Summary
Utvikling av mer effektive behandlinger er nødvendig å kompensere behovene til denne pasienten befolkningen alkohol bruk lidelse (AUD) er et stort nasjonale helseproblem. Dette benytter følgende protokollen to enkle gnager drikking modeller for å vurdere prekliniske effekten av bly anti-alkohol forbindelser.
Abstract
Alkohol bruk lidelse (AUD) er et stort problem med mer enn rundt 76 millioner mennesker verden over møte de diagnostiske kriteriene. Gjeldende behandlinger er begrenset til tre FDA-godkjente som er stort sett ineffektiv selv når kombinert med psykososial intervensjon, som det fremgår av høy tilbakefall rate. Som sådan, representerer Søk etter flere nye behandlinger en viktige mål. Dette følgende protokollen utnytter to enkle gnager drikking modeller for å vurdere prekliniske effekten av bly anti-alkohol forbindelser: to-flaske valg (TBC) og drikker i mørket (DID). Den tidligere kan mus til frivillige drikk i moderasjon mens sistnevnte induserer mus til frivillig konsumerer store mengder alkohol på kort som etterligner overstadig drikking. Enkel og høy gjennomstrømning natur begge disse paradigmer tillate rask screening av farmakologiske agenter eller identifisere stammer mus som viser enkelte frivillige drikking oppførsel.
Introduction
For siste 25 pluss år, betydelig innsats har blitt satt mot å utvikle medisiner for behandling av alkohol bruk lidelse (AUD)1. Selv om mange fremskritt er gjort, AUD fortsatt et stort offentlig helseproblem, påvirker over 18 millioner amerikanere, og koster over $220 milliarder årlig2,3. Foreløpig er det bare tre FDA-godkjente, disulfiram, naltrexon og acamprosate, som har gitt inkonsistente resultater i kliniske forsøk og begrenset suksess selv når kombinert med psykososial intervensjon i klinikken innstillingene 4 , 5 , 6 , 7.
Hovedårsak for feil på gjeldende AUD terapi er koblet til AUD8heterogene natur. Mens både miljø og genetiske faktorer som bidrar til utvikling av AUD, utgjør heritability anslagsvis 50-60% av risikoen for utbruddet9. Lik behandling av depresjon, det er allment akseptert at pasienter som lider av AUD må en rekke medisiner som er tilpasset behovene til hver pasient10.
Klart, det er et presserende behov for mer effektive behandlinger som vil bli lettere hvis den allerede vanskelige og tidkrevende prosessen med stoffet funnet var strømlinjeformet3. Dette viser følgende protokollen prekliniske anvendelse av to gnager drikking modellene brukte undersøke nevrobiologiske grunnlaget for AUD11. Mer spesifikt, metoden innført her kan vurdere effekten av kandidaten forbindelser redusere alkohol forbruk i både "moderat" og "overstadig drikking" scenarier bruker to-flaske valg (TBC) og drikking i mørke (DID) paradigmer, henholdsvis. Begge paradigmer undersøke ikke-operant etanol selv administrasjon, der mus ingest etanol muntlig og på vilje, og derfor illustrere høy ansikt og konstruere gyldighet som en modell av menneskelig alkoholisme11.
TBC drikking, også kjent som fritt valg drikking, preferanse drikke, eller sosiale drikke, er to flasker løsning kontinuerlig tilgjengelig i hjem buret. En flaske inneholder vann, og det andre inneholder en utvannet løsning av etanol, der konsentrasjonen av etanol kan varieres (f.eks., 5-30% v/v)11,12. Mus har konstant tilgang til både flasker, og derfor kan velge hvor mye å drikke fra hver flaske.
Denne modellen vurderer etanol forbruket av hver mus (g/kg), samt etanol preferanse ratio (volum etanol fortært ÷ totale volumet væske fortært). Det brukes rutinemessig sammenligne drikking nivåer over ulike stammer mus, eller etter en bestemt genetisk manipulasjon (f.eks., gene knockout eller knockdown) og resultater i blod etanol konsentrasjoner (BECs) ligner det som er funnet i mennesker når drikker i moderasjon13,14.
I DID prosedyren 3t etter starten av mørke syklusen, utveksles hjem bur flaske vann med en flaske av 20% (v/v) etanol løsning for begrenset adgang drikke økten. Drikking økter oppstå som rad 4-dagers syklus, varig 2t på dager 1-3 og 4 h på dag 4. Dager 1-3 tjene som en alkohol-habituering periode før testing på dag 4. Følgelig mus pålitelig bruker nok etanol for å oppnå BECs > 100 mg/dL og resultatet forevise opptreden effekten av forgiftning i mennesker som er overstadig13,14,15. Vann tilgang er tilgjengelig på alle tider enn drikking økten.
Det finnes flere varianter av begrenset tilgang drikking. For eksempel i intermittent adgang modellen får mus to flasker (en som inneholder vann og andre med 20% (v/v) etanol) på mandag, onsdag og fredag med en 24 h og 48 h uttak periode hverdager som helger, henholdsvis16. Etter flere uker med intermittent adgang, musene vil gradvis og eskalere frivillig drikke nivåer, til slutt oppnå BECS ligner det er observert i DID modellen. DID, men synes å være mest brukte modell å vurdere overstadig-lignende drikking oppførsel. Andre modeller av uregelmessige drikker finnes, men de avhengige begrense tilgang til mat eller damp kammer indusert økning i frivillig selv-administrasjonen, som gjør dem mindre representant frivillige menneskelige alkohol forbruk16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av University of Southern California Health Sciences Campus.
1. eksperimentelle oppsett og montering
- Skaffe alle følgende tilbehør og kjemikalier før starten av studien: mus, bur/metal bur topper, sengetøy, mat, vann, etanol, Pipetter for flergangsbruk, sipper topper, krympe wrap, verktøyet kniv, zip bånd, bånd, bunsenbrenner, skala, hodelykt.
- Få C57BL/6J mus, enten fra en kommersiell kilde eller et internt kolonien, husk at mus kan gruppen plassert før tiden av testing.
Merk: Antall mus anskaffet, avhengig av kompleksiteten av eksperimentell design. Planlegg å imøtekomme omtrent 12-15 mus per gruppe, pilotstudier ikke mindre enn 5-7 mus per gruppe. I representant resultatene nedenfor benyttet vi en enkel to-gruppe oppsett for å vurdere årsak-virkning forholdet ved hjelp av en enkelt dose (5 mg/kg) av stoffet (MOX). - Følg trinnene nedenfor for å samle flasker18.
- Varme verktøyet kniv med en Bunsen-brenner.
- Bruker denne kniven, kuttet omtrent en tomme av toppen og bunnen ender en plast 18 mL serologisk pipetter.
- Legg merke til at mindre volum Pipetter for flergangsbruk (dvs, 10 mL) kan også brukes til å øke presisjonen for målingen.
- Varm Pipetter under varmepistol.
- Kulelager sipper røret inn "bunnen" slutten av Pipetter (altså åpningen nærmest 18 mL dash-linje).
- Forsegle sipper røret på plass med krympe wrap ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig shrink wrap pistol.
- Hetten av andre åpningen med en silikonpluggen.
2. dyr habituering
- Begynnelsen minst 1 uke før startdatoen for eksperimentet, overføre mus til rommet der de eksperimentelle prosedyrene er utføres slik at de kan akklimatisere dyrehold forhold (inkludert omgivelsestemperatur (21 ± 1 ° C) og 12-h omvendt lys/mørke syklus, med lys av klokken 12). Husk å følge retningslinjene for institusjonelle og varsle de riktige kanalene før dyr fra ett sted til et annet.
- Hvis mus overføres fra en standard lys/mørke syklus kan 2 uker mer habituering tid.
- Fyll de nylig gjort flaskene til randen med vann. Kontroller at lokket er stengt sikkert og uten luftbobler eventuelle lekkasjer fra tuten. Hvis løsningen er lekker, re sikker cap. Fjern eventuelle luftbobler ved å trykke på flasken slik at luft kan flykte røret.
- Ved ankomst, enkelt huset hver musen i standard polykarbonat/polysulfone bur med sengetøy og en metall rutenettet bur topp; fjerne buret lokket som ikke lenger brukes.
- Gir tilgang til mat og water bottle(s) ad libitum.
- Sikre hver flaske bur øverst ved innpakning plast zip slips rundt hver flaske å holde det på plass. Trim alle overflødige plast fra zip slipset å sikre at det ikke stikke inn i bur.
Merk: For drikking i mørke (DID) prosedyren, bare en enkelt flaske vann er nødvendig. Habituering til to flaske valg (TBC) paradigmet, krever imidlertid at buret opplegget inkluderer to flasker med vann. Hvis metall rutenettet hopper gitt er beregnet for bare en enkelt flaske løsning, Bøy forsiktig fra hverandre sine barer å lage plass til en ekstra plate å tilpasse andre flasken TBC.
- Definer minst 3 musen gratis kontroll burene. Dette vil tillate overvåking av væske tap forårsaket av fordampning eller søl fra flasker, som er bare en naturlig forekomst som skjer som burene er plassert på og av buret stativet (se trinn 2.6.3 og 3.6.1 4.6.1 for ligninger).
- Begynnelsen på dag 4 av 1 ukes én bolig acclimation, måle og registrere daglig kropp og mat vekten av hver mus, med en skala, (i gram) samt vanninntaket, bruke etsninger sammen med invertert flasken registrere det høyeste punktet i menisk (i mL).
- Mens det er vanlig vitenskapelig praksis å lese det laveste punktet på den konkave meniscus, fordi flaskene forbli i en invertert under målingen, registrere det høyeste punktet på meniscus.
- Vurdere parameterne for 2.5 bruke formlene nedenfor:
- Måle kroppen vekt endring (g): vekten av dagens (g) - vekten av dagen (g).
- Måle matinntaket (g): vekten av mat på dagen (g) - vekt av mat på dagens (g).
- Måle vanninntaket (mL): [volum av vann på dagens (mL) - volum av vann på dagen (mL)] - gjennomsnittlig vanntap fra alle kontroll bur (mL).
- Gjenta trinn 2.5 fortløpende, på dager 5-7, for at fastsetting av en plan for tre dager umiddelbart før innføringen av etanol. Hvis en etterfølgende innspilling ikke kan innhentes, utvide acclimation perioden å tillate evaluering av opprinnelige mål.
- Når vanninntak har stabilisert til ± 10% variasjon fra gjennomsnittet av de siste 3 dagene, begynn etanol tilgang med TBC (ubegrenset tilgang) eller DID (begrenset tilgang).
Merk: På sjeldne anledninger, én til to ekstra dager kreves for fag å oppnå stabilitet; ikke vær bekymret hvis tid er nødvendig for verdiene vise ±10% variasjon fra gjennomsnittet av de siste 3 dagene.
3. 24-timers to flaske valg (TBC)
Merk: En skjematisk er utarbeidet i figur 1.
- Forberede en 10% (v/v) etanol løsning med 500 mL volum ved å legge 52.65 mL 190 bevis korn etanol (~ 95% etanol) 447.35 mL H2O; Husk å riste grundig. Gitt at etanol fordamper raskt, erstatte løsningen i hver 3-4 dagers intervall.
Merk: Andre konsentrasjoner av etanol kan brukes også, men forfatterne anbefaler en 10% konsentrasjon for denne modellen. - Den første dagen av TBC, (dag 8 tidligst) tom 1 av de 2 vannflasker, i hver bur, og fyll den til randen med nylagede etanol løsningen. Gitt at etanol og vann er vanskelig å skilles visuelt, klart etiketten med et tilsvarende innholdet. Bare bruke et stykke maskering tape til flasken og merking det med en penn eller ved å skrive direkte på flasken.
- Legge til flere løsning vannflaske, etter behov.
- Plasser flasker på buret, sørge for at bokstaver er ordentlig lukket og fri for luftbobler eventuelle lekkasjer fra tuten. Hvis løsningen er lekker, re sikker cap. Fjern eventuelle luftbobler ved å trykke på flasken slik at luft kan flykte flasken.
- Alternative plasseringen av flaskene annenhver dag å riktig for betinget sted preferanse relatert påvirker i drikke aktivitet (se diskusjon for mer).
- I tillegg til daglige målinger fra 2.5 og 2.6, som har pågått, begynne å lese og ta etanol inntak nivåer også. Analysere 10% etanol inntak og preferanse ratio hjelp av følgende formler:
- Måle 10% etanol inntak (mL): [volum av etanol på dagens (mL) - volum av etanol på dagen (mL))]-gjennomsnittlig etanol tap fra alle kontroll bur (mL).
- Måle 10% etanol inntak (g/kg): [10% etanol inntak (mL) x 0.07893 g/mL] / body vekt (kg).
- Måle preferanse %: [10% etanol inntak (mL) / vann (mL)] x 100.
- Så snart etanol inntak har blitt stabil, administrere en enkelt kontroll (saltvann) intraperitoneal (IP) injeksjon (0,01 mL/g kroppsvekt) hver musen under måling hverdagen. På denne måten bli fag vant til injeksjon selv.
- Stabilitet er definert som ± 10% variasjon fra gjennomsnittet av de siste 3 dagene (samme som i delen 2.8).
Merk: Det kan ta opptil 1 uke for etanol nivåer å stabilisere. Dette gjelder spesielt hvis mus brukes igjen fra en tidligere eksperiment og har hatt tidligere eksponering for etanol. Kontrollen er bare løsemiddelet brukes å oppløse stoffet.
- Stabilitet er definert som ± 10% variasjon fra gjennomsnittet av de siste 3 dagene (samme som i delen 2.8).
- Når en etanol grunnlinjen med lav variasjon er gjenopprettet, delt musene i dosering gjennomsnittlig grupper ved hjelp av etanol inntak verdiene slik at alle grupper har omtrent like etanol inntak verdier.
- Angi en gruppe som kontrollen (fortsetter å motta saltvann) og den andre som den eksperimentelle (IP injeksjon av undersøkte 0,01 mL/g av kroppsvekt). Starte daglig narkotika dosering, enten for en akutt eller multi-dagers varighet. Deretter kan kontrollen være å teste etter narkotika effekten (valgfritt).
Merk: Fordi drikke overvåkes over lengre 24-h, er ikke tiden for dose administrasjon avhengig av mørke syklus.
- Angi en gruppe som kontrollen (fortsetter å motta saltvann) og den andre som den eksperimentelle (IP injeksjon av undersøkte 0,01 mL/g av kroppsvekt). Starte daglig narkotika dosering, enten for en akutt eller multi-dagers varighet. Deretter kan kontrollen være å teste etter narkotika effekten (valgfritt).
4. drikking i mørket (gjorde)
Merk: En skjematisk er utarbeidet i Figur 3.
- På hver dag for planlagte etanol (1-4 dager) Registrer målinger, for vann volumet, matinntaket og kroppsvekt og utføre medikamentprotokoller. Gjør dette i en forhåndsvalgt tid under lyset syklus som er valgt i henhold til farmakokinetikken av stoffet slik at sammensatt er på / eller nærmer seg maksimal hjernen konsentrasjonen i drikking perioden.
Merk: Husk dager 1-3 er ment å acclimate bare at mus til å drikke store mengder etanol i en kort periode. Mens mus ikke nå BEC nivåer sammenlignes med den menneskelige 0,08; disse "trening" dager sikre at på dag 4, i litt lenger drikke økt, de vil faktisk drikke til det nivået.- Gi alle mus kontrollen (saltvann) dager 1-3, og kontroll eller narkotika på dag 4. Denne DID prosedyren oppstår over span av 3 uker med et pre stoff (uke 1), stoffet (uke 2), og etter narkotika (uke 4) drikker økten.
- Merk: Legg merke til at i løpet av medikamentprotokoller uken, dag 3 etanol inntak nivåer brukes til å tilordne mus til enten gruppen kontroll eller narkotika på en måte hvor etanol inntak nivåer av begge grupper har minst variasjon. Dette er ulikt TBC, som tilordner grupper basert på en 3 dagers gjennomsnitt.
- Forberede en 20% (v/v) etanol løsning (20E) med 500 mL volum ved å legge 105.25 mL 190 bevis korn etanol (~ 95% etanol) 394.75 mL H2O; Husk å riste grundig.
- Fyll etanol flaskene før starten av drikking økten slik at så snart DID begynner vann flaskene bare kan erstattes med alkohol flaskene.
- Under hele DID økten (trinn 4.5-4.8), kan du bruke rødt hodelykt som ikke forstyrr dyrene.
- Ved starten av DID drikke økt, planlagt å starte 3 timer i mørke syklusen, registrere volumet av vann for hver musen. Deretter erstatte hver vannflaske med en flaske 20E løsningen og registrere Start etanol volumet.
- Lese og ta det endelige etanol volumet 2 timer senere, på slutten av drikking økten på dager 1-3 og 4 timer senere på dag 4. Analysere 20% etanol inntaket ved hjelp av følgende formler.
- Måle 20% etanol inntak (mL): [volum av etanol på slutten av økten (mL) - volum av etanol starten av drikking økten (mL) å drikke] - gjennomsnittlig etanol tap fra alle kontroll bur (mL).
- Måle 20% etanol inntak (g/kg): [20% etanol inntak (mL) x 0.15786 g/mL] / body vekt (kg).
- På dag 4, umiddelbart etter at etanol volumer, og før re-introdusere tilgang til vann, samle blod for å vurdere blod etanol konsentrasjonen av hver mus (valgfritt).
Merk: Noen ikke-terminal blod samling metoden kan brukes for eksempel retro-orbital sinus blod samling eller saphenous stemning blod samling. Nyttig protokoller se referanser for Parasuraman et al. 21 og Yardley et al. 20.- Utføre analyse ved hjelp av ulike metoder, inkludert LCMS eller kommersielt tilgjengelige maskiner (se Tabell for materiale).
- Erstatt alle etanol flasker med vannflasker og registrere vann volumet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I de følgende representative undersøkelsene, var sosiale drikking modellert bruker to-flaske valg (TBC) paradigmet. Kort, mus hadde tilgang til to flasker løsning, en som inneholdt vann, og den andre en 10% (v/v) etanol løsning. Fagene ble deretter delt og jevnt tildelt narkotika behandlingsgrupper, moxidectin (MOX) vs saltvann kontroll, slik at hver gruppe ville gjennomsnitt etanol inntak nivåer med minst variasjon.
Første opprinnelige 10E inntaket i 24-h perioden stabilisert på 14.46 ± 1,85 g/kg (n = 8) før injeksjoner begynte, og senere re stabilisert 14.14 g/kg legge saltvann injeksjoner. For å vurdere effekten av en akutt dose (5 mg/kg) av MOX på etanol inntak og preferanse, var drikke aktivitet vurdert pre MOX, MOX og post MOX. Vi fant at en enkelt dose av MOX betydelig redusert alkoholinntak over 45%, sammenlignet med pre MOX injeksjoner [F (2, 22) = 26.33, p < 0,0001] (figur 2A), og preferanse [F (2, 14) = 17.35, p < 0,0001] (figur 2B ) over 30%. 10E inntak og preferanse både var betydelig lavere enn saline dag umiddelbart etter MOX behandling (ved mer enn 25% og 15% henholdsvis) vises som bokfører MOX injeksjoner i figur 2).
I en upublisert pilotstudie, var overstadig drikking modellert bruk av drikkevann i mørke (DID) prosedyren der mus daglig hadde begrenset tilgang (2t) en flaske som inneholder 20E begynnelsen 3-h i circadian mørke fasen, for 3 dager, med en lengre periode (4 h) på dag 4 (Figur 4). Kvinnelige mus (n = 12, 6 mus/gruppe) ble administrert saltvann injeksjoner (IP) på dager 1-4 med planlagte 20E etablert på dag 4 (pre stoff). På dager 1-3 i 2nd ukentlig syklus, alle mus fikk enda en daglig saltvann injeksjon. Etanol inntak verdiene fra dag 3 ble da brukt dele musene i to grupper (n = 6 / gruppen) som deretter mottatt enten en injeksjon (IP) av MOX (5 mg/kg) eller saltvann på dag 4 (narkotika). Følgende uke alle mus mottatt daglig saltvann injeksjoner på dager 1-4 og etanol inntak ble målt igjen på dag 4 (post narkotika). Akutt administrasjon av 5 mg/kg MOX ble analysert og funnet betydelig redusert alkoholinntak over 54%, sammenlignet med pre narkotika injeksjoner (t = 7.635, p < 0,0001)
Figur 1 . To-flaske valg skjematiskKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . To flaske valg (TBC). MOX (5 mg/kg) reduserer 10% v/v etanol (10E) inntak (A) og preferanse (B) i kvinnelige C57BL/6J mus med en 24-h access to-flaske choice paradigme. Etter å oppnå stabil drikking nivåer for 3 dager, ble MOX administrert. Stolpene angir gjennomsnittlig 10E inntak nivåer fra dagen før MOX injeksjon (hvit; Pre MOX), dagen i MOX injeksjon (svart. MOX) og dagen etter MOX injeksjon (grå; Innlegg MOX). Verdiene representerer den gjennomsnittlig ± SEM for 12 mus. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, og *** P < 0,0001 versus Pre MOX (venstre vannrette linjen) eller legge MOX (høyre vannrett linje), Tukey er flere sammenligning innlegg-hoc test. Endret fra Huynh N. et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Drikking i mørke skjematiskKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Drikking i mørket (gjorde). MOX (5 mg/kg) reduserer 20% v/v etanol (20E) inntak i kvinnelige C57BL/6J mus med en drikke i mørke paradigmet. Barer representerer gjennomsnittlig 20E inntak nivåer på uken før MOX injeksjon (pre stoff), uken MOX injeksjon (narkotika) og uken etter MOX injeksjon (etter rusmiddel). Verdiene representerer den gjennomsnittlig ± SEM for 12 mus (6/gruppe) mellom saline og MOX grupper. P < 0,0001 versus pre narkotika (venstre vannrette linjen) eller etter stoff (høyre vannrett linje), Tukey er flere sammenligning innlegg-hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verdensomspennende anslag tyder på at som 76 millioner mennesker oppfyller kravene til å rettferdiggjøre en diagnose for alkohol bruk lidelse (AUD). Dessverre farmasøytiske behandlinger tilgjengelig er stort sett ineffektiv og videre utvikling er nødvendig å kompensere behovene til denne kliniske befolkningen20. Dette følgende protokoll som mål å forenkle denne bestrebelsen ved exemplifying to av de mest grunnleggende gnager drikke paradigmer: to-flaske-valg (TBC) og drikker i mørket (DID). Begge modellene måle ikke-operant selv-administrasjonen av etanol, der mus ingest etanol muntlig. I TBC er paradigme, etanol (10% v/v) og vann begge tilgjengelig kontinuerlig, som resulterer i relativt lav blod etanol nivåer som er en konsekvens av en episodisk og gradvis etanol forbruk mønster. Denne modellen er best for å vurdere lavere nivåer av etanol som en preferanse tastant og derfor sies å ligne menneskelig "moderat" drikking. Figur 2 ovenfor viser representant resultater for TBC paradigmet.
På den annen side, i DID er modell etanol (20% v/v) bare tilgjengelig for en begrenset tid. I motsetning til TBC vurderer denne modellen effekten av et sammensatt på behaviorally relevante konsentrasjoner av etanol, utnytter det faktum at C57BL/6J mus vil forbruke store mengder etanol svært raskt i den mest aktive fasen av deres circadian syklus. Disse drikking økter oppstå i 4 påfølgende dager, begynner på 3rd h i mørke syklusen, med en varighet på 2 timer på dager 1-3 og 4 h på dag 4. Bruker denne fremgangsmåten, mus typisk konsumere nok etanol for å oppnå BECs > 100 mg/dL og vise atferd bevis for forgiftning. Vår representant resultater for DID paradigmet er vist i Figur 4. Selv om vi ikke hadde måle BECs for disse musene, er drikking nivåene lik de som er rapportert i litteraturen som oppnådd BECs over 100 mg/dL13,14,15.
Begge paradigmer har begrensninger. Ved tilfeller når muntlig gavages er den foretrukne metoden for administrasjon for farmakologiske tester av bly forbindelser, kan esophogeal traumer forårsaket av prosedyren hindre etanol selv-administrasjonen i begge paradigmer. Dette gjelder spesielt for den DID modellen, som bruker en høyere konsentrasjon av etanol (20%) og som kan finnes tilfeller hvor farmakokinetikken av stoffet krever drikking økten begynne før dyr har hatt tilstrekkelig tid til å komme seg fra den prosedyre. Dette ville være tydelig i en kontrollgruppe drikking på nivåer som svarer til BECs godt under det forventede 0,08. I vår lab, har vi opplevd problemer med kraft feedings både med DID og TBC. Vi klarte å omgå disse problemene ved å formulere våre forbindelser slik at de kan leveres med en muntlig oppløsning tynn stripe (ODS)19.
Videre i DID modellen spesielt gitt at etanol tilgang perioden er så kort varighet, medikamentprotokoller må gjøres i en forhåndsvalgt tid under lyset syklus som er valgt i henhold til farmakokinetikken av stoffet slik at den sammensatte på / eller nærmer seg maksimal hjernen konsentrasjonen i drikking perioden. Hvis en farmakokinetisk analyse ikke kan utføres, ville en alternativ tilnærming være å gjennomføre en tid kurs vurdering av atferdsmessige virkningene av stoffet med TBC. Etter denne logikken, ved overvåking av drikking aktivitet på timebasis, og bestemme toppen anti-alkohol effekter, en kan rimelig strategi når narkotika bør være administrert19.
Mens feltet av alkoholisme har ulike dyr modeller å undersøke de forskjellige fysiologiske og behavioral aspektene av AUD8, beskriver følgende protokollen to brukte paradigmer, som tillater sammenligninger av resultater over laboratorier. En annen fordel er at disse metodene er enkel, gjør det praktisk å bruk under akutte og kroniske studier ligner på eksemplene ovenfor. I tillegg, i motsetning til andre brukte alkohol paradigmer, som kan opereres forfatning og damp kammer paradigmer, kan metodikk vi har beskrevet her utføres uten behov for spesialleketøy utstyr. Anecdotally, er det sannsynlig at nesten alle komponenter av drikking apparater kan finnes i en prototypiske institusjonelle vivarium. Det finnes også ulike måter å endre protokollene beskrevet her slik at de kan best passer målene for hvert eksperiment. For eksempel, er vår DID prosedyre best for testing de akutte virkningene av et medikament på en enkelt drikking økt (dagtid dag 4). Vi har imidlertid vist at flerdags medikamentprotokoller kan vurderes ved å utvide drikking økter til 4 dager med 2 timers tilgang, i motsetning til gjeldende 2 timer tilgang på dager 1-3 og 4 timer på dag 419. Mus kan også overføres fra en paradigme til en annen, eller re-testet for flere doser / ulike forbindelser, med en enkel 1-2 uke bleke periode i mellom.
Det bør nevnes at narkotikainduserte endringer i drikkevaner observert gjennom metodene må undersøkes grundig for å fastslå om effektene er selektiv for alkohol eller om de kan være et resultat av toksisitet. For mer informasjon om kontroller henvises leseren til Yardley et al. 20 ingen enkelt mønster kan modell alle aspekter av denne tilstanden. I stedet undersøker hver paradigme vanligvis noen av de viktigste attributtene tilknyttet AUD. TBC og DID modellene som er beskrevet her, har vært knyttet til overstadig/rus scenen av avhengighet syklus. For en mer grundig forståelse om nytten av sammensatt, skal flere prekliniske drikking modeller benyttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DLD og LA er oppfinnere på patent gjenbruk av ivermectin og relaterte avermectins for behandling av alkoholbruk lidelser. Forfatterne har ingen andre konflikter av interesse og er ansvarlig for vitenskapelige innholdet på papiret.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet, delvis av forskning gir SC CTSI NIH/NCRR/NCATS - UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) og USC School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
