Summary
Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) syntetiserer ikke bare telomeric DNA, men også double-strandet RNA gjennom RNA-avhengig RNA polymerase aktivitet. Her beskriver vi en nyetablerte analysen for å oppdage RNA-avhengig RNA polymerase aktivitet av endogene TERT.
Abstract
Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) er det katalytisk delenhet i telomerase, og det elongates telomere gjennom RNA-avhengig DNA polymerase aktivitet. Selv om TERT er benevnt idet en revers transkriptase, viser strukturelle og Fylogenetiske analyser av TERT at TERT er medlem av høyrehendt polymerases, og forholder seg til viral RNA-avhengig RNA polymerases (RdRPs) og viral revers transkriptase. Vi først identifisert RdRP aktivitet av menneskelig TERT som genererer komplementære RNA står til en mal ikke-koding RNA og bidrar til RNA stanse i kreftcellene. For å analysere denne ikke-kanoniske enzymatisk aktivitet, vi utviklet RdRP analysen med rekombinant TERT i 2009, deretter etablert i vitro RdRP analysen for endogene TERT. I dette manuskriptet beskrive vi sistnevnte. TERT immun komplekser er kort, isolert fra celler, og inkubert med malen RNA og rNTPs inkludert radioaktivt rNTP for RdRP reaksjon. For å eliminere single-strandet RNA, behandles reaksjon produkter med RNase jeg, og de siste produktene analyseres polyakrylamid gel geleelektroforese. Radiolabeled RdRP produkter kan bli oppdaget av autoradiography etter overnatting eksponering.
Introduction
Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) er kjent som den katalytiske delenhet i telomerase, og det elongates telomere bruker telomerase RNA-komponenten (TERC), den spesifikke RNA mal1. Selv om TERT polymerizes telomeric DNA som en del av telomerase, indikerer de strukturelle og Fylogenetiske analysene at TERT er nært beslektet med viral RNA-avhengig RNA polymerases (RdRPs) samt viral revers transkriptase og deler domener med disse polymerases2,3,4. RdRP er enzymet som genererer komplementære RNA strand til en mal RNA. Enzymet er kodet ikke bare i virus, men også i modellen organismer, som plante, gjær og ormen, og double-strandet RNA syntese av RdRP bidrar til transcriptional og post-transcriptional genet stanse i disse organismer5,6 . Selv om menneskelig RdRP hadde vært savnet i lang tid, fant vi RdRP aktivitet i menneskelig TERT i 20097.
Vi først bekreftet RdRP aktivitet av TERT med rekombinante proteiner7, så etablert en følsom i vitro analysen for å oppdage RdRP aktivitet av endogene TERT8. Her viser vi i vitro RdRP analysen (IP-RdRP analysen) for endogene TERT. Denne metoden starter med immunoprecipitation (IP) av endogene TERT, og etterfølges av i vitro RdRP reaksjon, der radioaktivt ribonucleotides er innlemmet i begynnende RNA tråder.
Protocol
1. reagens oppsett
-
Reagenser brukes til celle synkronisering
- Vil generere Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) som inneholder 2,5 thymidine, løses 30.28 mg thymidine per 1 mL av vev kultur klasse vann å forberede 125 mM thymidine. Filtrer løsningen med en 0.22 μm sprøyte filter enhet. Legg 1 mL av nylagde 125 mM thymidine per 50 mL av DMEM med 10% (vol/vol) fetal bovin serum (FBS).
- Vil generere DMEM som inneholder 0,1 μg/mL av nocodazole, oppløses nocodazole i dimethyl sulfoxide (DMSO) å forberede 5 μg/μL nocodazole. Legge 1 µL av 5 µg / µL nocodazole per 50 mL av DMEM supplert med 10% (vol/vol) FBS.
- Vil generere DMEM som inneholder 0,002% (vol/vol) av DMSO, Legg 1 µL av DMSO per 50 mL av DMEM med 10% (vol/vol) FBS.
-
IP-RdRP analysen de anvendte reagensene
- Forberede lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) og 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Lagre reagensen på 4 ° C.
- Forberede 5 x acetate buffer: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic syre (HEPES)-KOH (pH 7,8), 500 mM kalium acetate og 20 mM MgCl2. Lagre reagensen ved romtemperatur.
- Forberede vaskebuffer for acetat av buffer 1: 1 x, 10% (vol/vol) glyserol, 0,1% (vol/vol) Triton X-100 og 0,06 x protease hemmer cocktail, ethylenediamenetetraacetic syre (EDTA)-gratis. Forberede vaskebuffer 1 på dagen bruk eller dagen før bruk. Lagre reagensen på 4 ° C.
- Forberede AGC løsning: 1 x acetate buffer, 10% (vol/vol) glyserol og 0.02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Lagre reagensen på 4 ° C.
- Vil generere AGC løsning som inneholder 2 mM CaCl2, kan du legge 100 µL av 1 M CaCl2 per 50 mL av AGC løsning. Lagre reagensen på 4 ° C.
- Generere AGC løsning som inneholder 3 mM etylenglykol bis (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA), legge til 375 µL 0,4 m EGTA (pH 7.5) per 50 mL av AGC løsning. Lagre reagensen på 4 ° C.
- Forbered vaskebuffer for acetat av buffer 2: 1 x og 0.02% (wt/vol) CHAPS. Lagre reagensen på 4 ° C.
- Forberede HMD løsning: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 og 2 mM dithiothreitol (DTT). Lagre reagensen på 20 ° C.
Merk: HMD løsning skal fornyes minst tre månedene. - Forberede 2 x proteinasen K buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA og 1% (wt/vol) natrium dodecyl sulfate (SDS). Lagre reagensen på 20 ° C.
- Forberede 2 x lasting buffer: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA og 1% (wt/vol) oransje G. Store reagensen på 20 ° C.
2. utarbeidelse av HeLa celler
Merk: Forberede HeLa celler synkronisert i mitotisk fase (manipulerte) eller dele asynkront (unmanipulated). Kultur cellene i nærvær av 5% CO2 på 37 ° C.
-
Synkronisering av HeLa celler i mitose
- Plate 1 x 106 HeLa celler med 10 mL av DMEM med 10% (vol/vol) FBS i 10 cm kultur parabol.
- To dager etter plating, Erstatt medium med 10 mL av DMEM som inneholder 2,5 thymidine og 10% (vol/vol) FBS. Kultur celler for 24 timer.
- Vask cellene tre ganger med 10 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) (-), og kultur cellene med 10 mL av DMEM med 10% (vol/vol) FBS 6 h.
- Erstatt medium med 10 mL av DMEM som inneholder 0,1 µg/mL nocodazole og 10% (vol/vol) FBS, og kultur celler for 14 h.
- Riste kultur parabol forsiktig og hente nedbryting inneholder frittstående mitotisk cellene. Beregne cellen for IP-RdRP analysen.
- Sentrifuge prøven 490 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
Merk: Cellen pellets kan lagres på-80 ° C.
-
Utarbeidelse av unmanipulated HeLa celler
- Plate 1 x 106 HeLa celler med 10 mL av DMEM med 10% (vol/vol) FBS i 10 cm kultur parabol.
- To dager etter plating, Erstatt medium med 10 mL av DMEM med 10% (vol/vol) FBS. Kultur celler for 30 timer.
- Erstatt medium med 10 mL av DMEM som inneholder 0,002% (vol/vol) DMSO og 10% (vol/vol) FBS, og kultur celler for 14 h.
- Samle inn cellene ved trypsinization med 0,7 mL av trypsin (2.5 g/L) som inneholder 1 mM EDTA. Beregne cellen for IP-RdRP analysen.
- Sentrifuge prøven 490 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
Merk: Cellen pellets kan lagres på-80 ° C.
3. IP-RdRP analysen
- Protein A-agarose perle forberedelse
- Overføre 1 mL (seng volum 500 µL) affinitet harpiks til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Sentrifuge 800 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
- Legg til 800 µL av lyseringsbuffer A perler, og bland godt invertere røret flere ganger. Sentrifuge 800 x g i 3 minutter på 4 ° C, og forkaste nedbryting. Gjenta dette trinnet to ganger (totalt tre vasker).
- Legge til 800 µL av lyseringsbuffer A perler, bland godt invertere røret flere ganger. Rotere røret over natten (eller minst 4 h) på 4 ° C på en roterende shaker.
- Sentrifuge røret på 800 x g i 3 minutter på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
- Legg til 500 µL av lyseringsbuffer A perler, og bland godt invertere røret flere ganger. Lagre perler på 4 ° C.
- Utarbeidelse av cellen lysate
- (Valgfritt) Hvis cellene er frosset i trinn 2, sted og tine frosne celler på is til cellene blir løs.
- Vask cellene gang med 10 mL PBS (-). Sentrifuge prøven 1,450 x g i 5 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
- Lyse cellene med iskald lyseringsbuffer en (1 mL av lyseringsbuffer A per 1 x 107 cellene) av mild pipettering.
- Sonicate prøven i en 1,5 mL tube med følgende; Angi forsterking av sonicator til 25%, og sonicate for 10 s.
- Sentrifuge prøven 20,400 x g i 15 min på 4 ° C.
- Samle nedbryting. Overføre 1 mL hver nedbryting av til 1,5 mL microcentrifuge rør.
FORSIKTIG: Utfør alle prosedyrer under RNase-gratis forhold.
- Immunoprecipitation
- Pre Fjern den lysate fra trinn 3.2.6 ved å legge til 40 µL (perle volum 20 µL) av prewashed protein A-agarose perler per 1 mL av lysate. Bland godt invertere røret flere ganger og rotere utvalget for 30 min på 4 ° C.
- Sentrifuge prøven 13.000 x g for 1 min på 4 ° C, og gjenopprette nedbryting.
- Legge 40 µL (seng volum 20 µL) prewashed protein A-agarose perler og 10 µg anti-TERT antistoff (klone: 10E9-2)8 i den pre-ryddet lysate. Bland godt invertere røret flere ganger og rotere prøven på 4 ° C over natten.
- Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting.
- Vask perler med vaskebuffer 1: legge til 1 mL av vaskebuffer 1 perler, bland godt invertere røret og rotere utvalget for 5 min på 4 ° C. Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Vask perler når AGC løsning som inneholder 2 mM CaCl2: legge 1 mL av AGC løsning som inneholder 2 mM CaCl2 til perlene, bland godt invertere røret og rotere utvalget for 5 min på 4 ° C. Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting.
- Behandle perler med Micrococcal nuclease (MNase): forberede MNase reaksjonsblandingen beskrevet i tabell 1. Resuspend perler i 60 µL MNase reaksjonsblandingen av mild pipettering. Riste prøven forsiktig (20 til 25 rpm) på en platespiller en shaker i et Peltier-type inkubator i 15 min på 25 ° C.
Merk: Det er svært viktig å bruke en bølgende shaker og strengt følge fartsgrensen i dette trinnet. Andre typer shakers, som roterende blandebatterier, anbefales ikke. - Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting.
- Vask perlene to ganger med AGC løsning som inneholder 3 mM EGTA: legge 1 mL av AGC løsning som inneholder 3 mM EGTA til perler, bland godt invertere røret og rotere utvalget for 5 min på 4 ° C. Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting. Gjenta dette trinnet når.
- Vask perlene gang med vaskebuffer 2: legge til 1 mL av vaskebuffer 2til perlene, bland godt invertere røret, og roter utvalget for 5 min på 4 ° C. Sentrifuge prøven 3300 x g for 0,5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting. Holde perlene på isen stund innfatning opp RdRP reaksjon.
FORSIKTIG: Utfør alle prosedyrer under RNase-gratis forhold.
- RdRP reaksjon
- Forbered en RdRP reaksjonen blanding i et nytt rør som beskrevet i tabell 2.
- Legge til 6 µL av [α -32P] UTP (3000 Ci/mmol) til blandingen og bland godt av pipettering.
Merk: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP, eller [α -32P] GTP kan brukes for reaksjonen i stedet for [α -32P] UTP. - Legge 1 µL av RNA (1 µg/µL) til blandingen og bland godt av pipettering.
Merk: for å etablere RdRP analysen, følgende RNA mal anbefaler: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9. - Resuspend perler med 20 µL RdRP reaksjonsblandingen fra trinn 3.4.3 av pipettering.
- Riste prøven forsiktig (20 til 25 rpm) på en platespiller en shaker i et peltier-type inkubator for 2t på 32 ° C.
- Legge til 5,4 µL proteinasen k (20 mg/mL) og 45,4 µL av 2 x proteinasen K buffer reaksjonsblandingen. Blande av pipettering og rist (20 til 25 rpm) eksempel på en platespiller i et Peltier-type inkubator for 30 min på 37 ° C.
- Legg 109.2 µL av RNase-fritt vann til prøven.
- Legge til 200 µL av syre fenol-kloroform prøven. Bland godt vortex, og deretter virvel prøven 21,100 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre den vandige fasen til en ny tube. Gjenta dette trinnet når.
- Legge til 20 µL av 3 M natrium acetate (pH = 5.2), 4 µL av nedbør transportør og 250 µL av etanol den vandige fasen. Riste røret godt for å blande, så sentrifuge prøven 21,100 x g for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Vask pellets med 300 µL av kaldt 70% (vol/vol) etanol lagret på 20 ° C. Sentrifuge prøven 21,100 x g i 15 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og air-dry pellet.
FORSIKTIG: Utfør alle prosedyrer under RNase-gratis forhold.
Merk: Pellet fra trinn 3.4.11 kan lagres på 20 ° C i minst 2 dager.
- RNase behandling
- Resuspend pellets fra trinn 3.4.11 i 20 µL RNase uten vann.
- Forbered en RNase reaksjonen blanding i et nytt rør som beskrevet i tabell 3.
- Legg til 180 µL RNase reaksjonsblandingen prøven, og ruge røret for 2t på 37 ° C.
- Legge til 2,3 µL av 10% (vol/vol) SDS prøven og ruge i 15 min på 37 ° C.
- Legg 2 µL proteinasen k (20 mg/mL) til prøven og ruge i 15 min på 37 ° C.
- Legge til 205 µL av syre fenol-kloroform prøven. Bland godt av virvelen, deretter sentrifuge prøven 21,100 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre den vandige fasen til en ny tube.
- Legge til 20 µL av 3 M natrium acetate (pH 5.2), 4 µL av nedbør og 250 µL av etanol den vandige fasen. Riste røret godt for å blande, så sentrifuge prøven 21,100 x g for 20 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Vask pellets med 300 µL av kaldt 70% (vol/vol) etanol lagret på 20 ° C. Sentrifuge prøven 21,100 x g i 15 min på 4 ° C.
- Forkast nedbryting og air-dry pellet.
Merk: Pellet fra trinn 3.5.9 kan lagres på 20 ° C i minst 2 dager.
- Gel gelelektroforese og autoradiography
- Resuspend prøven med 20 µL RNase uten vann.
- Legge til 20 µL av 2 x lasting buffer.
- Kok utvalget for 10 min på 95 ° C. Knuse prøven på isen.
- Kjør gel. I tilfelle mal er 34 nts (se trinn 3.4.3), brukes 7 M Urea - 10% polyakrylamid gel denaturing gel geleelektroforese.
- Tørr gel med en gel tørketrommel.
- Utsette filmen til tørket-gel innen en X-ray kassett med en intensiverer skjermen på-80 ° C.
Representative Results
Med malen anbefalte RNA er radioaktivt RdRP produkter observert mellom 20 til 30 nukleotider (nt) spesielt i HeLa celler i mitotisk fasen etter overnatting eksponering (figur 1A). Vanligvis signal intensiteten av RdRP produktene viser to topper som er plassert rundt 25 nt og 30 nt i konsonanser med størrelsesDistribusjon av produktene bekreftet av neste generasjons sekvensering9. I motsetning til mitotisk celler viser HeLa celler uten synkronisering nesten fravær av 20-30 nt radioaktivt produktene. Oval signaler, som er plassert under 20 nt i alle prøver, er uspesifikke driver.
I tilfelle at det er bare en ~ 30 nt produkt med svakt signal i mitotisk HeLa celler, betyr det at RdRP reaksjonen ikke gikk bra. For eksempel hvis MNase behandling utføres omtrent og feilaktig, signalet intensiteten i mitotisk HeLa celler reduseres betydelig (figur 1B). RdRP reaksjon med gamle HMD løsningen reduserer også produktene (figur 1 c).
Figur 1 : Representant RdRP produkter av endogene TERT i mitotisk HeLa celler. (A) tre representant resultatene av IP-RdRP analysen i HeLa cellene behandlet med nocodazole (manipulerte) eller DMSO (unmanipulated). De kjemisk syntetisert 34 nt RNA ble brukt som en mal. (B) IP-RdRP analysen i mitotisk HeLa celler med upassende MNase behandling. (C) IP-RdRP analysen i mitotisk HeLa celler med enten friske eller gamle HMD løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagenser | Volum |
| Micrococcal Nuclease, 20 U/µL | 1 ΜL |
| Micrococcal Nuclease Buffer, 10 x | 8 ΜL |
| RNase-fritt vann | 51 ΜL |
Tabell 1: MNase reaksjonen blanding komponent.
| Reagenser | Volum |
| CHAPS, 0,07% (wt/vol) | 6 ΜL |
| HMD løsning | 2 ΜL |
| rATP, 80 mM | 0,5 ΜL |
| rGTP, 8 mM | 1 ΜL |
| rUTP, 0.4 mM | 1 ΜL |
| rCTP, 8 mM | 1 ΜL |
| RNase hemmer, 40 U/µL | 0,5 ΜL |
| RNase-fritt vann | 1 ΜL |
Tabell 2: RdRP reaksjonen blanding komponent.
| Reagenser | Volum |
| RNase en Ribonuclease, 10 U/µL | 0,2 ΜL |
| Reaksjon Buffer, 10 x | 20 ΜL |
| RNase-fritt vann | 159.8 ΜL |
Tabell 3: Ribonuclease reaksjonen blanding komponent.
Discussion
IP-RdRP analysen er en følsom å oppdage RdRP aktivitet av menneskelig TERT. TERT protein er svært uttrykt i mitotisk HeLa celler, der TERT danner RdRP komplekse8,9,10. Dette tyder på at mitotisk HeLa celler er en optimal materiale å oppdage RdRP aktivitet. I protokollen beskrevet ovenfor, er mitotisk og ikke-synkroniserte HeLa celler inkludert som en positiv og en negativ eksempel, henholdsvis. Som vist i figur 1A, RdRP analysen produkter fra malen for anbefalte RNA i mitotisk HeLa celler Vis bred radioaktivt signaler mellom 20 til 30 nt. I tillegg til HeLa celler, vi har utført analysen med ulike typer linjer, og fant at signalet mønsteret kan endres i ulike celle typer9: noen viser et sterkt signal bare rundt 30 nt, noen viser et lignende mønster med HeLa celler. Vi har også utført analysen med RNA maler enn 34 nt mal8, kort og lang (~ 300 nt) RNAs med forskjellige sekvenser, og vellykket innhentet RdRP produkter fra malene selv om det kan være noen preferanse. For det første prøve, men anbefaler vi bruker HeLa celler i mitotisk fase og 34 nt RNA malen. RdRPs kan generere double-strandet RNA både en primer-avhengige og en primer-uavhengig måte11. Vi har rapportert at TERT beholder denne egenskapen for menneskelig RdRP7,9; TERT syntetiserer dsRNA fra en RNA mal med 3-foldback struktur gjennom en tilbake-grunning mekanisme7. For malen 34 nt RNA syntetiserer TERT komplementære tråder uten å bruke primere9. Spesielt oppdage RdRP produkter syntetisert i en primer-uavhengig måte, dvs de novo syntetisert RNA produkter, [α -32P] NTP kan erstattes med [γ -32P] NTP i RdRP reaksjon9.
MNase behandling av TERT immun komplekser på perler er et viktig skritt for å oppnå ønskede resultater. Hvis MNase behandling utføres lenge eller med intensiv risting, reduseres RdRP produktene bemerkelsesverdig. For å unngå slike problemer, anbefaler vi sterkt å strengt følge protokollen nøye. HMD løsning er en kritisk faktor for suksess. Hvis du finner at signalene er veldig svak, erstatte HMD løsningen på en nylig utarbeidet.
Hele protokollen, bør man ta stor forsiktighet for å unngå RNase forurensning. Ribonuclease behandling bør utføres med dedikert utstyr. Etter manipulerer Ribonuclease, en bør kaste tips og rør med RNase umiddelbart, eliminere RNase med spesialiserte løsning (f.eks RNase stille), og endre lunder.
TERT samhandler med ikke bare TERC men også mange typer endogene RNAs, og vi har rapportert en del av dem7. Endring i IP-RdRP analysen, som IP-RdRP analysen uten MNase behandling, vil gi en fullstendig liste over endogene RNA maler for TERT-assosiert RdRP aktivitet og bioinformatic guide på deres sekvens funksjoner. Vi har aktivert denne protokollen til vev lysate. Fordi TERT er uttrykt i en rekke normal og tumor vev, kan denne analysen være nyttig å undersøke ikke-kanoniske enzymatisk funksjon av TERT i menneskelig.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av prosjektet for utvikling av nyskapende forskning på Cancer Therapeutics (P-direkte) (15cm0106102h0002 km) og prosjektet for kreftforskning og terapeutiske utvikling (P-opprette) (16cm 01061150001, km) fra Japan Agency for medisinsk forskning og utvikling, AMED; Takeda Science Foundation (Y.M.); Tildeling av prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); og JSP KAKENHI bevilgning nummer JP16K07133 (Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
| Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
| Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
| Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
| Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
| Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
| Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
| Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
| Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
| Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
| Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
| cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
| Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
| 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
| Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
| rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
| [a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
| RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
| Proteinase K | Takara | 9033 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
| 3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
| Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
| RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
| Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
| Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
| CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
| Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
| Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
| Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
| Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
| MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
| Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
| Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |
References
- Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
- Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
- Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
- Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
- Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
- Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
- Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
- Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
- Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
- van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).
