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Genetics

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57021
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) न केवल telomeric डीएनए बल्कि आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि के माध्यम से भी डबल-कतरा आरएनए । यहां, हम अंतर्जात TERT की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक नव स्थापित परख का वर्णन ।

Abstract

मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) टेलोमिरेज की उत्प्रेरक उप इकाई है, और यह आरएनए-निर्भर डीएनए telomere गतिविधि के माध्यम से पोलीमरेज़ के बढ़ाव । हालांकि TERT एक रिवर्स transcriptase के रूप में नाम है, TERT के संरचनात्मक और वंशावली विश्लेषण प्रदर्शित करता है कि TERT सही हाथ polymerases का एक सदस्य है, और वायरल आरएनए-निर्भर आरएनए polymerases (RdRPs) के साथ ही वायरल रिवर्स transcriptase से संबंधित है । हम सबसे पहले मानव TERT की RdRP गतिविधि की पहचान की है कि पूरक आरएनए एक गैर कोडिंग आरएनए के लिए खड़े हो जाओ और कैंसर की कोशिकाओं में आरएनए मुंह बंद करने में योगदान करता है । इस गैर-विहित एंजाइमी गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, हम २००९ में रिकॉमबिनेंट TERT के साथ RdRP परख विकसित की है, इसके बाद इन विट्रो में स्थापित RdRP अंतर्जात के लिए परख TERT । इस पांडुलिपि में, हम उत्तरार्द्ध विधि का वर्णन । संक्षेप में, TERT प्रतिरक्षा परिसरों कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं, और RdRP प्रतिक्रिया के लिए रेडियोधर्मी rNTP सहित आरएनए और rNTPs टेम्पलेट के साथ मशीन । एकल असहाय आरएनए को खत्म करने के लिए, प्रतिक्रिया उत्पादों RNase मैं के साथ इलाज कर रहे हैं, और अंतिम उत्पादों polyacrylamide जेल ट्रो के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । Radiolabeled RdRP उत्पादों autoradiography द्वारा रातोंरात जोखिम के बाद पता लगाया जा सकता है ।

Introduction

मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) अच्छी तरह से टेलोमिरेज के उत्प्रेरक उप इकाई के रूप में जाना जाता है, और यह telomere आरएनए घटक (टेलोमिरेज), विशिष्ट आरएनए1टेम्पलेट का उपयोग TERC के बढ़ाव । हालांकि TERT polymerizes telomeric डीएनए टेलोमिरेज के एक घटक के रूप में, संरचनात्मक और वंशावली विश्लेषण संकेत मिलता है कि TERT बारीकी से वायरल आरएनए-निर्भर आरएनए polymerases (RdRPs) के साथ-साथ वायरल रिवर्स transcriptase, और शेयर डोमेन के साथ संबंधित है ये polymerases2,3,4. RdRP एंजाइम कि पूरक आरएनए एक टेम्पलेट आरएनए के लिए किनारा उत्पन्न करता है. एंजाइम न केवल वायरस में, लेकिन यह भी संयंत्र, खमीर और कीड़ा के रूप में मॉडल जीवों में इनकोडिंग है, और RdRP द्वारा डबल-असहाय आरएनए संश्लेषण transcriptional के लिए योगदान देता है और पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने इन जीवों में5,6 . हालांकि मानव RdRP एक लंबे समय के लिए याद किया गया था, हम २००९7में मानव TERT में RdRP गतिविधि पाया ।

हम पहले रिकॉमबिनेंट प्रोटीन7के साथ TERT के RdRP गतिविधि की पुष्टि की है, तो इन विट्रो परख में एक संवेदनशील स्थापित करने के लिए अंतर्जात TERT8RdRP गतिविधि का पता लगाने । यहां, हम में प्रदर्शन इन विट्रो RdRP परख (आईपी-RdRP परख) अंतर्जात TERT के लिए । इस विधि अंतर्जात TERT के immunoprecipitation (आईपी) के साथ शुरू होता है, और इन विट्रो RdRP प्रतिक्रिया, जिसमें रेडियोधर्मी ribonucleotides नवजात आरएनए किस्में में शामिल कर रहे हैं द्वारा पीछा किया ।

Protocol

1. रिएजेंट सेटअप

  1. कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन के लिए उपयोग किए गए एजेंट
    1. २.५ mm thymidine युक्त Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) उत्पन्न करने के लिए, thymidine के 1 एमएल प्रति ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी की ३०.२८ मिलीग्राम भंग १२५ mm thymidine तैयार करने के लिए । एक ०.२२ माइक्रोन सिरिंज फिल्टर इकाई के साथ समाधान छानने का । 1 मिलीलीटर के हौसले से तैयार १२५ mM thymidine प्रति ५० मिलीलीटर DMEM के 10% के साथ पूरक में जोड़ें (vol/) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) ।
    2. nocodazole के ०.१ μg/एमएल युक्त DMEM उत्पन्न करने के लिए, dimethyl sulfoxide (DMSO) में nocodazole भंग करने के लिए 5 μg/μL nocodazole तैयार करें । 1 µ l के 5 µ g/µ l nocodazole के प्रति ५० मिलीलीटर की DMEM 10% (vol/vol) FBS के साथ पूरक जोड़ें ।
    3. DMSO के ०.००२% (vol/vol) युक्त DMEM उत्पन्न करने के लिए, DMEM के 10% (vol/vol) के साथ पूरक FBS की ५० मिलीलीटर प्रति DMSO के 1 µ एल जोड़ें ।
  2. आईपी-RdRP परख के लिए इस्तेमाल किया एजेंट
    1. lysis बफर A: १५० mm NaCl, 20 mm Tris-HCl (pH ७.४) और ०.५% (vol/vol) Nonidet P-४० (NP-४०) तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    2. 5x एसीटेट बफर तैयार करें: ५० मिमी 2-[4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic एसिड (HEPES)-कोह (पीएच ७.८), ५०० मिमी पोटेशियम एसीटेट और 20 मिमी MgCl2. कमरे के तापमान पर एजेंट की दुकान ।
    3. धो 1 बफर तैयार: 1x एसीटेट बफर, 10% (vol/ग्लिसरॉल, ०.१% (vol/ट्राइटन x-१०० और 0.06 एक्स चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल, ethylenediamenetetraacetic एसिड (EDTA)-मुक्त । उपयोग के दिन या उपयोग करने से पहले दिन पर वाश बफ़र 1 तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    4. तैयार AGC समाधान: 1x एसीटेट बफर, 10% (vol/ग्लिसरॉल और ०.०२% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (लोग) । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    5. 2 मिमी CaCl2युक्त AGC समाधान उत्पन्न करने के लिए, AGC समाधान के 1 एम CaCl2 प्रति ५० मिलीलीटर के १०० µ एल जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    6. 3 मिमी ईथीलीन ग्लाइकोल बीआईएस (बी-aminoethylether)-एन, एन, एन ', N'-tetraacetic एसिड (EGTA) युक्त AGC समाधान उत्पन्न करने के लिए, ०.४ मीटर µ (पीएच ७.५) के ३७५ EGTA एल के AGC समाधान के प्रति ५० मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    7. तैयार धो बफर 2:1x एसीटेट बफर और ०.०२% (wt/vol) लोग । 4 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    8. तैयार HMD समाधान: ०.२ मीटर HEPES-कोह (पीएच ७.८), ४० मिमी MgCl2 और 2 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) । -20 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
      नोट: HMD समाधान तीन महीने में नए सिरे से किया जाना चाहिए ।
    9. 2x Proteinase कश्मीर बफर तैयार: 20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.६), 20 मिमी EDTA और 1% (wt/) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) । -20 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट की दुकान ।
    10. 2x लोड हो रहा है बफर तैयार: ९५% (vol/formamide, 20 mM EDTA और 1% (wt/vol) ऑरेंज जी-20 डिग्री सेल्सियस पर रिएजेंट स्टोर ।

2. हेला कोशिकाओं की तैयारी

नोट: mitotic चरण में सिंक्रनाइज़ किए गए हेला कक्षों को तैयार करें (हेर) या एसिंक्रोनस रूप से विभाजित (unlauncheded) । संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 की उपस्थिति में कोशिकाओं ।

  1. बँटवारा में हेला कोशिकाओं का तुल्यकालन
    1. प्लेट 1 x 10 DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ हेला कोशिकाओं के6 10% के साथ पूरक (vol/FBS एक 10 सेमी संस्कृति पकवान में ।
    2. दो दिन चढ़ाना के बाद, २.५ mM thymidine और 10% (vol/FBS युक्त DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह । संस्कृति 24 ज के लिए कोशिकाओं ।
    3. कोशिकाओं को तीन बार फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर (पंजाब) के साथ धो लें (-), और संस्कृति DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं 10% (vol/FBS 6 एच के लिए) ।
    4. DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें ०.१ µ जी/एमएल nocodazole और 10% (vol/vol) FBS, और संस्कृति 14 एच के लिए कोशिकाओं ।
    5. धीरे संस्कृति पकवान शेक, और अलग mitotic कोशिकाओं युक्त supernatant पुनः प्राप्त । आईपी-RdRP परख के लिए सेल संख्या गिनती ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४९० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
      नोट: सेल गोली-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. अनहेर हेला कोशिकाओं की तैयारी
    1. प्लेट 1 x 10 DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ हेला कोशिकाओं के6 10% के साथ पूरक (vol/FBS एक 10 सेमी संस्कृति पकवान में ।
    2. चढ़ाना के बाद दो दिन, 10% से युक्त DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह (vol/FBS । संस्कृति 30 एच के लिए कोशिकाओं ।
    3. ०.००२% (vol/vol) DMSO और 10% (vol/vol) FBS, और संस्कृति 14 ज के लिए कोशिकाओं से युक्त DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें ।
    4. 1 मिमी EDTA युक्त trypsin (२.५ जी/एल) के ०.७ मिलीलीटर का उपयोग करके trypsinization कोशिकाओं को इकट्ठा । आईपी-RdRP परख के लिए सेल संख्या गिनती ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४९० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
      नोट: सेल गोली-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

3. आईपी-RdRP परख

  1. प्रोटीन ए-agarose मनका तयारी
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर (बिस्तर मात्रा ५०० µ एल) अपनत्व राल का स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
    2. Lysis बफर एक के ८०० µ एल जोड़ें मोतियों को, और कई बार ट्यूब पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । इस चरण को दो बार दोहराएं (कुल तीन बहाकर) ।
    3. जोड़ें ८०० µ एल के Lysis बफर एक मोतियों को, ट्यूब को कई बार पलटने से अच्छी तरह मिक्स कर लीजिये. एक रोटरी शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूब (या कम 4 घंटे के लिए) घुमाएं ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ८०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
    5. Lysis बफर एक के ५०० µ एल जोड़ें मोतियों को, और कई बार ट्यूब पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों की दुकान ।
  2. सेल lysate की तैयारी
    1. वैकल्पिक यदि कोशिकाओं के चरण 2, जगह में जमे हुए है और बर्फ पर जमे हुए कोशिकाओं गल जब तक कोशिकाओं ढीला हो जाते हैं ।
    2. पंजाब के 10 मिलीलीटर (-) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,४५० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
    3. लाइसे के साथ कोशिकाओं को आइस-कोल्ड Lysis बफर एक (1 मिलीलीटर की Lysis बफर एक प्रति 1 x 107 कोशिकाओं के) कोमल pipetting द्वारा ।
    4. Sonicate एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में नमूना निम्नलिखित शर्तों के साथ; 25% पर sonicator के प्रवर्धन सेट, और 10 एस के लिए sonicate ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २०,४०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    6. supernatant लीजिए. 1 मिलीलीटर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में supernatant के प्रत्येक हस्तांतरण ।
      चेतावनी: RNase-मुक्त शर्तों के तहत सभी कार्यविधियों को निष्पादित करें ।
  3. Immunoprecipitation
    1. ४० µ l (मनका volume 20 µ l) के agarose के 1 मिलीलीटर प्रति-lysate मोतियों को जोड़कर स्टेप 3.2.6 से lysate को पहले से साफ़ करें । ट्यूब को कई बार पलटने से अच्छी तरह मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना घुमाएं ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १३,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant की वसूली ।
    3. इसमें ४० µ l (बिस्तर की मात्रा 20 µ l) को धोया प्रोटीन ए-agarose मोतियों का और 10 µ जी का एंटी-ह्यूमन TERT एंटीबॉडी (क्लोन: 10E9-2)8 में पूर्व में साफ lysate । ट्यूब को कई बार पलटने से अच्छी तरह मिलाएं और रात को 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना घुमाएं ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें ।
    5. धो के साथ मोती धो बफर 1:1 मिलीलीटर धोने बफर 1 मोतियों की जोड़ें, ट्यूब औंधा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना घुमाएँ । 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें । इस चरण को तीन अतिरिक्त बार दोहराएं ।
    6. 2 मिमी CaCl2से युक्त AGC समाधान के साथ एक बार मोती धो लें: AGC 2 मिमी CaCl2 मोतियों से युक्त समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, ट्यूब पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूने को घुमाएगी । 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें ।
    7. Micrococcal nuclease (MNase) के साथ मोतियों का उपचार: 1 तालिकामें वर्णित MNase प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । कोमल pipetting द्वारा MNase प्रतिक्रिया मिश्रण के ६० µ एल में मोतियों को फिर से सस्पेंड । 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक Peltier-type मशीन में सेट एक शेखर के एक प्लेअर पर धीरे से नमूना (20 से 25 rpm) हिला ।
      नोट: यह एक लहरदार शेखर का उपयोग करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और कड़ाई से इस कदम में गति सीमा का पालन करें । अन्य प्रकार के शेखर, जैसे मिक्सर घूर्णन, अनुशंसित नहीं हैं ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें ।
    9. 3 मिमी EGTA युक्त AGC समाधान के साथ दो बार मोतियों को धोएं: मोतियों को 3 मिमी EGTA युक्त AGC समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें, ट्यूब को पलटने से अच्छी तरह मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना घुमाएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
    10. धोने बफर 2 के साथ एक बार मोती धो लें: मोती के लिए 2धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, ट्यूब पलटना द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना घुमाएँ । 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५ मिनट के लिए ३,३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और supernatant निकालें । RdRP प्रतिक्रिया की स्थापना करते हुए बर्फ पर मोती रखें ।
      चेतावनी: RNase-मुक्त शर्तों के तहत सभी कार्यविधियों को निष्पादित करें ।
  4. RdRP प्रतिक्रिया
    1. तालिका 2में वर्णित के रूप में एक नई ट्यूब में एक RdRP प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें ।
    2. जोड़ें 6 µ l के [α-३२P] UTP (३,००० Ci/mmol) मिश्रण करने के लिए और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: [α-३२p] एटीपी, [α-३२p] CTP, या [α-३२p] GTP के बजाय प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जा सकता [α-३२p] UTP.
    3. टेंपलेट के 1 µ एल जोड़ें आरएनए (1 µ g/µ l) मिश्रण करने के लिए और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: RdRP परख स्थापित करने के लिए, निम्नलिखित आरएनए टेम्पलेट की सिफारिश की है: 5 '-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3 ' 9.
    4. pipetting द्वारा 3.4.3 कदम से RdRP प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 µ एल के साथ मोती reसस्पेंड ।
    5. ३२ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए एक peltier प्रकार की मशीन में सेट एक शेखर के एक प्लेअर पर धीरे (20 से 25 rpm) नमूना शेक ।
    6. जोड़ें ५.४ µ एल के Proteinase k (20 मिलीग्राम/एमएल) और ४५.४ µ एल 2x Proteinase k बफर की प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए । pipetting और शेक द्वारा मिक्स (20 से 25 rpm) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक Peltier प्रकार की मशीन में सेट प्लेअर पर नमूना ।
    7. नमूना के लिए RNase-मुक्त पानी की १०९.२ µ एल जोड़ें ।
    8. नमूना के लिए एसिड phenol-क्लोरोफॉर्म के २०० µ एल जोड़ें । भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है, और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
    9. 3 एम सोडियम एसीटेट के 20 µ एल जोड़ें (पीएच = ५.२), वर्षा वाहक और २५० µ एल के 4 µ एल जलीय चरण को इथेनॉल के । मिश्रण के लिए अच्छी तरह से ट्यूब शेक, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    10. ठंडा ७०% के ३०० µ एल के साथ गोली धो (vol/) इथेनॉल-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    11. supernatant और हवा सूखी गोली त्यागें ।
      चेतावनी: RNase-मुक्त शर्तों के तहत सभी कार्यविधियों को निष्पादित करें ।
      नोट: चरण 3.4.11 से गोली-20 डिग्री सेल्सियस से कम 2 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. RNase उपचार
    1. RNase-मुक्त पानी के 20 µ एल में कदम 3.4.11 से गोली reसस्पेंड ।
    2. तालिका 3में वर्णित के रूप में एक नई ट्यूब में एक RNase प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें ।
    3. नमूना के लिए RNase प्रतिक्रिया मिश्रण के १८० µ एल जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ट्यूब मशीन ।
    4. जोड़ें २.३ µ 10% की एल (vol/एसडीएस नमूना करने के लिए और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. Proteinase K के 2 µ l जोड़ें (20 मिलीग्राम/एमएल) नमूना और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    6. नमूना के लिए एसिड phenol-क्लोरोफॉर्म के २०५ µ एल जोड़ें । भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है, तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण ।
    7. 3 एम सोडियम एसीटेट के 20 µ एल जोड़ें (पीएच ५.२), वर्षा वाहक के 4 µ एल और जलीय चरण के लिए इथेनॉल के २५० µ एल. मिश्रण के लिए अच्छी तरह से ट्यूब शेक, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    8. ठंडा ७०% के ३०० µ एल के साथ गोली धो (vol/) इथेनॉल-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २१,१०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    9. supernatant और हवा सूखी गोली त्यागें ।
      नोट: चरण 3.5.9 से गोली-20 डिग्री सेल्सियस से कम 2 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. जेल ट्रो और autoradiography
    1. RNase-नि: शुल्क पानी के 20 µ l के साथ नमूना पुनः निलंबित ।
    2. 2x लोड हो रहा है बफर के 20 µ एल जोड़ें ।
    3. ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना उबाल लें । बर्फ पर नमूना क्रश ।
    4. जेल चला । मामले में टेंपलेट का आकार ३४ एनटीएस है (3.4.3 कदम भी देखें), 7 एम यूरिया-10% polyacrylamide जेल denaturing जेल ट्रो के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    5. एक जेल ड्रायर के साथ जेल सूखी ।
    6. -८० ° c पर एक तेज स्क्रीन के साथ एक एक्स-रे कैसेट के भीतर सूखे जेल के लिए फिल्म का पर्दाफाश ।

Representative Results

की सिफारिश की आरएनए टेम्पलेट के साथ, रेडियोधर्मी RdRP उत्पादों mitotic चरण में हेला कोशिकाओं में विशेष रूप से रात भर जोखिम के बाद 20 से 30 न्यूक्लियोटाइड (nt) के बीच मनाया जाता है (आंकड़ा 1a). आम तौर पर, RdRP उत्पादों के संकेत तीव्रता दो चोटियों कि 25 nt और 30 nt के आसपास तैनात उत्पादों के आकार वितरण के साथ पहुंचेगी में प्रदर्शित करता है अगली पीढ़ी sequencing9द्वारा की पुष्टि की । mitotic कोशिकाओं के विपरीत, तुल्यकालन के बिना हेला कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है लगभग 20 के अभाव-30 nt रेडियोधर्मी उत्पादों । अंडाकार संकेतों, कि सभी नमूनों में 20 nt नीचे रखा जाता है, विशिष्ट बहती हैं ।

मामले में है कि वहां केवल एक ~ 30 mitotic हेला कोशिकाओं में कमजोर संकेत के साथ nt उत्पाद है, यह इंगित करता है कि RdRP प्रतिक्रिया अच्छी तरह से नहीं जाना था । उदाहरण के लिए, यदि MNase उपचार मोटे तौर पर और अनुपयुक्त किया जाता है, mitotic हेला कोशिकाओं में संकेत तीव्रता काफी कम हो जाती है (आंकड़ा 1b) । RdRP प्रतिक्रिया पुराने HMD समाधान के साथ प्रदर्शन भी उत्पादों (चित्रा 1C) कम कर देता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : mitotic हेला कोशिकाओं में अंतर्जात TERT के प्रतिनिधि RdRP उत्पाद. (क) हेला कोशिकाओं में आईपी-RdRP परख के तीन प्रतिनिधि परिणाम nocodazole (हेर) या DMSO (unlauncheded) के साथ इलाज किया । रासायनिक संश्लेषित ३४ nt आरएनए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था । (ख) mitotic हेला कोशिकाओं में आईपी-RdRP परख अनुचित MNase उपचार के साथ प्रदर्शन किया । (ग) mitotic हेला कोशिकाओं में आईपी-RdRP परख या तो ताजा या पुराने HMD समाधान के साथ प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मकों वॉल्यूम
Micrococcal Nuclease, 20 U/µ l 1 µ l
Micrococcal Nuclease बफर, 10x 8 µ l
RNase-मुफ्त पानी ५१ µ l

तालिका 1: MNase रिएक्शन मिक्स घटक.

अभिकर्मकों वॉल्यूम
लोग, ०.०७% (wt vol/ 6 µ l
HMD समाधान 2 µ l
rATP, ८० एमएम ०.५ µ l
rGTP, 8 एमएम 1 µ l
rUTP, ०.४ एमएम 1 µ l
rCTP, 8 एमएम 1 µ l
RNase अवरोधक, ४० U/µ l ०.५ µ l
RNase-मुफ्त पानी 1 µ l

तालिका 2: RdRP प्रतिक्रिया मिश्रण घटक ।

अभिकर्मकों वॉल्यूम
RNase ONE Ribonuclease, 10 U/µ l ०.२ µ l
प्रतिक्रिया बफर, 10x 20 µ l
RNase-मुफ्त पानी १५९.८ µ l

तालिका 3: Ribonuclease प्रतिक्रिया मिश्रण घटक ।

Discussion

आईपी-RdRP परख मानव TERT के RdRP गतिविधि का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका है । TERT प्रोटीन अत्यधिक mitotic हेला कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जिसमें TERT रूपों RdRP परिसर में8,9,10. यह पता चलता है कि mitotic हेला कोशिकाओं RdRP गतिविधि का पता लगाने के लिए एक इष्टतम सामग्री हैं । ऊपर बताए गए प्रोटोकॉल में, mitotic और ग़ैर-सिंक्रनाइज़्ड हेला कक्षों को क्रमशः धनात्मक और ऋणात्मक उदाहरण के रूप में शामिल किया गया है. के रूप में चित्रा 1aमें दिखाया गया है, mitotic हेला कोशिकाओं में अनुशंसित आरएनए टेम्पलेट से RdRP परख उत्पादों 20 से 30 nt के बीच व्यापक रेडियोधर्मी संकेतों को दिखाने. हेला कोशिकाओं के अलावा, हम सेल लाइनों के विभिंन प्रकार के साथ परख प्रदर्शन किया है, और पाया कि संकेत पैटर्न विभिंन प्रकार के सेल में परिवर्तित किया जा सकता है9: कुछ केवल 30 nt के आसपास एक मजबूत संकेत दिखाने के लिए, कुछ हेला कोशिकाओं के साथ एक समान पैटर्न दिखाओ । हम भी आरएनए के साथ परख प्रदर्शन किया है ३४ nt टेंपलेट8, लघु और लंबी (~ ३०० nt) विभिंन दृश्यों के साथ RNAs के अलावा अंय टेंपलेट्स, और सफलतापूर्वक उन टेंपलेट्स से RdRP उत्पादों को प्राप्त यद्यपि वहां कुछ वरीयता हो सकती है । पहले परीक्षण के लिए, तथापि, हम mitotic चरण और ३४ nt आरएनए टेम्पलेट में हेला कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं । RdRPs दोनों एक प्राइमरी में और एक प्राइमरी-स्वतंत्र तरीके से11में, दो असहाय आरएनए उत्पंन कर सकते हैं । हमने बताया है कि TERT मानव RdRP7,9के रूप में इस संपत्ति को बरकरार रखता है; TERT एक आरएनए टेम्पलेट से dsRNA 3 '-foldback संरचना के साथ एक पीठ भड़काना तंत्र7के माध्यम से । ३४ nt आरएनए टेम्पलेट के लिए, TERT9प्राइमर का उपयोग किए बिना पूरक किस्में संश्लेषित । विशेष रूप से एक प्राइमर में संश्लेषित RdRP उत्पादों का पता लगाने के लिए-स्वतंत्र तरीके से, यानी डे नोवो संश्लेषित आरएनए उत्पादों, [α-३२p] NTP के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता [γ-३२P] NTP में RdRP प्रतिक्रिया9.

मोतियों पर TERT प्रतिरक्षा परिसरों के MNase उपचार वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । यदि MNase उपचार भी लंबे समय या गहन मिलाते के साथ प्रदर्शन किया है, RdRP उत्पादों उल्लेखनीय कम हो जाएगा । ऐसी मुसीबत से बचने के लिए, हम दृढ़ता से कड़ाई से प्रोटोकॉल का पालन सावधानी से करने की सलाह देते हैं । HMD समाधान सफलता के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है । यदि आप पाते है कि संकेत बहुत कमजोर हैं, एक नए तैयार एक के लिए HMD समाधान की जगह ।

प्रोटोकॉल के दौरान, एक RNase संदूषण से बचने के लिए बहुत ध्यान रखना चाहिए । Ribonuclease उपचार समर्पित उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । Ribonuclease जोड़ तोड़ के बाद, एक युक्तियां और RNase के साथ ट्यूबों तुरंत त्यागना चाहिए, विशेष समाधान के साथ RNase को खत्म (जैसे RNase चुप), और परिवर्तन पेड़ों ।

TERT न केवल TERC बल्कि अंतर्जात RNAs के कई प्रकार के साथ इंटरैक्ट करता है, और हम7उनमें से भाग की सूचना दी है । आईपी में संशोधन-RdRP परख, जैसे MNase उपचार के बिना RdRP परख, अंतर्जात आरएनए की पूरी सूची प्रदान करेगा TERT-संबद्ध RdRP गतिविधि और उनके अनुक्रम सुविधाओं पर bioinformatic गाइड के लिए टेंपलेट्स । हमने इस प्रोटोकॉल को टिशू lysate में सफलतापूर्वक लागू किया है । क्योंकि TERT सामांय और ट्यूमर के ऊतकों की एक किस्म में व्यक्त की है, इस परख के लिए गैर मानव में TERT के विहित एंजाइमी समारोह की जांच उपयोगी हो सकती है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के हिस्से में कैंसर चिकित्सकीय (पी-प्रत्यक्ष) (15cm0106102h0002,. एम.) और कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए परियोजना (पी बनाने) (16cm01061150001,. एम.) पर जापान की एजेंसी से अभिनव अनुसंधान के विकास के लिए प्रोजेक्ट द्वारा समर्थित किया गया चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए, एमएड; टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन (Y.M.); राजकुमारी Takamatsu कैंसर रिसर्च फंड (13-24520, Y.M.) का अनुदान; और JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP16K07133 (Y.M.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Wako 044-29765
Fetal bovine serum (FBS) CORNING 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin mixed solution nacalai tesque 26253-84
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution nacalai tesque 32777-44
Phosphate buffered saline (PBS(-)) Wako 166-23555
Thymidine nacalai tesque 07147-61
Nocodazole Sigma M1404
Dimethyl sulfoxide (DMSO) nacalai tesque 08904-85
Sodium chloride nacalai tesque 31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane nacalai tesque 35434-21
Hydrochloric acid nacalai tesque 18321-05
Nonidet P-40 (NP-40) nacalai tesque 25223-04
Pierce Protein A Plus Agarose Thermo scientific 22812
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) nacalai tesque 17514-15
Potassium hydroxide Wako 168-21815
Potassium acetate nacalai tesque 28405-05
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) Wako 135-00165
Glycerol nacalai tesque 17045-65
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) Wako 169-21105
cOmplete, EDTA-free Roche Applied Science 11 873 580 001
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) nacalai tesque 06731-05
Micrococcal nuclease (MNase) Takara Bio 2910A
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) nacalai tesque 15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) nacalai tesque 07957-64
Dithiothreitol (DTT) nacalai tesque 14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each Promega E6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) PerkinElmer NEG507H Use fresh RI for the assay
RNase inhibitor TOYOBO SIN-201
Proteinase K Takara 9033
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Life Technologies AM9720
3 M Sodium acetate NIPPON GENE 316-90081
Ethanol (99.5) nacalai tesque 14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara Bio 9094
RNase One Ribonuclease Promega M4265
Sodium dodecyl sulfate (SDS) nacalai tesque 02873-75
Formamide, deionized nacalai tesque 16345-65
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) nacalai tesque 15130-95
Orange G nacalai tesque 25401-22
CO2 incubator e.g., ASTEC SCA-325DRS
Centrifuge e.g., TOMY EX-135 For step B)
Micro refrigerated centrifuge e.g., KUBOTA 3740 For step 6.2
Sonicator Qsonica Q125 Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4
Micro refrigerated centrifuge e.g., TOMY MX-305 For step 6.5
Cooled incubator e.g., Panasonic MIR-154-PJ Set a rotary shaker inside
Rotary shaker e.g., TAITEC RT-5
Cooled incubator  e.g., TAITEC BR-43FL Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7
MINI WAVE AS ONE WEV-03 A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6
Incubator e.g., TAITEC HB-80 Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6
Block incubator e.g., ASTEC BI-516S

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References

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  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
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आनुवंशिकी अंक १३६ TERT आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ डबल-कतरा आरएनए टेलोमिरेज immunoprecipitation रेडियो आइसोटोप
मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना
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Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti, M., Ando, Y., Masutomi, K. Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein. J. Vis. Exp. (136), e57021, doi:10.3791/57021 (2018).

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