP kromoforen är till sin natur känslig för pH (figur 4B) och åtföljs av en större förändring i dipolmoment mellan S0 marken och S1 upphetsad staten i förhållande till ECFP33. Som alternativa elektron-donera grupper, skulle tryptofan analoger bär en indol-ring ersättas med hydroxy grupper kunna användas, som rapporterats i en jämförande studie med den modell protein barstar41.
Absorption och fluorescens spektra av GdFP är breddat jämfört med ECFP och andra (figur 3 c och D). Homogen breddning av banden absorption och fluorescens orsakas vanligtvis av vibrations lägen i kromoforen och dessutom av kopplingen av kromoforen till ytterligare vibrations lägen finns i protein60. Kopplingen till den lokala protein miljön stöds av avgifter lokaliserade på kromoforen. Eftersom det strukturella inhomogenitet av protein leder till lokala variationer av vibronic spektrum, sådan koppling mellan vibronic spektra av kromoforen och resten av proteinet stöds av kostnad utlokaliseringarna och mesomera stater som anges i Figur 5. Denna koppling också stöder stora Stokes övergången och minskar nödvändigtvis fluorescens quantum avkastning. I jämförelse med andra röda-skiftat FPs uppvisar GdFP även förbättrad protein stabilitet och en låg tendens för aggregering33,61,62. Det inte bara skiljer sig i färg från andra FP-varianter men också uppvisar en väsentligt ökad termostabiliteten och förbättrad kooperativa fällbara33. Dess fluorescensintensitet är minst 90% bevaras vid uppvärmning till 60 ° C, medan ECFP fluorescens reduceras till ca 30%. I proteiner bidrar aromatiska aminosyror ofta till nätverk av samverkande sida kedjor, som vanligen har en stabiliserande effekt på proteinets tertiär struktur. avGFP hamnar sådant side chain nätverk, som består av kromoforen själv, samt Phe-165, hans-148, och Tyr-145. Dessa sida kedjor är inte bara ganska styv i de GdFP struktur33, men ännu viktigare, de bildar hydrofoba kontakter med kromoforen. Den mest framstående roman funktionen identifieras i GdFP är att aminated kromoforen är mer proximalt Phe-165. Denna interaktion är en funktion som inte observerats i andra kända avGFPs. De två restsubstanser förekommer 3,2 till 4,5 Å apart, kan amino-aromatiska interaktioner också vara närvarande. Tillsammans med aminering-inducerad resonans stabiliseringen av kromoforen stabilisera dessa troligen denna hydrofoba nätverk av aminosyror i en kooperativ mode. En effektivare intramolekylära kostnad överföring kan stödjas av dessa interaktioner i jämförelse marken glada delstaten kromoforen och åtminstone delvis står för den 108 nm Stokes Skift33,62 .
I rationell design av fluorophore egenskaper förväntas en ökning av storleken på delocalized π-systemet resultera i en röd-skiftat excitation våglängd. Denna tumregel är lydde av serien av aminosyror i position 66 leder till neutrala chromophores: Phe (λmax = 355 nm) < hans (λma x= 386 nm) < Tyr (λmax = 395 nm) < Trp (λmax = 436 nm)63. I naturen, har denna utvidgning av kromoforens konjugerade system av π-obligationer uppnåtts genom olika strategier. För DsRed från Discosoma striataförlängs av integrationen av en ytterligare aminosyra, därmed skifta λmax till 573 nm64. Kromoforen av asFP595 (λmax = 595 nm) från Anemonia sulcata förlängdes med en imingrupp grupp, utvidga dess π-systemet65. Eftersom kromoforen av GdFP och andra avFPs är av samma storlek, måste en annan princip innebära emissionsvåglängden i spänna av den utökade DsRed och asFP595 chromophores. Den djupgående Stokes förskjutningen av 108 nm tillskrivs den tydliga strukturen i GdFP kromoforen, som avslöjar en ny photophysical princip i utformningen av autofluorescent proteiner. Preliminära beräkningar (som rapporterats i 62) har visat att dipolmoment av glada-state kromoforen i GdFP är betydligt större än i grundtillståndet, i motsats till respektive värdena för ECFP. Medan dipolmoment av GdFP ökar från ~ 3 D (Debye) i tillståndet S0 till ~ 15 D i S1, förändringen för ECFP kromoforen var ganska måttlig (från ~ 4 D till ~ 6 D). Således, den unika gyllengula fluorescensen av GdFP orsakas av betydande intramolekylära kostnad överföring inom kromoforen, vilket ökar mängden möjliga mesomera strukturer (se figur 5) som möjliggör resonans stabilisering. Detta minskar energinivån där utsläpp sker. Till följd av djupgående förändringen i dipolmoment vid excitation är de intramolekylära laddningsseparation rektor resonerar för förändringar i elektrostatiska potentialen av kromofor miljön. Omgivande proteinet matrix, justerar i sin tur till förändringar i avgiften fördelningen efter kromofor excitation. Den efterföljande strukturella avslappning sänker energi av glada kromoforen, som skiftar fluorescens spektrumet till röda på grund av dess kostnad överföring karaktär. För samma anledning som en följd av den stora Stokes Skift och förbättrade priser radiationless processer, fluorescens quantum avkastningen av GdFP minskas jämfört med ECFP33.
Den höga kvantutbyte och små Stokes förskjutning av ECFP och andra är vanligtvis tillskrivs en styv protein miljö av kromoforen, vilket minskar antalet frihetsgrader och, följaktligen, inre omvandling att gynna radiative uppmjukning av de exciterat tillståndet 66. följaktligen mer stelt inbäddade chromophores med minskad koppling till återstående protein matrix molekylär design kan fungera som en guide att producera längre röd-skiftat GFP derivat med hög fluorescence kvantutbyte. För ytterligare tekniska metoder för att producera röda-skiftade autofluorescent proteiner, därför utvidgningen av π-elektron och en styv kromofor struktur med svag koppling till protein miljön önskvärt. Sådana ändringar kan också införas antingen direkt i GFP-baserade chromophores eller genom placering av önskad ncAAs i kromofor närhet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den tyska forskningsfondens (kluster av Excellence ”Unifying begrepp i katalys) att T.F. och N.B. och av förbundsministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF Program” HSP 2020 ”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) till F.-J.S.
Chemicals | |||
4-aminoindole | Sigma-Aldrich | 525022 | |
acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
colloidal silica | Sigma-Aldrich | Ludox HS-40, 420816 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
glycerol | Carl Roth | 3783 | |
imidazole | Carl Roth | X998 | |
indole | Sigma-Aldrich | I3408 | |
iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
tryptone | Carl Roth | 8952 | |
yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
amino acids | |||
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab materials | |||
0.45 µm syringe filter with PVDF membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Luer-Lock syringe 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | Macherey Nagel | Protino series, 745410.5 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
protein extraction reagent BugBuster | EMB Millipore | 70921-4 | |
round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Trp-auxotrophic E. coli strain | ATCC | ATCC 49980 | Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass Spectrometry equipment | |||
mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | coupled with Infinity LC system |
mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
General equipment | |||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
peristaltic pump for LC | GE Healthcare | P-1 | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
UV/Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescence spectroscopy equipment | |||
ps-pulsed laser 470 nm | Picoquant GmbH | PDL-470 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software | Picoquant GmbH | SymPhoTime 64 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector | Picoquant GmbH | PML-16C | 16 spectral channels, to be selected by grating settings |
single photon counting software | Picoquant GmbH | SPCM 9.75 | |
global fitting software | Picoquant GmbH | SPC2Glo(R) | |
fluorescence decay data analysis software | Picoquant GmbH | FluoFit program | |
data analysis software | OriginLab Inc. | Origin 9.2 | |
neutral density filter set | Schott | NG1 to NG11 | (400 – 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %) |
488 nm long-pass emission filter | AHF Analysentechnik | AHF-488 | |
quartz cuvette | Thorlabs GmbH | CV10Q1400 | 1 cm pathlength |