Summary
인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.
Abstract
인간의 telomerase 역전사 (TERT), telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere RNA 의존 DNA 중 합 효소 활동을 통해. TERT는 역전사로 지명 된다, 비록 TERT의 구조 및 계통 발생 분석 TERT 오른 손잡이 polymerases의 회원 이며, 뿐만 아니라 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)에 관한 설명. 우리는 첫째로 RdRP 무료 한 RNA를 생성 하는 인간 TERT의 활동 비 코딩 RNA 서식 서 암 세포에 침묵 하는 RNA에 기여 하 고 식별. 이 정식이 아닌 효소 활동 분석, 우리 2009 년에서 재조합 TERT 분석 결과 RdRP를 개발, 그 후 생 TERT RdRP 시험 생체 외에서 설립. 이 원고에서 우리는 후자의 방법을 설명합니다. 간단히, TERT 면역성이 있는 복합물 셀에서 격리 되며 RNA 템플릿과 RdRP 반응에 대 한 방사성 rNTP를 포함 하 여 rNTPs와 알을 품을. 단일 가닥 RNA를 제거 하려면 반응 제품, 그리고 최종 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 분석은 RNase 처리 됩니다. 방사선된 RdRP 제품 하룻밤 노출 후 autoradiography 하 여 검색할 수 있습니다.
Introduction
인간의 telomerase 역전사 (TERT) 잘 알려져, telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere telomerase RNA 구성 요소 (TERC), 특정 RNA 템플릿1을 사용 하 여. TERT telomerase의 구성 요소로 서 telomeric DNA polymerizes, 비록 구조 및 계통 발생 분석 나타냅니다 TERT 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)와 밀접 하 게 관련 된 도메인을 공유 이러한 polymerases2,,34. RdRP 보완 RNA 가닥 RNA 서식 파일을 생성 하는 효소 이다. 효소는 바이러스 뿐만 아니라 모델 생물, 식물, 효 모, 벌레, 등 에서도 인코딩되고 RdRP에 의해 이중 가닥 RNA 합성 transcriptional 및 post-transcriptional 유전자가 유기 체5,6 침묵에 기여 . 인간의 RdRP 오랜 시간 동안 실종 됐다, 하지만 우리는 인간 TERT 20097에서 RdRP 활동을 발견.
우리는 먼저 재조합 단백질7, TERT의 RdRP 활동을 확인 후 민감한 생체 외에서 분석 결과 내 생 TERT8RdRP 활동 감지를 설립. 여기, 우리가 시험관에 RdRP 분석 결과 (분석 결과 IP RdRP) 생 TERT에 대 한 보여 줍니다. 이 방법은 생 TERT의 immunoprecipitation (IP)로 시작 하 고 뒤에 있는 방사성 ribonucleotides는 초기 RNA 가닥에 통합 RdRP 반응, 생체 외에서 .
Protocol
1. 시 약 설치
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셀 동기화에 사용 하는 시 약
- 2.5 m m 티 미 딘을 포함 하는 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)를 생성 하려면 125 m m 티 미 딘 준비 조직 문화 학년 물 1 mL 당 티 미 딘의 30.28 mg을 디졸브. 여과 0.22 μ m 주사기 필터 장치 솔루션. DMEM 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완의 50 mL 당 갓된 125 m m 티 미 딘 1 mL를 추가 합니다.
- Nocodazole의 0.1 μ g/mL를 포함 된 DMEM을 생성 하기 위해 디 메 틸 sulfoxide 5 μ g/μ nocodazole 준비를 (DMSO)에 nocodazole 분해. 추가 5 µ g의 1 µ L / µ L nocodazole DMEM의 50 mL 당 10% (vol/vol) FBS 보충.
- DMEM 포함 된 DMSO의 0.002% (vol/vol)를 생성 하려면 DMEM 10% (vol/vol) FBS와 보충의 50 mL 당 DMSO의 1 µ L를 추가 합니다.
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IP RdRP 분석 결과 대 한 사용 시 약
- 세포의 용 해 버퍼 a: 150 m m NaCl, 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 준비 및 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). 4 ° c.에 시 약 저장
- 아세테이트 버퍼 x 5를 준비: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.8), 500mm 칼륨 아세테이트 및 20 m m MgCl2. 실 온에서 시 약 저장.
- 워시 버퍼 1: 1 x 아세테이트 버퍼, 글리세롤 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) 트라이 톤 X-100 0.06 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일, ethylenediamenetetraacetic 산 (EDTA) 준비-무료. 사용의 일 또는 사용 하기 전에 하루에 워시 버퍼 1을 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장
- AGC 솔루션 준비: 아세테이트 버퍼, 10% (vol/vol) 글리세롤과 0.02% (wt/vol) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (챕). 4 ° c.에 시 약 저장
- 2mm CaCl2를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면 1 M CaCl2 AGC 솔루션 50 mL 당 100 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장
- 3mm 에틸렌 글리콜 bis (b-aminoethylether)를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), AGC 솔루션 50 mL 당 0.4 M EGTA (pH 7.5)의 375 µ L 추가. 4 ° c.에 시 약 저장
- 워시 버퍼 2: 1 x 아세테이트 버퍼와 0.02% (wt/vol) 챕 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장
- HMD 솔루션 준비: 0.2 M HEPES-코 (pH 7.8), 40 m m MgCl2 와 2 mM dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 시 약 저장
참고: HMD 솔루션 3 개월에서 이상 갱신 수 한다. - 가수분해 K 버퍼 x 2 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). -20 ° c.에 시 약 저장
- 버퍼를 로드 x 2 준비: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 오렌지 G. 저장-20 ° c.에 시 약
2입니다. HeLa 세포의 준비
참고: 준비 HeLa 세포 mitotic 단계 (조작) 또는 비동기적으로 나누어 동기화 (unmanipulated). 37 ° c.에 5% CO2 의 셀 문화
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헬러 세포 유사 분열에서의 동기화
- 플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.
- 이틀 후 도금, 2.5 m m 티 미 딘 및 10% (vol/vol) FBS DMEM의 10 mL 매체를 바꿉니다. 24 h에 대 한 셀을 문화.
- 세 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (-)의 10 mL로 세포 세척 하 고 10% (vol/vol) FBS 6 h에 대 한 포함 된 DMEM의 10 mL로 세포 문화.
- Nocodazole의 10% (vol/vol) FBS, 0.1 µ g/mL를 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.
- 부드럽게, 문화 접시를 흔들어 하 고 분리 mitotic 세포를 포함 하는 상쾌한을 검색 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.
- 원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다
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Unmanipulated HeLa 세포의 준비
- 플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.
- 도금, 후에 2 일 10 mL의 10% (vol/vol) FBS 포함 된 DMEM 매체를 바꿉니다. 문화 30 h 세포.
- 0.002% (vol/vol) DMSO 10% (vol/vol) FBS, 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.
- Trypsinization 1 mM EDTA를 포함 하는 트립 신 (2.5 g/L)의 0.7 mL을 사용 하 여 셀을 수집 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.
- 원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다
3. IP RdRP 분석 결과
- 단백질 A agarose 구슬 준비
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 선호도 수 지의 1 mL (침대 볼륨 500 µ L)를 전송. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.
- 구슬, 하의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총 세 세척)를 반복 합니다.
- 구슬에의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L를 추가, 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 회전 통에 4 ° C에서 튜브 하룻밤 (또는 적어도 4 h) 회전 합니다.
- 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 튜브 원심 그리고 삭제는 상쾌한.
- 구슬에 세포의 용 해 버퍼 A의 500 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° c.에 구슬 저장
- 세포 lysate의 준비
- (선택 사항) 셀 2 단계에서 고정 되어 셀 느슨하게 될 때까지 얼음에 냉동된 세포를 녹여 놓고.
- 셀 10 mL의 PBS (-)을 한 번 씻어. 1450 x g 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심 그리고 삭제는 상쾌한.
- 부드러운 pipetting으로 얼음 세포의 용 해 버퍼의 세포의 용 해 버퍼 A 1 x 107 셀의 당 (1 mL)으로 세포를 lyse.
- 다음 조건; 1.5 mL 튜브에 샘플을 sonicate 25%는 sonicator의 증폭을 설정 하 고 10 sonicate s.
- 4 ° c.에 15 분 동안 20400 x g 에서 샘플을 원심
- 상쾌한을 수집 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 1 mL를 각각을 전송 합니다.
주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- Immunoprecipitation
- 사전 취소 단계의 3.2.6 lysate 40 µ L (구슬 볼륨 20 µ L)를 추가 하 여은 lysate의 1 mL 당 prewashed 단백질 A agarose 구슬의. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 30 분에서 4 ° c.에 대 한 샘플을 회전
- 13000 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 샘플 원심 고 복구는 상쾌한.
- 40 µ (침대 볼륨 20 µ L) L prewashed 단백질 A agarose 구슬 및 안티 인간 TERT 항 체의 10 µ g의 추가 (복제: 10E9-2)8 에 사전 허가 lysate. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 밤에 4 ° C에서 샘플을 회전.
- 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 워시 워시 버퍼 1 구슬: 구슬에 워시 버퍼 1의 1 mL을 추가, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 3 추가 시간이이 단계를 반복 합니다.
- AGC 솔루션 2mm CaCl2를 포함 하는 구슬 한번 세척: AGC 솔루션 2mm CaCl2 구슬에 포함 된의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- Micrococcal nuclease (MNase)와 구슬 치료: 표 1에 설명 된 MNase 반응 혼합물을 준비. 부드러운 pipetting으로 구슬 MNase 반응 혼합물의 60 µ L에서 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 25 ° c.에 15 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에
참고: 기복이 셰이 커를 사용 하 여이 단계에서 속도 제한에 따라 엄격 하 게 매우 중요 하다. 동영상, 회전 믹서 등의 다른 유형을 권장 하지 않습니다. - 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 구슬 3mm EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션 두 번 세척: 구슬 3 m m EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 워시 워시 버퍼 2 한번 구슬: 워시 버퍼 2의 1 mL를 추가구슬, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 하 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. RdRP 반응을 설정 하는 동안 얼음에 비즈를 유지.
주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- RdRP 반응
- 표 2에 설명 된 대로 새로운 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비 합니다.
- [Α-32P]의 6 µ L 추가 UTP (3000 Ci/mmol) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합.
참고: [α-32P] ATP, [α-32P] CTP, 또는 [α-32P] GTP [α-32P] 대신 반응에 사용 될 수 있다 광섬유. - 템플릿 RNA의 1 µ L를 추가 (1 µ g / µ L) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합.
참고: 설정 하려면 RdRP 분석 결과, 다음 RNA 서식 파일 것이 좋습니다: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9. - 단계의 3.4.3 RdRP 반응 혼합물의 20 µ L와 구슬 pipetting으로 resuspend.
- 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 32 ° c.에 2 h 형 peltier 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에
- 가수분해 K (20 mg/mL)의 5.4 µ L과 2 x 가수분해 K 버퍼의 45.4 µ L 반응 혼합물에 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 턴테이블에 샘플 (20 ~ 25 rpm)를 흔들어
- 샘플에 RNase 무료 물 109.2 µ L를 추가 합니다.
- 샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 하 고 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플을 다음 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트의 추가 (pH = 5.2), 4 강 수 캐리어와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 µ L. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.
- -20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심
- 삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조.
주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
참고: 단계 3.4.11에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.
- RNase 처리
- RNase 무료 물 단계 3.4.11에서 20 µ L에서 펠 릿 resuspend
- 표 3에 설명 된 대로 새로운 튜브에 RNase 반응 혼합물을 준비 합니다.
- 샘플, RNase 반응 혼합물의 180 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h에 대 한 튜브를 품 어
- 샘플을 10% (vol/vol) SDS의 2.3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어
- 샘플을 가수분해 K (20 mg/mL)의 2 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어
- 샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 205 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 후 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송.
- 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 강 수의 4 µ L와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.
- -20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심
- 삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조.
참고: 단계 3.5.9에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.
- 젤 전기 이동 법 그리고 autoradiography
- RNase 무료 물 20 µ L와 샘플 resuspend
- 버퍼를 로드 x 2의 20 µ L를 추가 합니다.
- 95 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여 얼음에 샘플을 짝사랑.
- 젤을 실행 합니다. 서식 파일 크기 34 국세청 (단계 3.4.3 참조) 경우, 7 M 요소-10 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법을 변성 시키기 위해 사용 된다.
- 젤 젤 건조 기 건조.
- x-레이 카세트-80 ° c.에 강화 화면 내에서 건조 젤을 영화 노출
Representative Results
권장된 RNA 템플릿을 사용 하 여 방사성 RdRP 제품 하룻밤 노출 (그림 1A) 후 mitotic 단계에서 특히 HeLa 세포에서에서 20 ~ 30 뉴클레오티드 (nt) 사이 관찰 된다. RdRP 제품의 신호 강도 약 25 위치 두 봉우리를 설명 하는 일반적으로, 제품의 크기 분포와 협 화음에 nt 다음 세대 시퀀싱9에의해 확인 nt와 30. Mitotic 세포는 달리 동기화 없이 HeLa 세포는 거의 20-30 nt 방사성 제품의 부재를 보여 줍니다. 타원형 신호 20 아래 배치 된 모든 샘플에서 nt는 특이 현상이 나타난다.
경우에 mitotic는 HeLa 세포에서 약한 신호를 가진 ~ 30 nt 제품, RdRP 반응 잘 가지 않 았 어 나타냅니다. 예를 들어 MNase 치료 약 및 부적절 하 게 수행, mitotic 헬러의 신호 강도 세포 감소 크게 (그림 1B). 오래 된 HMD 솔루션 수행 RdRP 반응 또한 제품 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다.
그림 1 : Mitotic는 HeLa 세포에서 내 생 TERT의 대표 RdRP 제품. HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과의 (A) 3 개의 대표적인 결과 (조작) nocodazole 또는 (unmanipulated) DMSO로 치료. 화학적 합성된 34 nt RNA 템플렛으로 사용 되었다. (B) 부적절 한 MNase 치료 수행 mitotic HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과. (C) IP RdRP 분석 결과 신선한 또는 오래 된 HMD 솔루션 수행 mitotic HeLa 세포에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 볼륨 |
| Micrococcal Nuclease, 20 U / µ L | 1 Μ L |
| Micrococcal Nuclease 버퍼, 10 배 | 8 Μ L |
| RNase 무료 물 | 51 Μ L |
표 1: MNase 반응 혼합 구성 요소입니다.
| 시 약 | 볼륨 |
| 챕 스, 0.07% (wt/권) | 6 Μ L |
| HMD 솔루션 | 2 Μ L |
| rATP, 80 m m | 0.5 Μ L |
| rGTP, 8 mM | 1 Μ L |
| rUTP, 0.4 m m | 1 Μ L |
| rCTP, 8 mM | 1 Μ L |
| RNase 억제제, 40 U / µ L | 0.5 Μ L |
| RNase 무료 물 | 1 Μ L |
표 2: RdRP 반응 혼합 구성 요소입니다.
| 시 약 | 볼륨 |
| RNase 하나 Ribonuclease, 10 U / µ L | 0.2 Μ L |
| 반응 버퍼, 10 배 | 20 Μ L |
| RNase 무료 물 | 159.8 Μ L |
표 3: Ribonuclease 반응 혼합 구성 요소입니다.
Discussion
IP RdRP 분석 결과 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지 하는 중요 한 방법입니다. TERT 단백질 높은 mitotic HeLa 세포, TERT RdRP 복잡 한8,,910을 형성에 표현 된다. 이 mitotic는 HeLa 세포 RdRP 활동을 감지 하는 최적의 자료는 건의 한다. 위에서 설명한 프로토콜, mitotic 그리고 비 동기화 HeLa 세포 포함 됩니다 긍정 및 부정적인 예제로 각각. 그림 1A에서 같이, mitotic는 HeLa 세포에서 권장 RNA 템플릿에서 RdRP 분석 결과 제품 20 ~ 30 사이의 광범위 한 방사성 신호 표시 nt. HeLa 세포 이외에 우리 셀 라인의 종류와 시험 수행 있고 다른 세포 유형9에 신호 패턴을 변경할 수 있습니다 발견: 일부 강한 신호만 약 30 표시 nt, 일부는 HeLa 세포와 비슷한 패턴을 보여. 우리는 짧은 RNA는 34 nt 템플릿8, 이외 템플릿 분석 결과 수행도 하 고 긴 (~ 300 nt) 다양 한 시퀀스, RNAs 성공적으로 일부 선호 있을 수 있지만 해당 서식 파일에서 RdRP 제품을 얻을. 그러나 첫 번째 재판에 대 한, 좋습니다 mitotic 단계에 34 nt RNA 템플릿을 HeLa 세포를 사용 하 여. 뇌관-종속 및 뇌관-독립적인 방식으로11RdRPs 이중 가닥 RNA를 생성할 수 있습니다. 우리 보고 TERT 인간 RdRP7,9;이 속성 유지 TERT 다시 못쓰게 메커니즘73'-폴드 구조 RNA 템플릿에서 dsRNA를 합성. 34 nt RNA 서식 파일, TERT 뇌관9를 사용 하지 않고 보완 가닥을 합성. 특히 RdRP 제품 뇌관-독립적인 방식으로, 즉 드 노 보 합성 RNA 제품, [α-32P] 합성을 검출 하기 위하여 NTP [γ-32P]로 대체 될 수 있다 NTP RdRP 반응9에.
TERT 구슬에 면역성이 있는 복합물의 MNase 처리는 원하는 결과 달성 하기 위해 중요 한 단계 이다. 너무 오래 또는 집중 떨고 MNase 치료를 수행 하는 경우 RdRP 제품 현저 하 게 감소 것입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 좋습니다 엄격 하 게 신중 하 게 프로토콜을 따라. HMD 솔루션 성공 위한 또 다른 중요 한 요소 이다입니다. 신호는 매우 약한 찾을, 새로 준비 한 HMD 솔루션을 교체 합니다.
프로토콜을 통해 하나 RNase 오염을 피하기 위해 주의 해야한다. Ribonuclease 치료 전용 장비로 수행 되어야 한다. Ribonuclease 조작 후 팁 삭제 해야 하나 그리고 RNase와 튜브 즉시, 전문 솔루션 (예: RNase 조용한), RNase 제거 나무를 변경.
TERT TERC 뿐만 아니라 생 RNAs의 또한 많은 종류와 상호 작용 하 고 우리가7그들의 부분을 보고 있다. MNase 치료 없이 IP RdRP 분석 결과 같은 IP RdRP 분석 결과에서 수정 그들의 시퀀스 기능에 생 RNA 템플릿 RdRP TERT-관련 활동과 bioinformatic 가이드에 대 한 전체 목록을 제공 합니다. 우리가 성공적으로 조직 lysate에이 프로토콜을 적용 했습니다. TERT 정상 및 종양 직물의 다양 한 표현 때문에이 분석 결과 인간의 TERT의 비정규 효소 기능을 조사 하기 위해 유용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 일부에 의해 지원 되었다 프로젝트 암 치료제 (P-직접) (K.M. 15cm0106102h0002) 및 프로젝트에 혁신적인 연구 개발에 대 한 암 연구 및 치료 진화 (P-만들기) (16 cm 01061150001, K.M.) 일본 기관에서 의료 연구 및 개발, 아메드; 다케다 과학 재단 (사원); 부여 공주 다카마쓰 암 연구 기금 (13-24520, 사원); 그리고 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP16K07133 (사원).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
| Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
| Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
| Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
| Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
| Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
| Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
| Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
| Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
| Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
| Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
| cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
| Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
| 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
| Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
| rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
| [a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
| RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
| Proteinase K | Takara | 9033 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
| 3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
| Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
| RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
| Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
| Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
| CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
| Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
| Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
| Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
| Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
| MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
| Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
| Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |
References
- Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
- Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
- Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
- Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
- Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
- Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
- Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
- Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
- Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
- van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).
