Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57021
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) synthetiseert niet alleen Telomere DNA, maar ook double-stranded RNA door RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte assay voor het detecteren van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van endogene TERT.

Abstract

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) is de katalytische subeenheid van telomerase, en het kieuwopeningenvorm telomeer door RNA-afhankelijke DNA-polymeraseactiviteit. Hoewel TERT wordt genoemd als een reverse-transcriptase, aantonen structurele en fylogenetische analyses van TERT dat TERT deel van rechtshandige polymerase uitmaakt, en heeft betrekking op virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRPs) evenals virale reverse-transcriptase. We allereerst geconstateerd dat RdRP activiteit van menselijke TERT dat complementaire RNA genereert staan aan een sjabloon niet-coderende RNA en draagt bij aan RNA silencing in kankercellen. Voor het analyseren van deze niet-canonieke enzymatische activiteit, we RdRP assay met recombinant TERT ontwikkeld in 2009, daarna gevestigd in vitro RdRP assay voor endogene TERT. In dit manuscript beschrijven we de laatste methode. Kort, TERT immuuncomplexen zijn geïsoleerd uit cellen, en geïncubeerd met template RNA en rNTPs met inbegrip van radioactieve rNTP voor RdRP reactie. Om te elimineren single-stranded RNA, worden reactieproducten behandeld met RNase ik, en de eindproducten worden geanalyseerd met polyacrylamide gelelektroforese. Radiolabeled RdRP producten kunnen worden opgespoord met behulp van autoradiografie na nachtelijke blootstelling.

Introduction

Menselijke telomerase reverse-transcriptase (TERT) staat bekend als de katalytische subeenheid van telomerase en het kieuwopeningenvorm telomeer telomerase RNA component (TERC), de specifieke RNA sjabloon1gebruiken. Hoewel TERT polymerizes Telomere DNA als onderdeel van telomerase, blijkt het structurele en fylogenetische analyses dat TERT nauw met de virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRPs), evenals virale reverse-transcriptase verbonden is, en deelt van domeinen met deze polymerase2,3,4. RdRP is het enzym dat aanvullende RNA strand aan een sjabloon RNA genereert. Het enzym wordt gecodeerd, niet alleen in virussen, maar ook in modelorganismen, zoals installaties, gist en worm, en double-stranded RNA-synthese door RdRP draagt bij aan transcriptionele en post-transcriptional gen zwijgen in deze organismen5,6 . Hoewel menselijke RdRP had gemist voor een lange tijd, vonden we RdRP activiteit in menselijke TERT in 20097.

We eerst RdRP activiteit van TERT met recombinant eiwit7bevestigd, dan een gevoelige in vitro assay voor het detecteren van RdRP activiteit van endogene TERT8vastgesteld. Hier tonen we de in vitro RdRP assay (IP-RdRP assay) voor endogene TERT. Deze methode begint met immunoprecipitation (IP) van endogene TERT, en wordt gevolgd door in vitro RdRP reactie, waarop radioactieve ribonucleotides zijn opgenomen in de ontluikende RNA strengen.

Protocol

1. reagens Setup

  1. Reagentia gebruikt voor de synchronisatie van de cel
    1. Los 30.28 mg van thymidine per 1 mL weefselkweek rang water te bereiden 125 mM thymidine wilt genereren Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 2,5 mM thymidine. Het filtraat van de oplossing met een 0,22 μm spuit filter eenheid. Voeg 1 mL vers bereide 125 mM thymidine per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) foetale runderserum (FBS).
    2. Voor het genereren van DMEM met 0,1 μg/mL van nocodazole, los nocodazole in dimethylsulfoxide (DMSO) voor te bereiden 5 μg/l nocodazole. Voeg 1 µL van 5 µg / µL nocodazole per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS.
    3. Voeg 1 µL van DMSO per 50 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS wilt genereren DMEM met 0.002% (vol/vol) van DMSO.
  2. Voor IP-RdRP assay gebruikte reagentia
    1. Bereiden van lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) en 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    2. 5 x acetaat buffer bereiden: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic zuur (HEPES)-KOH (pH 7,8), Kaliumacetaat 500 mM en 20 mM MgCl2. Bewaar het reagens bij kamertemperatuur.
    3. Bereiden was buffer 1: 1 x acetaat buffer, 10% (vol/vol) glycerol, 0,1% (vol/vol) Triton X-100 en 0.06 x proteaseinhibitor cocktail, ethylenediamenetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gratis. Bereiden was buffer 1 op de dag van gebruik of de dag vóór gebruik. Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    4. Bereiden van AGC oplossing: 1 x acetaat buffer, 10% (vol/vol) glycerol en 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    5. Voeg 100 µL van 1 M CaCl2 per 50 mL AGC oplossing voor het genereren van AGC oplossing met 2 mM CaCl2. Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    6. Voor het genereren van AGC oplossing met 3 mM ethyleenglycol-bis (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA), voeg 375 µL van 0,4 M EGTA (pH 7.5) per 50 mL oplossing van AGC. Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    7. Bereiden was buffer 2: 1 x acetaat buffer en 0,02% (wt/vol) KINNEBAKSPEK. Bewaar het reagens bij 4 ° C.
    8. Bereid HMD oplossing: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 en 2 mM dithiothreitol (DTT). Bewaar het reagens bij-20 ° C.
      Opmerking: HMD oplossing moet worden verlengd ten minste drie maanden.
    9. 2 x proteïnase K buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA en 1% (wt/vol) natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bewaar het reagens bij-20 ° C.
    10. Bereiden van 2 x laden buffer: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA en 1% (wt/vol) oranje G. Bewaar het reagens bij-20 ° C.

2. voorbereiding van HeLa cellen

Opmerking: Bereiden HeLa cellen gesynchroniseerde in mitotische fase (gemanipuleerd) of asynchroon verdelen (unmanipulated). Cultuur van de cellen in het bijzijn van 5% CO2 bij 37 ° C.

  1. Synchronisatie van HeLa cellen in de mitose
    1. 1 x 10 bord6 van HeLa cellen met 10 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS in een cultuur van 10 cm schotel.
    2. Twee dagen na de beplating, wordt het medium vervangen door 10 mL DMEM met 2.5 mM thymidine en 10% (vol/vol) FBS. Cultuur van de cellen gedurende 24 uur.
    3. Spoel de cellen drie keer met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (-), en cultuur van de cellen met 10 mL DMEM met 10% (vol/vol) FBS gedurende 6 uur.
    4. Vervang het medium met 10 mL DMEM met 0,1 µg/mL van nocodazole en 10% (vol/vol) FBS, en cultuur van de cellen voor 14u.
    5. Schud de cultuur schotel voorzichtig, en het supernatant met de vrijstaande mitotische cellen op te halen. Het nummer van de cel voor de IP-RdRP assay tellen.
    6. Centrifugeer het monster bij 490 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.
      Opmerking: De pellet cel kan worden opgeslagen bij-80 ° C.
  2. Voorbereiding van unmanipulated HeLa cellen
    1. 1 x 10 bord6 van HeLa cellen met 10 mL DMEM aangevuld met 10% (vol/vol) FBS in een cultuur van 10 cm schotel.
    2. Twee dagen na de beplating, wordt het medium vervangen door 10 mL DMEM met 10% (vol/vol) FBS. Cultuur van de cellen voor 30 h.
    3. Vervang het medium met 10 mL DMEM met 0.002% (vol/vol) DMSO en 10% (vol/vol) FBS, en cultuur van de cellen voor 14u.
    4. De cellen verzamelen door trypsinebehandeling met behulp van 0,7 mL trypsine (2,5 g/L) met 1 mM EDTA. Het nummer van de cel voor de IP-RdRP assay tellen.
    5. Centrifugeer het monster bij 490 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.
      Opmerking: De pellet cel kan worden opgeslagen bij-80 ° C.

3. IP-RdRP Assay

  1. Eiwit A-agarose kraal voorbereiding
    1. Breng 1 mL (bed volume 500 µL) van affiniteit hars een 1,5 mL microcentrifuge buis. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.
    2. 800 µL van Lysis buffer A toevoegen aan de kralen, en meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal (totaal drie wasbeurten).
    3. 800 µL van Lysis buffer A toevoegen aan de kralen, meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Draai de buis 's nachts (of gedurende ten minste 4 uur) bij 4 ° C op een rondschudapparaat.
    4. Centrifugeer de buis bij 800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.
    5. Voeg 500 µL van Lysis buffer A aan de kralen, en meng goed door de buis meerdere malen omkeren. Opslaan van de kralen bij 4 ° C.
  2. Voorbereiding van cel lysate
    1. (Optioneel) Als de cellen zijn bevroren in stap 2, plaats en ontdooien van bevroren cellen op ijs totdat de cellen losse worden.
    2. Wassen van de cellen een keer met 10 mL PBS (-). Centrifugeer het monster bij 1.450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, en verwijder het supernatant.
    3. Lyse de cellen met ijskoude Lysis-buffermengsel een (1 mL lysisbuffermengsel A per 1 x 10,7 , van de cellen) door zachte pipetteren.
    4. Bewerk ultrasone trillingen ten het monster in een 1,5 mL tube met volgende voorwaarden; versterking van de ultrasoonapparaat ingesteld op 25% en bewerk ultrasone trillingen ten voor 10 s.
    5. Centrifugeer het monster bij 20,400 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    6. De bovendrijvende vloeistof te verzamelen. Pipetteer elk 1 mL van het supernatans in 1,5 mL microcentrifuge buizen.
      Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren.
  3. Immunoprecipitation
    1. Vooraf duidelijk de lysate uit stap 3.2.6 door toevoeging van 40 µL (kraal volume 20 µL) van de voorwas eiwit A-agarose kralen per 1 mL van de lysate. Meng goed door de buis meerdere malen omkeren en draai het monster gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    2. Centrifugeer het monster bij 13.000 x g voor 1 min bij 4 ° C, en het supernatant te herstellen.
    3. Voeg 40 µL (bed volume 20 µL) van de voorwas eiwit A-agarose kralen en 10 µg anti-menselijke TERT antilichaam (kloon: 10E9-2)8 in de vooraf gewiste lysate. Meng goed door de buis meerdere malen omkeren en draai het monster bij 4 ° C dan 's nachts.
    4. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.
    5. Wassen van de kralen met Wash buffer 1: 1 mL was buffer 1 toevoegen aan de kralen, meng goed door het omkeren van de buis en roteren van het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap aanvullende driemaal.
    6. De kralen keer wassen met AGC oplossing die 2 mM CaCl2: Voeg 1 mL AGC oplossing met 2 mM CaCl2 tot de kralen, meng goed door het omkeren van de buis en roteren van het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.
    7. Behandelen van de kralen met Micrococcal nuclease (MNase): bereiden van het MNase reactiemengsel beschreven in tabel 1. Resuspendeer de kralen in 60 µL van het reactiemengsel MNase door zachte pipetteren. Schud het monster voorzichtig (20 tot 25 rpm) op een draaitafel van een shaker instellen in een Peltier-type incubator voor 15 min bij 25 ° C.
      Opmerking: Het is zeer belangrijk te gebruiken een golvende shaker en Volg strikt de maximumsnelheid in deze stap. Ander soort shakers, zoals roterende mixers, worden niet aanbevolen.
    8. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie.
    9. Wassen van de kralen tweemaal met AGC oplossing met 3 mM EGTA: toevoegen van AGC met 3 mM EGTA tot de parels 1 mL, meng goed door het omkeren van de buis en draaien het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap eenmaal.
    10. Wassen van de kralen eenmaal met Wash buffer 2: Voeg 1 mL was buffer 2de kralen, meng goed door het omkeren van de buis, te roteren het monster gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 3300 x g voor 0,5 min bij 4 ° C, en verwijder de bovendrijvende substantie. Houd de kralen op het ijs tijdens het opzetten van RdRP reactie.
      Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren.
  4. RdRP-reactie
    1. Bereid het reactiemengsel van een RdRP in een nieuwe buis zoals beschreven in tabel 2.
    2. Voeg 6 µL van [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) aan het mengsel en meng goed door pipetteren.
      Opmerking: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP, of [α -32P] GTP kan worden gebruikt voor de reactie in plaats van [α -32P] UTP.
    3. Voeg 1 µL van sjabloon RNA (1 µg/µL) aan het mengsel en meng goed door pipetteren.
      Opmerking: Om de bepaling van de RdRP, wordt de volgende sjabloon RNA aanbevolen: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.
    4. Resuspendeer de kralen met 20 µL van het mengsel uitmaakt van RdRP, reactie uit stap 3.4.3 door pipetteren.
    5. Schud het monster voorzichtig (20 tot 25 rpm) op een draaitafel van een shaker instellen in een peltier-type incubator voor 2 h bij 32 ° C.
    6. 5.4 µL van proteïnase K (20 mg/mL) en 45.4 µL van 2 x proteïnase K buffer toevoegen aan het reactiemengsel. Meng door pipetteren en schud (20 tot 25 rpm) het monster op een draaitafel instellen in een incubator Peltier-type gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    7. Voeg 109.2 µL van RNase-vrij water aan het monster.
    8. Voeg 200 µL van zure fenol-chloroform aan het monster. Meng goed door vortex, en vervolgens Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De waterfase overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal deze stap eenmaal.
    9. Voeg 20 µL van 3 M Natriumacetaat (pH = 5.2), 4 µL van neerslag vervoerder en 250 µL van ethanol tot de waterige fase. Schud de buis goed voor mixen en centrifugeren van het monster bij 21,100 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    10. Wassen van de pellet met 300 µL van koude 70% (vol/vol) ethanol opgeslagen bij-20 ° C. Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    11. Verwijder het supernatant en drogen van de pellet.
      Let op: Alle procedures onder RNase-vrij voorwaarden uitvoeren.
      Opmerking: De pellet uit stap 3.4.11 kan worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 2 dagen.
  5. RNase behandeling
    1. Resuspendeer de pellet uit stap 3.4.11 in 20 µL van RNase-gratis water.
    2. Bereiden een RNase reactiemengsel in een nieuwe buis zoals beschreven in tabel 3.
    3. 180 µL van het reactiemengsel RNase Voeg aan het monster, en Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    4. 2.3 µL van 10% (vol/vol) SDS Voeg aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
    5. Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) aan het monster en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
    6. 205 µL van zure fenol-chloroform Voeg aan het monster. Meng goed door vortex, centrifugeer dan het monster bij 21,100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De waterfase overbrengen in een nieuwe buis.
    7. Voeg 20 µL van 3 M Natriumacetaat (pH 5.2), 4 µL van neerslag vervoerder en 250 µL van ethanol tot de waterige fase. Schud de buis goed voor mixen en centrifugeren van het monster bij 21,100 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    8. Wassen van de pellet met 300 µL van koude 70% (vol/vol) ethanol opgeslagen bij-20 ° C. Centrifugeer het monster bij 21,100 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    9. Verwijder het supernatant en drogen van de pellet.
      Opmerking: De pellet uit stap 3.5.9 kan worden achtergelaten bij-20 ° C gedurende ten minste 2 dagen.
  6. De gelelektroforese van het en autoradiografie
    1. Resuspendeer de monster met 20 µL van RNase-gratis water.
    2. Voeg 20 µL van 2 x laden van de buffer.
    3. Kook het monster gedurende 10 minuten bij 95 ° C. Plet het monster op het ijs.
    4. De gel worden uitgevoerd. In het geval de sjabloon grootte 34 nts (Zie ook stap 3.4.3), wordt 7 M ureum - 10% polyacrylamidegel gebruikt voor denaturering van de Elektroforese van het gel.
    5. De gel met een gel droger drogen.
    6. Blootstellen van de film aan de gedroogde-gel binnen een X-ray cassette met een toenemende scherm bij-80 ° C.

Representative Results

Met de sjabloon aanbevolen RNA zijn radioactieve RdRP producten waargenomen tussen 20 tot 30 nucleotiden (nt) specifiek in HeLa cellen in mitotische fase na nachtelijke blootstelling (figuur 1A). Typisch, signaalsterkte van de producten van de RdRP toont twee bergtoppen die zijn gepositioneerd rond de 25 nt en 30 nt in consonant met de grootteverdeling van de producten bevestigd door volgende generatie sequencing9. In tegenstelling tot de mitotische cellen tonen HeLa cellen zonder synchronisatie bijna afwezigheid van de 20-30 nt radioactieve producten. Ovale signalen, die worden geplaatst onder 20 nt in alle monsters, zijn niet-specifieke driften.

In het geval dat er alleen een ~ 30 nt product met zwak signaal in mitotische HeLa cellen, betekent dit dat de RdRP reactie niet goed gaan. Bijvoorbeeld, als MNase behandeling op ongeveer en ongepast gebeurt, de signaalsterkte in mitotische HeLa cellen daalt aanzienlijk (figuur 1B). RdRP reactie uitgevoerd met oude HMD oplossing vermindert ook de producten (Figuur 1 c).

Figure 1
Figuur 1 : Vertegenwoordiger RdRP producten van endogene TERT in mitotische HeLa cellen. (A) drie representatieve resultaten van de bepaling van de IP-RdRP in HeLa cellen behandeld met nocodazole (gemanipuleerd) of DMSO (unmanipulated). De chemisch gesynthetiseerde 34 nt RNA werd gebruikt als een sjabloon. (B) IP-RdRP assay in mitotische HeLa cellen uitgevoerd met ongepaste behandeling van de MNase. (C) IP-RdRP assay in mitotische HeLa cellen uitgevoerd met verse of oude HMD oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Reagentia Volume
Micrococcal Nuclease, 20 U/µL 1 ΜL
Micrococcal Nuclease Buffer, 10 x 8 ΜL
RNase-gratis water 51 ΜL

Tabel 1: MNase reactie mix component.

Reagentia Volume
CHAPS, 0,07 procent (wt/vol) 6 ΜL
HMD oplossing 2 ΜL
rATP, 80 mM 0,5 ΜL
rGTP, 8 mM 1 ΜL
rUTP, 0,4 mM 1 ΜL
rCTP, 8 mM 1 ΜL
RNase remmer, 40 U/µL 0,5 ΜL
RNase-gratis water 1 ΜL

Tabel 2: RdRP reactie mix component.

Reagentia Volume
RNase één Ribonuclease, 10 U/µL 0.2 ΜL
Reactie Buffer, 10 x 20 ΜL
RNase-gratis water 159.8 ΜL

Tabel 3: Ribonuclease reactie mix component.

Discussion

De IP-RdRP bepaling is een gevoelige methode om de RdRP activiteit van menselijke TERT detecteren. TERT-eiwit wordt sterk uitgedrukt in mitotische HeLa cellen, waarin TERT de RdRP complexe8,9,10 vormt. Dit suggereert dat mitotische HeLa cellen een optimale materiaal zijn te detecteren RdRP activiteit. In het protocol zoals hierboven beschreven, zijn mitotische en niet-gesynchroniseerde HeLa cellen opgenomen als een positief en een negatief voorbeeld, respectievelijk. Zoals blijkt uit figuur 1A, RdRP assay producten uit de aanbevolen RNA-sjabloon in mitotische HeLa cellen Toon brede radioactieve signalen tussen 20 tot 30 nt. Naast HeLa cellen, hebben we uitgevoerd van de test met verschillende soorten cellijnen, en vond dat het signaal patroon kan worden gewijzigd in een andere cel typen9: sommige tonen een sterk signaal slechts ongeveer 30 nt, sommige tonen een vergelijkbaar patroon met HeLa cellen. We hebben ook gepresteerd de bepaling met RNA sjablonen dan de 34 nt sjabloon8, kort en lang (~ 300 nt) RNAs met verschillende reeksen, en met succes verkregen RdRP producten die sjablonen hoewel er enkele voorkeur wellicht. Voor de eerste proef, echter raden we HeLa cellen in mitotische fase en de 34 nt RNA-sjabloon. RdRPs kunt double-stranded RNA genereren zowel in een primer-afhankelijke een primer-onafhankelijke manier11. We hebben gemeld dat TERT deze eigenschap als menselijke RdRP7,-9 bewaart; TERT synthetiseert dsRNA uit een RNA-sjabloon met 3'-foldback structuur via een rug-priming mechanisme7. Voor de 34 nt RNA-sjabloon synthetiseert TERT complementaire strengen zonder gebruik te maken van inleidingen9. Specifiek het detecteren van RdRP producten in een primer-onafhankelijke manier, d.w.z. DOVO gesynthetiseerd RNA producten, [α -32P] gesynthetiseerd NTP kan worden vervangen door [γ -32P] NTP in de RdRP reactie9.

MNase behandeling van immuuncomplexen van het TERT op parels is een cruciale stap om gewenste resultaten te bereiken. Als de MNase-behandeling wordt uitgevoerd, te lang of met intensieve schudden, zou de RdRP producten opmerkelijk worden teruggebracht. Om te voorkomen dat een dergelijke problemen, raden wij het protocol zorgvuldig strikt te volgen. HMD oplossing is een andere kritische factor voor succes. Als u vindt dat de signalen zeer zwak zijn, vervangen de HMD oplossing naar een nieuw bereid.

In het gehele protocol, moet men zorgvuldig om te voorkomen dat RNase besmetting nemen. Ribonuclease behandeling moet worden uitgevoerd met speciale apparatuur. Na het manipuleren van de Ribonuclease, een tips moet verwijderen en buizen met RNase onmiddellijk, RNase elimineren met gespecialiseerde oplossing (bijvoorbeeld RNase rustige), en wijzigen van de bosjes.

TERT interageert met niet alleen TERC maar ook vele soorten endogene RNAs, en hebben we een deel van hen7gemeld. Wijziging in de IP-RdRP assay, zoals de bepaling van de IP-RdRP zonder MNase behandeling, zal een volledige lijst van endogene RNA sjablonen voor TERT-geassocieerde RdRP activiteit en bioinformatic gids bevatten over de functies van hun reeks. We hebben dit protocol met succes toegepast op weefsel lysate. Omdat TERT wordt uitgedrukt in een verscheidenheid van normaal en tumor weefsels, kan deze bepaling zinvol zijn om te onderzoeken niet-canonieke enzymatische functie van TERT in de mens.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd deels gesteund door het Project voor de ontwikkeling van innovatieve onderzoek naar kanker Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) en het Project voor kankeronderzoek en therapeutische Evolution (P-maken) (16cm 01061150001, K.M.) uit Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED; de Takeda Science Foundation (Y.M.); Toekenning van de Prinses Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); en JSPS KAKENHI Grant nummer JP16K07133 (Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Wako 044-29765
Fetal bovine serum (FBS) CORNING 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin mixed solution nacalai tesque 26253-84
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution nacalai tesque 32777-44
Phosphate buffered saline (PBS(-)) Wako 166-23555
Thymidine nacalai tesque 07147-61
Nocodazole Sigma M1404
Dimethyl sulfoxide (DMSO) nacalai tesque 08904-85
Sodium chloride nacalai tesque 31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane nacalai tesque 35434-21
Hydrochloric acid nacalai tesque 18321-05
Nonidet P-40 (NP-40) nacalai tesque 25223-04
Pierce Protein A Plus Agarose Thermo scientific 22812
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) nacalai tesque 17514-15
Potassium hydroxide Wako 168-21815
Potassium acetate nacalai tesque 28405-05
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) Wako 135-00165
Glycerol nacalai tesque 17045-65
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) Wako 169-21105
cOmplete, EDTA-free Roche Applied Science 11 873 580 001
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) nacalai tesque 06731-05
Micrococcal nuclease (MNase) Takara Bio 2910A
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) nacalai tesque 15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) nacalai tesque 07957-64
Dithiothreitol (DTT) nacalai tesque 14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each Promega E6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) PerkinElmer NEG507H Use fresh RI for the assay
RNase inhibitor TOYOBO SIN-201
Proteinase K Takara 9033
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Life Technologies AM9720
3 M Sodium acetate NIPPON GENE 316-90081
Ethanol (99.5) nacalai tesque 14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara Bio 9094
RNase One Ribonuclease Promega M4265
Sodium dodecyl sulfate (SDS) nacalai tesque 02873-75
Formamide, deionized nacalai tesque 16345-65
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) nacalai tesque 15130-95
Orange G nacalai tesque 25401-22
CO2 incubator e.g., ASTEC SCA-325DRS
Centrifuge e.g., TOMY EX-135 For step B)
Micro refrigerated centrifuge e.g., KUBOTA 3740 For step 6.2
Sonicator Qsonica Q125 Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4
Micro refrigerated centrifuge e.g., TOMY MX-305 For step 6.5
Cooled incubator e.g., Panasonic MIR-154-PJ Set a rotary shaker inside
Rotary shaker e.g., TAITEC RT-5
Cooled incubator  e.g., TAITEC BR-43FL Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7
MINI WAVE AS ONE WEV-03 A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6
Incubator e.g., TAITEC HB-80 Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6
Block incubator e.g., ASTEC BI-516S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Tags

Genetica kwestie 136 TERT RNA-afhankelijke RNA-polymerase double-stranded RNA telomerase immunoprecipitation isotoop
Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti,… More

Maida, Y., Yasukawa, M., Ghilotti, M., Ando, Y., Masutomi, K. Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein. J. Vis. Exp. (136), e57021, doi:10.3791/57021 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter