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Genetics

Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57021
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

La transcriptase inverse de la télomérase humaine (TERT) synthétise non seulement l’ADN télomérique, mais aussi l’ARN bicaténaire par l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante. Nous décrivons ici un essai nouvellement créé pour détecter l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante du TERT endogène.

Abstract

La transcriptase inverse de la télomérase humaine (TERT) est la sous-unité catalytique de la télomérase, et elle s’allonge les télomères à travers l’activité de l’ADN polymérase ARN-dépendante. Bien que TERT est appelé comme une transcriptase inverse, analyses structurales et phylogénétiques de TERT démontrent que TERT est membre des polymérases droitiers et concerne viral RNA-dependent RNA polymérase (RdRPs) ainsi que de la transcriptase inverse virale. Tout d’abord, nous avons identifié RdRP activité de TERT humaine qui génère RNA complémentaire se tenir à un modèle non codantes RNA et contribue à la RNA silencing dans les cellules cancéreuses. Pour analyser cette activité enzymatique non canonique, nous développé des tests de RdRP avec TERT recombinante en 2009, établi par la suite essai in vitro RdRP avec de TERT endogène. Dans ce manuscrit, nous décrivons la dernière méthode. Brièvement, complexes immuns TERT sont isolés des cellules et incubés avec template RNA et RN y compris rNTP radioactif pour la réaction de la RdRP. Pour éliminer les ARN simple brin, produits de réaction sont traités avec de la RNase I et les produits finaux sommes analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Radiomarquées RdRP produits peuvent être détectées par autoradiographie après exposition pendant la nuit.

Introduction

La transcriptase inverse de la télomérase humaine (TERT) est connue comme la sous-unité catalytique de la télomérase, et elle s’allonge les télomères, télomérase RNA composant (TERC), l’ARN spécifique modèle1. Bien que TERT polymérise ADN télomérique comme une composante de la télomérase, les analyses structurelles et phylogénétiques indiquent que TERT est étroitement lié avec viral RNA-dependent RNA polymérase (RdRPs) ainsi que de la transcriptase inverse virale et partage des domaines avec Ces polymérases2,3,4. RdRP est l’enzyme qui génère le brin d’ARN complémentaire à un modèle de RNA. L’enzyme est codé non seulement chez les virus, mais aussi dans les organismes modèles, tels que les plantes, les levures et les vis sans fin, et synthèse de l’ARN double brin par RdRP contribue au transcriptional et post-transcriptional gene silencing dans ces organismes5,6 . Bien que les principes RdRP humaine avait disparu depuis longtemps, nous avons trouvé RdRP activité humaine TERT en 20097.

Tout d’abord, nous a confirmé une activité de TERT RdRP protéine recombinante7, puis mis en place un essai sensibles in vitro pour détecter toute activité endogène TERT8RdRP. Ici, nous démontrons l’essai in vitro RdRP avec (IP-RdRP assay) de TERT endogène. Cette méthode commence par immunoprécipitation (IP) de TERT endogène et est suivie d’une réaction in vitro RdRP, dans lequel ribonucléotides radioactifs sont incorporés dans des brins de RNA naissants.

Protocol

1. réactif Setup

  1. Réactifs utilisés pour la synchronisation de la cellule
    1. Pour générer le médium de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant la thymidine 2,5 mM, dissoudre 30,28 mg de la thymidine par 1 mL de culture tissulaire eau de qualité pour préparer la thymidine 125 mM. Filtrer la solution avec une unité de filtre de seringue μm 0,22. Ajouter 1 mL de la thymidine fraîchement préparé 125 mM / 50 mL de DMEM additionné de 10 % (vol/vol) sérum fœtal (SVF).
    2. Pour générer DMEM contenant 0,1 μg/mL de la nocodazole, dissoudre la nocodazole dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer 5 μg/μL nocodazole. Ajouter 1 µL de 5 µg / la nocodazole µL / 50 mL de DMEM supplémenté de 10 % (vol/vol) FBS.
    3. Pour générer DMEM contenant 0,002 % (vol/vol) de DMSO, ajouter 1 µL de DMSO pour 50 mL de DMEM supplémenté de 10 % (vol/vol) FBS.
  2. Réactifs utilisés pour l’analyse de la propriété intellectuelle-RdRP
    1. Préparer la lyse tampon A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) et 0,5 % (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Conserver le réactif à 4 ° C.
    2. Préparer 5 x tampon d’acétate : acide 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 50 mM (HEPES)-KOH (pH 7,8), acétate de potassium 500 mM et 20 mM MgCl2. Conserver le réactif à la température ambiante.
    3. Préparer le tampon acétate de lavage tampon x 1 : 1, 10 % (vol/vol) de glycérol, 0,1 % (vol/vol) Triton X-100 et 0,06 x inhibiteur de protéase cocktail, acide ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuit. Préparer le tampon de lavage 1 le jour de l’utilisation ou le jour avant l’utilisation. Conserver le réactif à 4 ° C.
    4. Préparer la solution de l’AGC : 1 tampon d’acétate, de glycérol à 10 % (vol/vol) et de 0,02 % (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Conserver le réactif à 4 ° C.
    5. Pour générer la solution AGC contenant 2 mM CaCl2, ajouter 100 µL de 1 M CaCl2 / 50 mL de solution de l’AGC. Conserver le réactif à 4 ° C.
    6. Pour générer la solution AGC contenant bis de l’éthylène glycol de 3 mM (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tétraacétique (EGTA), ajouter 375 µL de 0,4 M EGTA (pH 7.5) pour 50 mL de solution de l’AGC. Conserver le réactif à 4 ° C.
    7. Préparer le tampon acétate de lavage tampon x 2 : 1 et CHAPS de 0,02 % (wt/vol). Conserver le réactif à 4 ° C.
    8. Préparer la solution HMD : 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 et 2 mM le dithiothréitol (DTT). Conserver le réactif à-20 ° C.
      NOTE : Solution HMD devrait être renouvelée au moins trois mois.
    9. Préparer 2 x tampon de protéinase K : 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), EDTA de 20 mM et 1 % (wt/vol) dodécylsulfate de sodium (SDS). Conserver le réactif à-20 ° C.
    10. Préparer 2 x chargement tampon : 95 % (vol/vol) formamide, EDTA de 20 mM et 1 % (wt/vol) Orange G. conserver le réactif à-20 ° C.

2. préparation des cellules HeLa

NOTE : Préparer les cellules HeLa synchronisée phase mitotique (manipulé) ou de façon asynchrone de séparation (superficie). La culture des cellules en présence de 5 % de CO2 à 37 ° C.

  1. Synchronisation des cellules HeLa lors de la mitose
    1. Plaque 1 x 106 cellules HeLa avec 10 mL de DMEM supplémenté de 10 % (vol/vol) FBS dans une boîte de Petri de 10 cm.
    2. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support avec 10 mL de DMEM contenant 2,5 mM thymidine et 10 % (vol/vol) FBS. La culture des cellules pendant 24 h.
    3. Laver les cellules trois fois avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (-) et la culture des cellules avec 10 mL de DMEM contenant 10 % (vol/vol) : FBS pendant 6 h.
    4. Remplacer le support avec 10 mL de DMEM contenant 0,1 µg/mL de la nocodazole et 10 % (vol/vol) FBS et la culture des cellules pour 14 h.
    5. Secouez la boîte de Pétri et récupérer le surnageant contenant les cellules mitotiques détachés. Compter le nombre de cellules pour le dosage de la propriété intellectuelle-RdRP.
    6. Centrifuger l’échantillon à 490 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
      Remarque : Le culot cellulaire peut être stocké à-80 ° C.
  2. Préparation des non manipulés cellules HeLa
    1. Plaque 1 x 106 cellules HeLa avec 10 mL de DMEM supplémenté de 10 % (vol/vol) FBS dans une boîte de Petri de 10 cm.
    2. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support avec 10 mL de DMEM contenant 10 % (vol/vol) FBS. La culture des cellules pendant 30 h.
    3. Remplacer le support avec 10 mL de DMEM contenant 0,002 % (vol/vol) DMSO et 10 % (vol/vol) FBS et la culture des cellules pour 14 h.
    4. Recueillir les cellules par trypsinisation aide 0,7 mL de trypsine (2,5 g/L) contenant 1 mM EDTA. Compter le nombre de cellules pour le dosage de la propriété intellectuelle-RdRP.
    5. Centrifuger l’échantillon à 490 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
      Remarque : Le culot cellulaire peut être stocké à-80 ° C.

3. propriété intellectuelle-RdRP Assay

  1. Préparation de protéine A-agarose perles
    1. Transférer 1 mL (lit volume 500 µL) de résine dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Centrifuger à 800 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    2. Ajouter 800 µL de tampons de lyse A aux talons et bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Centrifuger à 800 g pendant 3 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez cette opération deux fois (totales trois lavages).
    3. Ajouter 800 µL de tampons de lyse A aux talons, bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Tourner le tube du jour au lendemain (ou pendant au moins 4 h) à 4 ° C dans un agitateur rotatif.
    4. Centrifuger le tube à 800 g pendant 3 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    5. Ajouter 500 µL de tampons de lyse A aux talons et bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Stocker les perles à 4 ° C.
  2. Préparation du lysat cellulaire
    1. (Facultatif) Si les cellules sont figés à l’étape 2, placer et décongeler les cellules congelées sur la glace jusqu'à ce que les cellules sont desserrent.
    2. Laver les cellules une fois avec 10 mL de PBS (-). Centrifuger l’échantillon à 1 450 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    3. Lyse des cellules avec le tampon de lyse glacée (un 1 mL de tampons de lyse A par 1 x 107 des cellules) de pipetage doux.
    4. Laisser agir l’échantillon dans un tube de 1,5 mL avec les conditions suivantes : amplification de la sonicateur a fixé à 25 % et laisser agir pendant 10 s.
    5. Centrifuger l’échantillon à 20 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    6. Recueillir le liquide surnageant. Transférer 1 mL du surnageant dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
      ATTENTION : Effectuez toutes les procédures dans des conditions sans RNase.
  3. Immunoprécipitation
    1. Avance le lysat de l’étape 3.2.6 en ajoutant 40 µL (perle volume 20 µL) de perles A-agarose prélavée protéines par 1 mL du lysate. Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois et faire tourner l’échantillon pendant 30 min à 4 ° C.
    2. Centrifuger l’échantillon à 13 000 x g pendant 1 min à 4 ° C et de récupérer le surnageant.
    3. Ajouter 40 µL (lit volume 20 µL) de perles prélavée protéine A-agarose et 10 µg d’anticorps TERT anti-humain (clone : 10E9-2)8 dans le préapprouvés lysat. Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois et faire tourner l’échantillon à 4 ° C pendant la nuit.
    4. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    5. Laver les billes avec tampon de lavage 1 : ajouter 1 mL de tampon de lavage 1 aux talons, bien mélanger en renversant le tube et tournez l’échantillon pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez cette opération trois fois.
    6. Laver les billes une fois avec une solution contenant 2 mM CaCl2AGC : ajouter 1 mL de solution d’AGC contenant 2 mM CaCl2 aux talons, bien mélanger en renversant le tube et tournez l’échantillon pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    7. Traiter les perles avec une nucléase micrococcique (MNase) : préparer le mélange réactionnel MNase décrit au tableau 1. Remettre en suspension les perles dans 60 µL du mélange réactionnel MNase en pipettant également, doux. Agiter l’échantillon doucement (20 à 25 tr/min) sur un plateau tournant d’un shaker, mettre dans un incubateur de type Peltier pendant 15 min à 25 ° C.
      Remarque : Il est très important d’utiliser un shaker vallonné et de suivre strictement la limite de vitesse dans cette étape. Autre type de poivrières, tels que mélangeurs rotatifs, ne sont pas recommandés.
    8. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    9. Laver les perles deux fois avec la solution AGC contenant 3 mM EGTA : ajouter 1 mL de solution d’AGC contenant 3 mM EGTA aux talons, bien mélanger en renversant le tube et tournez l’échantillon pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez cette opération une fois.
    10. Laver les billes une fois avec le tampon de lavage 2 : ajouter 1 mL de tampon de lavage 2aux talons, bien mélanger en renversant le tube et tournez l’échantillon pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l’échantillon à 3 300 x g pendant 0,5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Garder les perles sur la glace tout en établissant des principes RdRP réaction.
      ATTENTION : Effectuez toutes les procédures dans des conditions sans RNase.
  4. Réaction de RdRP
    1. Préparer un mélange réactionnel de RdRP dans un nouveau tube tel que décrit dans le tableau 2.
    2. Ajouter 6 µL de [α -32P] UTP (3 000 Ci/mmol) au mélange et mélanger bien en pipettant également.
      NOTE : [α -32P] ATP, [α -32P] CTP ou GTP [α -32P] peut être utilisé pour la réaction au lieu de [α -32P] UTP.
    3. Ajouter 1 µL de modèle RNA (1 µg/µL) au mélange et mélanger bien en pipettant également.
      Remarque : Pour établir le dosage des principes RdRP, le modèle de RNA suivant est recommandé : 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.
    4. Remettre en suspension les perles avec 20 µL du mélange réactionnel RdRP étape 3.4.3 de pipetage.
    5. Agiter l’échantillon doucement (20 à 25 tr/min) sur un plateau tournant d’un shaker, mettre dans un incubateur de type peltier pendant 2 h à 32 ° C.
    6. Ajouter 5,4 µL de protéinase K (20 mg/mL) et 45.4 µL de tampon de protéinase K 2 x au mélange réactionnel. La composition de pipetage et secouer (20 à 25 tr/min) de l’échantillon sur une platine mises dans un incubateur de type Peltier pendant 30 min à 37 ° C.
    7. Ajouter 109.2 µL d’eau exempte de RNase dans l’échantillon.
    8. Ajouter 200 µL d’acide phénol-chloroforme à l’échantillon. Bien mélanger en vortex et puis centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Répétez cette opération une fois.
    9. Ajouter 20 µL d’acétate de sodium 3M (pH = 5,2), 4 µL du transporteur de précipitations et 250 µL d’éthanol à la phase aqueuse. Agiter le tube bien pour mélanger, puis centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    10. Laver le culot avec 300 µL d’éthanol froid (vol/vol) à 70 %, conservé à-20 ° C. Centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    11. Jeter le surnageant et le culot sécher à l’air.
      ATTENTION : Effectuez toutes les procédures dans des conditions sans RNase.
      Remarque : Le culot de l’étape 3.4.11 peut être stocké à-20 ° C pendant au moins 2 jours.
  5. Traitement de la RNase
    1. Resuspendre le culot d’étape 3.4.11 dans 20 µL d’eau exempte de RNase.
    2. Préparer un mélange réactionnel de RNase dans un nouveau tube tel que décrit dans le tableau 3.
    3. Ajouter 180 µL du mélange réactionnel RNase dans l’échantillon et incuber le tube pendant 2 h à 37 ° C.
    4. Ajouter 2,3 µL du SDS de 10 % (vol/vol) dans l’échantillon et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    5. Ajouter 2 µL de protéinase K (20 mg/mL) dans l’échantillon et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    6. Ajouter 205 µL d’acide phénol-chloroforme dans l’échantillon. Mélangez bien en vortex, puis centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
    7. Ajouter 20 µL d’acétate de sodium 3M (pH 5,2), 4 µL du transporteur de précipitations et 250 µL d’éthanol à la phase aqueuse. Agiter le tube bien pour mélanger, puis centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    8. Laver le culot avec 300 µL d’éthanol froid (vol/vol) à 70 %, conservé à-20 ° C. Centrifuger l’échantillon à 21 100 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    9. Jeter le surnageant et le culot sécher à l’air.
      Remarque : Le culot de l’étape 3.5.9 peut être stocké à-20 ° C pendant au moins 2 jours.
  6. Autoradiographie et électrophorèse sur gel
    1. Remettre en suspension l’échantillon avec 20 µL d’eau exempte de RNase.
    2. Ajouter 20 µL de 2 x tampon de chargement.
    3. Faire bouillir l’échantillon pendant 10 min à 95 ° C. Broyer l’échantillon sur la glace.
    4. Exécutez le gel. Dans le cas où la taille du modèle est 34 nts (voir aussi l’étape 3.4.3), 7 M urée - 10 % gel de polyacrylamide est utilisé pour l’électrophorèse sur gel dénaturant.
    5. Sécher le gel avec un gel sèche.
    6. Exposer le film au sec-gel dans une cassette de rayons x avec un écran renforçateur à-80 ° C.

Representative Results

Avec le descripteur d’ARN recommandée, produits radioactifs de RdRP sont observées entre 20 à 30 nucléotides (nt) plus précisément dans les cellules HeLa en phase mitotique après exposition au jour le jour (Figure 1 a). En général, intensité du signal des produits RdRP montre deux pics qui sont positionnés à environ 25 nt et 30 nt en harmonie avec la distribution des produits confirmés par prochaine génération séquençage9. Contrairement aux cellules mitotiques, cellules HeLa sans synchronisation montrent presque absence des produits radioactifs nt 20 – 30. Les signaux ovales, qui sont placés en dessous de 20 nt dans tous les échantillons, sont les dérives non spécifiques.

Dans le cas où c’est là qu’un produit nt ~ 30 avec un signal faible dans les cellules HeLa mitotiques, il indique que la réaction de RdRP n’allait pas bien. Par exemple, si le traitement MNase est effectué à peu près et de façon inappropriée, l’intensité du signal en HeLa mitotique cellules diminue significativement (Figure 1 b). RdRP réaction effectuée avec la vieille solution HMD réduit également les produits (Figure 1).

Figure 1
Figure 1 : Produits de RdRP représentant de TERT endogène dans les cellules HeLa mitotiques. (A) trois résultats représentatifs du test IP-RdRP dans les cellules HeLa traitement avec la nocodazole (manipulé) ou le DMSO (superficie). La synthèse chimique 34 nt RNA a été utilisé comme modèle. (B) IP-RdRP dosage dans les cellules HeLa mitotiques réalisée avec traitement MNase inadéquat. Dosage de IP-RdRP (C) dans les cellules HeLa mitotiques effectué avec une solution douce ou vieux HMD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactifs Volume
Nucléase micrococcique, 20 U/µL 1 ΜL
La nucléase micrococcique tampon, x 10 8 ΜL
Eau exempte de RNase 51 ΜL

Tableau 1 : MNase composant de mélange réaction.

Réactifs Volume
CHAPS, 0,07 % (wt/vol) 6 ΜL
Solution HMD 2 ΜL
rATP, 80 mM 0,5 ΜL
rGTP, 8 mM 1 ΜL
RU, 0,4 mM 1 ΜL
rCTP, 8 mM 1 ΜL
Inhibiteur de RNase, 40 U/µL 0,5 ΜL
Eau exempte de RNase 1 ΜL

Tableau 2 : RdRP composant de mélange réaction.

Réactifs Volume
RNase une ribonucléase, 10 U/µL 0.2 ΜL
Tampon de réaction, x 10 20 ΜL
Eau exempte de RNase 159,8 ΜL

Tableau 3 : Ribonucléase réaction mix component.

Discussion

L’essai de IP-RdRP est une méthode sensible pour détecter les activités de la RdRP de TERT humaine. Protéine TERT est fortement exprimée dans les cellules HeLa mitotiques, dans lesquels TERT fait le RdRP complexe8,9,10. Ceci suggère que les cellules HeLa mitotiques constituent un matériau optimal pour détecter les activités de la RdRP. Dans le protocole décrit ci-dessus, les cellules HeLa mitotiques et non synchronisées sont inclus comme un positif et un exemple négatif, respectivement. Comme le montre la Figure 1 a, les produits dosage RdRP depuis le descripteur recommandée d’ARN dans les cellules HeLa mitotiques présenter signal radioactif large entre 20 à 30 nt. Outre les cellules HeLa, nous avons effectué le test avec différents types de lignées cellulaires et constaté que le profil des signaux peut être changé en cellule différentes types9: certains montrent un signal fort qu’environ 30 nt, certains montrent une tendance similaire avec les cellules HeLa. Nous ont également effectué le test avec des modèles de RNA l’exception de la nt 34 modèle8, bref et long (~ 300 nt) RNAs avec différentes séquences et obtenu avec succès RdRP produits parmi ces modèles, bien qu’il y a peut-être une certaine préférence. Pour le premier essai, cependant, nous recommandons d’utiliser des cellules HeLa en phase mitotique et le modèle nt RNA 34. RdRPs peut générer l’ARN bicaténaire dans une amorce-dépendante et dans une façon indépendante de l’apprêt11. Nous avons signalé que le TERT conserve cette propriété comme humain RdRP7,9; TERT synthétise dsRNA d’un descripteur d’ARN avec 3'-foldback structure grâce à un mécanisme de retour d’amorçage /7. Pour le modèle nt RNA 34, TERT synthétise les brins complémentaires sans utiliser des amorces9. Pour détecter spécifiquement RdRP produits synthétisés dans une façon indépendante de l’amorce, c'est-à-dire de novo synthétisé RNA produits, [α -32P] NTP peut être remplacé par [γ -32P] NTP dans la réaction de la RdRP9.

MNase traitement des complexes immuns TERT sur perles est une étape essentielle pour atteindre les résultats souhaités. Si le traitement MNase est effectué trop longtemps ou avec une agitation intense, les produits de RdRP seraient réduits remarquablement. Pour éviter un tel problème, nous vous recommandons de suivre strictement le protocole soigneusement. Solution HMD est un autre facteur critique de succès. Si vous trouvez que les signaux sont très faibles, remplacer la solution HMD à un nouveau prêt.

Dans tout le protocole, il faut prendre grand soin d’éviter toute contamination de la RNase. Traitement de la ribonucléase doit être effectué avec des équipements dédiés. Après manipulation de la ribonucléase, on devrait jeter les bouts et tubes avec de la RNase immédiatement, éliminer la RNase avec solution spécialisée (par exemple le calme RNase) et changent les bosquets.

TERT interagit avec non seulement TERC , mais également de nombreux types d’ARN endogènes, et nous l’avons signalé partie d'entre eux7. Modification dans l’essai de IP-RdRP, tels que l’essai de IP-RdRP sans traitement MNase, fournira une liste complète des modèles de RNA endogènes pour guide d’activité et bioinformatiques RdRP TERT-associés sur leurs caractéristiques de séquence. Nous avons appliqué avec succès ce protocole au tissu lysat. TERT s’exprime dans une variété de tissus normales et tumorales, ce test peut être utile d’examiner la fonction enzymatique non canonique de TERT chez l’homme.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par le projet pour le développement de la recherche novatrice sur la thérapeutique anticancéreuse (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) et le projet pour la recherche sur le Cancer et l’évolution thérapeutique (P-créer) (16cm 01061150001, K.M.) de l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement, AMED ; le FNS Takeda (Y.M.) ; Subvention de la Princesse Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.) ; et JSPS KAKENHI numéro de licence JP16K07133 (y).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Wako 044-29765
Fetal bovine serum (FBS) CORNING 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin mixed solution nacalai tesque 26253-84
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution nacalai tesque 32777-44
Phosphate buffered saline (PBS(-)) Wako 166-23555
Thymidine nacalai tesque 07147-61
Nocodazole Sigma M1404
Dimethyl sulfoxide (DMSO) nacalai tesque 08904-85
Sodium chloride nacalai tesque 31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane nacalai tesque 35434-21
Hydrochloric acid nacalai tesque 18321-05
Nonidet P-40 (NP-40) nacalai tesque 25223-04
Pierce Protein A Plus Agarose Thermo scientific 22812
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) nacalai tesque 17514-15
Potassium hydroxide Wako 168-21815
Potassium acetate nacalai tesque 28405-05
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) Wako 135-00165
Glycerol nacalai tesque 17045-65
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) Wako 169-21105
cOmplete, EDTA-free Roche Applied Science 11 873 580 001
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) nacalai tesque 06731-05
Micrococcal nuclease (MNase) Takara Bio 2910A
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) nacalai tesque 15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) nacalai tesque 07957-64
Dithiothreitol (DTT) nacalai tesque 14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each Promega E6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) PerkinElmer NEG507H Use fresh RI for the assay
RNase inhibitor TOYOBO SIN-201
Proteinase K Takara 9033
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Life Technologies AM9720
3 M Sodium acetate NIPPON GENE 316-90081
Ethanol (99.5) nacalai tesque 14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara Bio 9094
RNase One Ribonuclease Promega M4265
Sodium dodecyl sulfate (SDS) nacalai tesque 02873-75
Formamide, deionized nacalai tesque 16345-65
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) nacalai tesque 15130-95
Orange G nacalai tesque 25401-22
CO2 incubator e.g., ASTEC SCA-325DRS
Centrifuge e.g., TOMY EX-135 For step B)
Micro refrigerated centrifuge e.g., KUBOTA 3740 For step 6.2
Sonicator Qsonica Q125 Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4
Micro refrigerated centrifuge e.g., TOMY MX-305 For step 6.5
Cooled incubator e.g., Panasonic MIR-154-PJ Set a rotary shaker inside
Rotary shaker e.g., TAITEC RT-5
Cooled incubator  e.g., TAITEC BR-43FL Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7
MINI WAVE AS ONE WEV-03 A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6
Incubator e.g., TAITEC HB-80 Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6
Block incubator e.g., ASTEC BI-516S

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References

  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

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Génétique numéro 136 TERT l’ARN polymérase ARN-dépendante l’ARN bicaténaire télomérase immunoprécipitation radio-isotopes
Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine
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Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti, M., Ando, Y., Masutomi, K. Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein. J. Vis. Exp. (136), e57021, doi:10.3791/57021 (2018).

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