Summary
Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) syntetiserer ikke kun telomeric DNA, men også dobbelt-strenget RNA gennem RNA-afhængige RNA polymerase aktivitet. Her beskriver vi et nyetableret assay til påvisning af RNA-afhængige RNA polymerase aktivitet af endogene TERT.
Abstract
Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) er den katalytiske underenhed af telomerase, og det elongates telomere gennem RNA-afhængige DNA polymerase aktivitet. Selvom TERT er navngivet som en reverse transkriptase, demonstrere strukturelle og Fylogenetisk analyse af TERT at TERT er medlem af højrehåndet polymeraser, og vedrører viral RNA-afhængige RNA polymeraser (RdRPs) samt viral reverse transkriptase. For det første identificerede vi RdRP aktiviteten af menneskelige TERT, der genererer komplementære RNA står til en skabelon ikke-kodende RNA og bidrager til RNA silencing i kræftceller. For at analysere denne ikke-kanoniske enzymatisk aktivitet, vi udviklet RdRP assay med rekombinant TERT i 2009, derefter etableret i vitro RdRP analyse for endogene TERT. I dette manuskript beskriver vi sidstnævnte metode. Kort, TERT immunkomplekser er isoleret fra celler, og inkuberes med skabelon RNA og rNTPs herunder radioaktive rNTP for RdRP reaktion. For at eliminere enkeltstrenget RNA, behandles reaktionsprodukter med RNase jeg, og de endelige produkter analyseres med polyacrylamid gelelektroforese. Radiolabeled RdRP produkter kan påvises ved Autoradiografi efter natten eksponering.
Introduction
Menneskelige telomerase reverse transkriptase (TERT) er kendt som den katalytiske underenhed af telomerase, og det elongates telomere ved hjælp af telomerase RNA komponent (TERC), de specifikke RNA skabelon1. Selv om TERT polymeriserer telomeric DNA som en del af telomerase, viser de strukturelle og fylogenetiske analyser at TERT hænger nøje sammen med viral RNA-afhængige RNA polymeraser (RdRPs) samt viral reverse transkriptase og deler domæner med disse polymeraser2,3,4. RdRP er det enzym, der genererer komplementære RNA strand til en skabelon RNA. Enzymet er kodet ikke kun i virus, men også i modelorganismer såsom planter, gær og orm, og dobbelt-strenget RNA syntese af RdRP bidrager til transcriptional og post-transcriptional genhæmning i disse organismer5,6 . Selv om menneskelige RdRP havde manglet længe, fandt vi RdRP aktivitet i menneskelige TERT i 20097.
Vi først bekræftet RdRP aktivitet af TERT med rekombinant protein7, så etableret en følsomme i vitro assay til påvisning af RdRP aktivitet af endogene TERT8. Her viser vi i vitro RdRP analysen (IP-RdRP analyse) for endogene TERT. Denne metode starter med immunoprecipitation (IP) af endogene TERT, og efterfølges af in vitro- RdRP reaktion, hvor radioaktive ribonucleotides er indarbejdet i spirende RNA-strenge.
Protocol
1. reagens Setup
-
Reagenser til celle synkronisering
- For at generere Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 2,5 mM thymidine, 30.28 mg thymidine per 1 mL af vævskultur grade vand at forberede 125 mM thymidine opløses. Filtratet løsning med et 0,22 μm sprøjte filterenhed. Der tilsættes 1 mL af frisklavede 125 mM thymidine pr. 50 mL af DMEM suppleret med 10% (vol/vol) føtal bovint serum (FBS).
- For at generere DMEM som indeholder 0,1 μg/mL af nocodazole, opløses nocodazole i dimethylsulfoxid (DMSO) til at forberede 5 μg/μL nocodazole. Tilføj 1 µL af 5 µg / µL nocodazole pr. 50 mL af DMEM suppleret med 10% (vol/vol) FBS.
- For at generere DMEM som indeholder 0,002% (vol/vol) af DMSO, tilføje 1 µL af DMSO pr. 50 mL af DMEM suppleret med 10% (vol/vol) FBS.
-
Reagenser til IP-RdRP analyse
- Forberede lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) og 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Butik reagens ved 4 ° C.
- Forberede 5 x acetat buffer: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic syre (HEPES)-KOH (pH 7,8), 500 mM kalium acetat og 20 mM MgCl2. Gemme reagens ved stuetemperatur.
- Forberede Wash buffer 1: 1 x acetat buffer, 10% (vol/vol) glycerol, 0,1% (vol/vol) Triton X-100 og 0,06 x protease hæmmer cocktail, ethylenediamenetetraacetic syre (EDTA)-gratis. Forberede vaskebuffer 1 dag af brug eller dagen før brug. Butik reagens ved 4 ° C.
- Forberede AGC løsning: 1 x acetat buffer, 10% (vol/vol) glycerol og 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Butik reagens ved 4 ° C.
- For at generere AGC løsning indeholdende 2 mM CaCl2, tilføje 100 µL 1 M CaCl2 per 50 mL af AGC løsning. Butik reagens ved 4 ° C.
- At generere AGC løsning indeholdende 3 mM ethylenglycol bis (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA), tilføje 375 µL af 0,4 M EGTA (pH 7,5) pr. 50 mL af AGC løsning. Butik reagens ved 4 ° C.
- Forberede Wash buffer 2: 1 x acetat buffer og 0,02% (wt/vol) CHAPS. Butik reagens ved 4 ° C.
- Forberede HMD løsning: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 og 2 mM dithiothreitol (DTT). Butik reagens ved-20 ° C.
Bemærk: HMD løsning bør forlænges i det mindste i tre måneder. - Forberede 2 x Proteinase K buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA og 1% (wt/vol) natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS). Butik reagens ved-20 ° C.
- Forberede 2 x loading bufferen: 95% (vol/vol) formamid, 20 mM EDTA og 1% (wt/vol) Orange G. gemme reagens ved-20 ° C.
2. forberedelse af HeLa celler
Bemærk: Forberede HeLa celler synkroniseret i mitotiske fase (manipuleret) eller dividere asynkront (unmanipulated). Kultur celler i 5% CO2 ved 37 ° C.
-
Synkronisering af HeLa celler i mitosen
- Plade 1 x 106 af HeLa celler med 10 mL af DMEM suppleret med 10% (vol/vol) FBS i en kultur, 10 cm parabol.
- To dage efter plating, erstatte mediet med 10 mL af DMEM indeholdende 2,5 mM thymidine og 10% (vol/vol) FBS. Kultur celler i 24 timer.
- Cellerne vaskes tre gange med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (-), og kultur celler med 10 mL af DMEM som indeholder 10% (vol/vol) FBS til 6 h.
- Udskift mediet med 10 mL af DMEM der indeholder 0,1 µg/mL nocodazole og 10% (vol/vol) FBS, og kultur celler til 14 h.
- Ryst kultur parabol forsigtigt, og hente supernatanten med de fritliggende mitotiske celler. Antal celle til IP-RdRP assay.
- Centrifugeres prøve på 490 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
Bemærk: Celle pellet kan opbevares ved-80 ° C.
-
Forberedelse af unmanipulated HeLa celler
- Plade 1 x 106 af HeLa celler med 10 mL af DMEM suppleret med 10% (vol/vol) FBS i en kultur, 10 cm parabol.
- To dage efter plating, erstatte mediet med 10 mL af DMEM som indeholder 10% (vol/vol) FBS. Kultur celler i 30 timer.
- Udskift mediet med 10 mL af DMEM der indeholder 0,002% (vol/vol) DMSO og 10% (vol/vol) FBS, og kultur celler til 14 h.
- Indsamle cellerne af trypsinization ved hjælp af 0,7 mL trypsin (2,5 g/L) indeholdende 1 mM EDTA. Antal celle til IP-RdRP assay.
- Centrifugeres prøve på 490 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
Bemærk: Celle pellet kan opbevares ved-80 ° C.
3. IP-RdRP analyse
- Protein A-Agarosen perle forberedelse
- Der overføres 1 mL (bed volume 500 µL) af affinitet harpiks til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Tilføje 800 µL af lysisbuffer A til perlerne, og bland godt ved at vende røret flere gange. Der centrifugeres ved 800 x g i 3 min. ved 4 ° C, og supernatanten. Gentag dette trin to gange (samlede tre vasker).
- Tilføje 800 µL af lysisbuffer A til perlerne, bland godt ved at vende røret flere gange. Rotere røret natten over (eller i mindst 4 timer) ved 4 ° C på en orbitalryster.
- Centrifugeres rør ved 800 x g i 3 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Tilsæt 500 µL af lysisbuffer A til perlerne, og bland godt ved at vende røret flere gange. Gemme perler ved 4 ° C.
- Forberedelse af cellen lysate
- (Valgfrit) Hvis cellerne er frosset i trin 2, sted og optø frosne celler på is, indtil cellerne bliver løs.
- Vaske cellerne en gang med 10 mL PBS (-). Centrifugeres prøve ved 1.450 x g i 5 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Lyse celler med iskold lysisbuffer en (1 mL af lysisbuffer A pr. 1 x 107 celler) af blid pipettering.
- Der sonikeres prøven i et 1,5 mL rør med følgende betingelser; sæt forstærkning af sonikator på 25%, og Rens med ultralyd i 10 s.
- Centrifugeres prøve ved 20,400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Indsamle supernatanten. 1 mL af supernatanten overføres til 1,5 mL microcentrifuge rør.
Forsigtig: Udføre alle procedurer RNase-fri betingelser.
- Immunoprecipitation
- Pre klart den lysate fra trin 3.2.6 ved at tilføje 40 µL (perle bind 20 µL) af forrenset protein A-Agarosen perler per 1 mL af den lysate. Bland godt ved at vende røret flere gange og rotere prøve i 30 min. ved 4 ° C.
- Centrifugeres prøve på 13.000 x g i 1 min. ved 4 ° C, og Genskab supernatanten.
- Tilføje 40 µL (bed bind 20 µL) forrenset protein A-Agarosen perler og 10 µg-anti-humant TERT antistof (klon: 10E9-2)8 ind i den pre-ryddet lysate. Bland godt ved at vende røret flere gange og rotere prøve ved 4 ° C natten over.
- Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten.
- Vaske perler med Wash buffer 1: der tilsættes 1 mL af Wash buffer 1 til perlerne, bland godt ved at vende røret og rotere udsnit i 5 min. ved 4 ° C. Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten. Gentag dette trin tre yderligere gange.
- Vaske perlerne engang med AGC løsning indeholdende 2 mM CaCl2: der tilsættes 1 mL af AGC løsning indeholdende 2 mM CaCl2 til perlerne, bland godt ved at vende røret og rotere udsnit i 5 min. ved 4 ° C. Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten.
- Behandle perler med Micrococcal nukleasen (MNase): forbereder MNase reaktionsblandingen er beskrevet i tabel 1. Resuspend perler i 60 µL af MNase reaktionsblanding af blid pipettering. Ryst prøven forsigtigt (20 til 25 rpm) på en pladespiller i en shaker i et Peltier-type inkubator i 15 min. ved 25 ° C.
Bemærk: Det er meget vigtigt at bruge en bølgende shaker og strengt følge hastighedsgrænse i dette trin. Anden form for shakers, såsom roterende blandere, anbefales ikke. - Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten.
- Vaske perlerne to gange med AGC løsning indeholdende 3 mM EGTA: der tilsættes 1 mL af AGC løsning indeholdende 3 mM EGTA til perlerne, bland godt ved at vende røret, og drej prøven i 5 min. ved 4 ° C. Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten. Gentag dette trin en gang.
- Vaske perlerne engang med vaskebuffer 2: der tilsættes 1 mL af vaskebuffer 2til perler, bland godt ved at vende røret, og drej prøven i 5 min. ved 4 ° C. Centrifugeres prøve på 3.300 x g for 0,5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten. Holde perler på isen under opsætningen af RdRP reaktion.
Forsigtig: Udføre alle procedurer RNase-fri betingelser.
- RdRP reaktion
- Forberede en RdRP reaktionsblandingen i en ny tube, som beskrevet i tabel 2.
- Tilføj 6 µL af [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) til blanding og bland godt ved pipettering.
Bemærk: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP eller [α -32P] GTP kan bruges til reaktion i stedet for [α -32P] UTP. - Tilføj 1 µL af skabelon RNA (1 µg/µL) til blanding og bland godt ved pipettering.
Bemærk: For at etablere RdRP assay, anbefales følgende RNA skabelon: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9. - Resuspend perler med 20 µL af RdRP reaktionsblandingen fra trin 3.4.3 af pipettering.
- Ryst prøven forsigtigt (20 til 25 rpm) på en pladespiller i en shaker i et peltier-type inkubator i 2 timer ved 32 ° C.
- Tilføje 5.4 µL af Proteinase K (20 mg/mL) og 45,4 µL af 2 x Proteinase K buffer til reaktionsblandingen. Mix af pipettering og ryste (20 til 25 rpm) prøven på en pladespiller i en Peltier-type inkubator i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilføje 109.2 µL af RNase-fri vand til prøven.
- Tilføje 200 µL af syre phenol-chloroform til prøven. Bland godt af vortex, og derefter centrifugeres prøve på 21,100 x g i 5 min ved stuetemperatur. Overføre den vandige fase til en ny tube. Gentag dette trin en gang.
- Tilføj 20 µL 3 M natriumacetat (pH = 5.2), 4 µL af nedbør luftfartsselskab og 250 µL af ethanol til vandfasen. Ryst rør godt for blanding og derefter centrifugeres prøve på 21,100 x g i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Vaske pellet med 300 µL koldt 70% (vol/vol) ethanol opbevares ved-20 ° C. Centrifugeres prøve ved 21,100 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og lufttørre pellet.
Forsigtig: Udføre alle procedurer RNase-fri betingelser.
Bemærk: Pellet fra trin 3.4.11 kan opbevares ved-20 ° C i mindst 2 dage.
- RNase behandling
- Resuspenderes fra trin 3.4.11 i 20 µL af RNase-fri vand.
- Forberede en RNase reaktionsblandingen i en ny tube, som beskrevet i tabel 3.
- Tilføj 180 µL af RNase reaktionsblandingen til prøven, og Inkuber rør i 2 timer ved 37 ° C.
- Tilføje 2,3 µL af 10% (vol/vol) SDS til prøven og der inkuberes i 15 min. ved 37 ° C.
- Tilføje 2 µL af Proteinase K (20 mg/mL) til prøven og der inkuberes i 15 min. ved 37 ° C.
- Tilføje 205 µL af syre phenol-chloroform til prøven. Bland godt af vortex, derefter centrifugeres prøve på 21,100 x g i 5 min ved stuetemperatur. Overføre den vandige fase til en ny tube.
- Tilføj 20 µL 3 M natriumacetat (pH 5,2), 4 µL af nedbør luftfartsselskab og 250 µL af ethanol til vandfasen. Ryst rør godt for blanding og derefter centrifugeres prøve på 21,100 x g i 20 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
- Vaske pellet med 300 µL koldt 70% (vol/vol) ethanol opbevares ved-20 ° C. Centrifugeres prøve ved 21,100 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og lufttørre pellet.
Bemærk: Pellet fra trin 3.5.9 kan opbevares ved-20 ° C i mindst 2 dage.
- Gelelektroforese og Autoradiografi
- Resuspend prøven med 20 µL af RNase-fri vand.
- Tilføj 20 µL af 2 x loading bufferen.
- Kog prøven i 10 min. ved 95 ° C. Knuse prøve på isen.
- Kør gelen. I tilfælde af template-størrelsen er 34 nts (Se også trin 3.4.3), bruges 7 M urinstof - 10% polyacrylamid gel til denaturering gelelektroforese.
- Tørre gel med en gel tørretumbler.
- Udsætte film til tørret gel inden for en X-ray kassette med en intensivere skærm ved-80 ° C.
Representative Results
Med skabelonen anbefalede RNA er radioaktive RdRP produkter observeret mellem 20-30 nukleotider (nt) specifikt i HeLa celler i mitotiske fase efter natten eksponering (figur 1A). Typisk, signal intensiteten af RdRP produkterne demonstrerer to toppe, der er placeret omkring 25 nt og 30 nt i tråd med den størrelse distribution af produkterne bekræftet af næste generation sequencing9. I modsætning til mitotiske celler demonstrere HeLa celler uden synkronisering næsten manglende 20 – 30 nt radioaktive produkter. Oval signaler, der er placeret under 20 nt i alle prøver er uspecifik driver.
Hvis det er der kun en ~ 30 nt produkt med svagt signal i mitotiske HeLa celler, indikerer det, at RdRP reaktion ikke gå godt. For eksempel, hvis der MNase behandling udføres groft og uhensigtsmæssigt signal intensiteten i mitotiske HeLa celler falder betydeligt (figur 1B). RdRP reaktion udført med gamle HMD løsning reducerer også produkter (figur 1 c).
Figur 1 : Repræsentant RdRP produkter af endogene TERT i mitotiske HeLa celler. (A) tre repræsentative resultater af IP-RdRP analysen i HeLa celler behandles med nocodazole (manipuleret) eller DMSO (unmanipulated). De kemisk syntetiseret 34 nt RNA blev brugt som en skabelon. (B) IP-RdRP assay i mitotiske HeLa celler udføres med upassende MNase behandling. (C) IP-RdRP assay i mitotiske HeLa celler udføres med enten friske eller gamle HMD løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagenser | Volumen |
| Micrococcal nukleasen, 20 U/µL | 1 ΜL |
| Micrococcal nukleasen Buffer, 10 x | 8 ΜL |
| RNase-fri vand | 51 ΜL |
Tabel 1: MNase reaktion mix komponent.
| Reagenser | Volumen |
| CHAPS, 0,07% (wt/vol) | 6 ΜL |
| HMD løsning | 2 ΜL |
| rATP, 80 mM | 0,5 ΜL |
| rGTP, 8 mM | 1 ΜL |
| rUTP, 0,4 mM | 1 ΜL |
| rCTP, 8 mM | 1 ΜL |
| RNase inhibitor, 40 U/µL | 0,5 ΜL |
| RNase-fri vand | 1 ΜL |
Tabel 2: RdRP reaktion mix komponent.
| Reagenser | Volumen |
| RNase ONE ribonuklease, 10 U/µL | 0.2 ΜL |
| Reaktion Buffer, 10 x | 20 ΜL |
| RNase-fri vand | 159.8 ΜL |
Tabel 3: Ribonuklease reaktion mix komponent.
Discussion
IP-RdRP-analysen er en følsom metode til at påvise RdRP aktiviteten af menneskelige TERT. TERT protein er stærkt udtrykt i mitotiske HeLa celler, hvor TERT danner RdRP komplekse8,9,10. Dette tyder på, at mitotiske HeLa celler er en optimal materiale til at opdage RdRP aktivitet. I den protokol, der er beskrevet ovenfor, mitotiske og ikke-synkroniseret HeLa celler er inkluderet som et positivt og et negativt eksempel, henholdsvis. Som vist i figur 1A, RdRP assay produkter fra skabelonen anbefalede RNA i mitotiske HeLa celler Vis brede radioaktive signaler mellem 20 til 30 nt. Ud over HeLa celler, vi har udført assay med forskellige typer af cellelinjer, og fandt, at signal mønsteret kan ændres i forskellige celle typer9: nogle viser et stærkt signal kun omkring 30 nt, nogle viser et tilsvarende mønster med HeLa celler. Vi har også udført assay med RNA skabeloner end de 34 nt skabelon8, korte og lange (~ 300 nt) RNA'er med forskellige sekvenser, og med held fremstillet RdRP produkter fra disse skabeloner, selv om der kan være nogle præference. For det første forsøg, men anbefaler vi at bruge HeLa celler i mitotiske fase og skabelonen 34 nt RNA. RdRPs kan generere dobbelt-strenget RNA både en primer-afhængige og en primer-uafhængig måde11. Vi har rapporteret, at TERT bevarer denne egenskab som menneskelige RdRP7,9; TERT syntetiserer dsRNA fra en RNA skabelon med 3'-foldback struktur gennem en back-priming mekanisme7. For skabelonen 34 nt RNA syntetiserer TERT supplerende tråde uden brug af primere9. Specifikt påvise RdRP produkter syntetiseret i en primer-uafhængig måde, dvs de novo syntetiseres RNA produkter, [α -32P] NTP kan erstattes med [γ -32P] NTP i RdRP reaktion9.
MNase behandling af TERT immunkomplekser på perler er et afgørende skridt til at opnå ønskede resultater. Hvis MNase behandlingen er udført for længe eller med intensiv ryster, reduceres RdRP produkter bemærkelsesværdigt. For at undgå sådanne problemer, anbefaler vi kraftigt, til nøje for at følge protokollen nøje. HMD løsning er en anden afgørende faktor for succes. Hvis du finder, at signalerne er meget svag, erstatte HMD løsning til en nypræparerede.
Hele protokollen, bør man tage stor forsigtighed for at undgå RNase forurening. Ribonuklease behandling bør udføres med dedikeret udstyr. Efter manipulere ribonuklease, man bør kassere tips og rør med RNase straks, fjerne RNase med specialiserede løsning (fx RNase stille), og ændre Lunde.
TERT interagerer med ikke kun TERC men også mange slags endogene RNA'er, og vi har rapporteret en del af dem7. Ændring i IP-RdRP analyse, såsom IP-RdRP analysen uden MNase behandling, vil give en fuld liste af endogene RNA skabeloner til TERT-associerede RdRP aktivitet og bioinformatic guide på deres sekvens funktioner. Vi har med succes anvendt denne protokol til væv lysate. Fordi TERT udtrykkes i en bred vifte af normal og tumor væv, kan denne analyse være nyttigt at undersøge ikke-kanoniske enzymatisk funktion af TERT i human.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af projektet til udvikling af Innovative forskning i kræft Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) og projektet for kræftforskning og terapeutiske Evolution (P-Opret) (16cm 01061150001, K.M.) fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED; Takeda Science Foundation (Y.M.); Tilskud af prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); og JSP'ER KAKENHI tilskud antal JP16K07133 (Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
| Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
| Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
| Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
| Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
| Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
| Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
| Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
| Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
| Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
| Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
| cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
| Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
| 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
| Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
| rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
| [a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
| RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
| Proteinase K | Takara | 9033 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
| 3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
| Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
| RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
| Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
| Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
| CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
| Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
| Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
| Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
| Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
| Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
| MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
| Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
| Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |
References
- Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
- Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
- Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
- Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
- Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
- Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
- Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
- Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
- Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
- van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).
