Summary
Alkol kullanım bozukluğu (AUD) büyük bir ulusal sağlık sorunu ve daha etkili tedaviler gelişimi bu hasta nüfusun ihtiyaçlarını karşılamak için gerekli. Bu amaçla, aşağıdaki protokol kurşun Anti-alkol bileşikler preklinik etkinliğini değerlendirmek için iki basit kemirgen içme modelleri kullanır.
Abstract
Alkol kullanım bozukluğu (AUD) ile önemli bir sorun daha fazla dünya çapında tanı ölçütlerine yaklaşık 76 milyon kişi. Mevcut tedaviler bile psikososyal ile birlikte yüksek tarafından belirgin olduğu gibi müdahale, nüks oranı büyük ölçüde etkisiz üç FDA onaylı ilaçlar için sınırlıdır. Bu nedenle, daha yeni tedaviler için arama bir önemli halk sağlığı hedefi temsil eder. Bu amaçla, aşağıdaki protokol kurşun Anti-alkol bileşikler preklinik etkinliğini değerlendirmek için iki basit kemirgen içme modeller kullanır: iki şişe seçim (TBC) ve karanlıkta (DID) içme. Eski fare ikinci fareler için gönüllü ikna ederken aşırıya kaçmadan gönüllü içecek alkol büyük miktarda içki taklit eden kısa bir süre içinde tüketmek sağlar. Bu paradigmalar her ikisi de basit ve yüksek üretilen iş doğası farmakolojik ajanların hızlı tarama için veya belirli gönüllü içme davranışı sergilemek fareler suşları tanımlamak için izin verir.
Introduction
Son 25 yıl önemli çaba alkol kullanım bozukluğu (AUD)1tedavisi için ilaç geliştirme koymak olmuştur. Her ne kadar birçok gelişmeler yaptık, AUD hala önemli halk sağlığı sorunu 18 milyon Amerikalı etkileyen ve üzerinde 220 milyar dolar mal kalır her yıl2,3. Şu anda orada sadece üç ilaçlar FDA onaylı, ampisilin, naltrekson ve acamprosate, tüm bunların klinik ve sınırlı başarı klinik ayarları psikososyal müdahale ile bir araya geldiğinde bile tutarsız sonuçlar vermiştir 4 , 5 , 6 , 7.
Hataları geçerli AUD tedavisinin başlıca nedeni AUD8hànzú doğaya bağlıdır. Çevresel ve genetik faktörlerin AUD gelişimine katkıda iken kalıtsallığı başlangıçlı9riski için yaklaşık 50-%60 oluşturmaktadır. Depresyon tedavisi için benzer, bu yaygın olarak hastalarda AUD her hasta10ihtiyaçlarını karşılamak için tasarlanmış ilaçlar çeşitli gerekir kabul edilir.
Açıkça, zaten zorlu ve zaman tüketmek oluşum ilaç keşif aerodinamik3olsaydı, kolaylaştırılmış olacaktır daha etkili tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, aşağıdaki iletişim kuralı AUD11nörobiyolojik temeli incelemek için yaygın olarak kullanılan iki kemirgen içme modellerin preklinik Uygulanabilirlik gösterir. Daha ayrıntılı olarak, burada tanıtılan Yöntem alkol azaltmayı aday bileşikler etkinliğini değerlendirebilir tüketimi "Orta" ve iki şişe seçim (TBC) kullanan ve karanlık (DID) paradigmalar içme "tıkınırcasına içme" senaryoları anılan sıraya göre. Her iki paradigmalar sayede fare sözlü olarak ve de olacak, etanol yutmayın ve bu nedenle yüksek yüz göstermek ve geçerlilik insan alkolizm11bir model olarak inşa edimsel etanol öz yönetim, inceleyin.
TBC alkol, olarak da bilinen özgür seçim, içki içme, tercih veya sosyal içme, çözüm iki şişe ev kafeste sürekli olarak kullanılabilir. Bir şişe su, ve diğer etanol, mademki etanol konsantrasyonu çeşitli seyreltilmiş bir çözüm içerir (Örn., % 5-30 v/v)11,12. Fareler her iki şişe için sürekli erişime sahip ve bu nedenle, ne kadar her şişeden içmeyi tercih edebilirsiniz.
Bu model etanol tercih oranı (tüketilen tüketilen etanol ÷ toplam hacim sıvı hacmi) yanı sıra her fare (g/kg), etanol tüketimi değerlendiriyor. Düzenli olarak içme düzeyleri farklı suşları farelerin veya belirli bir genetik manipülasyon sonra arasında karşılaştırmak için kullanılınır (Örn., gen nakavt veya nakavt) ve kan etanol konsantrasyonları (tarafım) insanlarda bulunan için benzer sonuçlar ne zaman ılımlılık13,14' te içme.
DID yordamda, karanlık döngüsünün başladıktan sonra 3 h ev kafes şişe su bir şişe %20 (v/v) etanol çözüm için bir sınırlı erişim oturum içme ile değiştirilir. İçme oturumları 4 gün üst üste 4 günlük döngüsü, kalıcı 2 h gün 1-3 ve 4 h meydana gelir. Gün 1-3 gün 4 test önce bir alkol-habituation dönemi olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, fareler güvenilir tarafım ulaşmak için yeterli etanol tüketecektir > 100 mg/dL ve sonuç olarak,13,14,15içme alem olan insanlarda bulunan zehirlenme davranışsal etkileri sergilemek. Su erişimi her zaman dışında içme oturum mevcuttur.
Sınırlı erişim içme birçok varyasyon vardır. Örneğin, aralıklı erişim modeli, fareler iki şişe (bir içeren su ve diğer içeren %20 (v/v) etanol) sadece Pazartesi, Çarşamba ve Cuma hafta içi ve hafta sonları, sırasıyla1624 saat ve 48 h çekilme süresi ile alırsınız. Birkaç hafta sonra aralıklı erişim, fare yavaş yavaş olacak ve gönüllü olarak düzeyleri, sonunda tarafım DID modelde gözlenen için benzer ulaşmak içme yükselmek. DID, ancak, aşırı gibi içme davranışı değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan model gibi görünüyor. Aralıklı içme diğer modelleri mevcut, ancak gıda erişimi kısıtlama güvenmek veya onları daha az temsilcisi gönüllü insan alkol tüketimi16yapar gönüllü kendi kendine Yönetim odası indüklenen artışlar Buhar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve Güney Kaliforniya Üniversitesi Sağlık Bilimleri kampüs kullanımı komiteler tarafından onaylanmıştır.
1. deneysel kurulum ve montaj
- Tüm aşağıdaki malzemeleri ve kimyasallar çalışma başlangıcından önce elde etmek: fare, kafes/metal kafes üstleri, yatak takımları, gıda, su, etanol, pipets, sipper başında, shrink sarma, yeni bıçak, ZIP bağları, teyp, Bunsen brülör, ölçek, Far.
- C57BL/6J fareler elde etmek için ya bir ticari kaynağı veya şirket içi bir koloni, bu fareler göz önünde bulundurarak test zamana kadar ev sahipliği yaptığı grup olabilir.
Not: Tedarik fareler toplam sayısı deneysel tasarım karmaşıklığına bağlıdır. Yaklaşık 12-15 fareler her grubu, pilot çalışmalar küçük grup başına 5-7 fare ile karşılamak için plan. Aşağıda gösterilen temsilcisi sonuçlarında biz tek doz (5 mg/kg) kullanarak neden-sonuç ilişkisi değerlendirmek için basit bir iki grup set-up ilaç (MOX) olarak kullanılmıştır. - Şişe18düzenlemek için aşağıdaki adımları izleyin.
- Bunsen burner kullanarak yeni bıçak ısı.
- Bu bıçak kullanarak, yaklaşık bir inç bir plastik 18 mL serolojik damlalıklı üst ve alt uçları kapalı kesti.
- Not daha küçük birim pipets (yani, 10 mL) aynı zamanda ölçüm kesinliğini artırmak için kullanılabilir.
- Damlalıklı ısı silah altında sıcak.
- "Alt" sonuna damlalıklı (diğer bir deyişle, en yakın 18 mL kesik çizgi açılış) rulman sipper tüp takın.
- Sipper tüp yerde ticari olarak kullanılabilen küçültme şal silah kullanarak shrink wrap ile kapatın.
- Diğer açılış silikon tıpa ile kapalı kap.
2. hayvan Habituation
- En az 1 hafta önce deneme başlangıç tarihinden başlayarak, deneysel prosedürler (ortam sıcaklığı (21 ± 1 ° C) ve 12-h dahil yetiştirme koşulları alışmana böylece gerçekleştirilebilmesi için nerede Oda fareler transfer Açık/Koyu döngüsüyle, ışıklar kapalı 12 öğlen ters). Kurumsal yönergeleri izleyin ve hayvanlar bir konumdan bir sonrakine geçmeden önce uygun kanallar bildirmek emin olun.
- Fareler standart bir ışık/karanlık döngüsü transfer ediliyor ek habituation zaman 2 hafta izin verir.
- Yeni yapılan şişeler ağzına kadar suyla doldurun. Kapağı güvenli bir şekilde ve herhangi bir hava kabarcıkları veya sızıntı emzik dan yoksun kapalı olmasına dikkat edin. Çözüm sızdırmaz kap yeniden güvenli. Herhangi bir hava kabarcıkları böylece hava tüpü kaçabilir şişesinde sadece dokunarak kaldırın.
- Elimize tek yatak ve bir metal ızgara kafesi üst standart Polikarbonat/polysulfone kafeslerde her fare evi; Artık kullanılacak gibi Kafesin kapağını çıkarın.
- Gıda ve water bottle(s) ad libitumerişim sağlar.
- Her şişe kafesi dön etrafında yerde tutmak için her şişe Plastik ZIP kravat sarma tarafından güvenli. Kafesin içine çıkıntı değil emin olmak için ZIP kravat aşırı herhangi bir plastikten kırpın.
Not: karanlık (DID) yordamda içme için yalnızca tek bir şişe su gereklidir. İki şişe seçim (TBC) paradigma habituation ancak, kafes set-up iki su şişesi eklemenizi gerektirir. Sağlanan metal ızgara hopper çözüm yalnızca tek bir şişe tutmak için tasarlanmış ise, yavaşça ayrı ikinci şişe TBC için karşılamak ek bir plaka için alan yaratmak için onun Bar kır.
- En az 3 fare ücretsiz kontrol kafes kadar ayarla. Bu sadece doğal bir olay gibi kafesleri ve kafes raf kapalı yerleştirilir gerçekleşen olan buharlaşma ya da dökülme şişeler, neden herhangi bir sıvı kaybına izlemek için izin verir (bkz. Adım 2.6.3, 3.6.1 ve 4.6.1 denklemler için).
- ' 4 / 1 haftalık tek konut calıştıkları gününden başlayarak, ölçmek ve oymalar en yüksek noktası kaydetmek için ters şişe yanında istimal su alımı yanı sıra bir ölçekte, (gram) kullanarak her fare günlük gıda ve vücut ağırlıkları kayıt Menisküs (mL içinde).
- Şişe ters bir pozisyonda ölçüm sırasında kalır çünkü o içbükey menisküs en düşük noktası okumak için standart bilimsel yöntem olmakla birlikte, menisküs en yüksek noktası kaydedin.
- Aşağıdaki denklemleri kullanarak 2.5 parametrelerini değerlendirmek:
- Vücut ağırlığı değişikliği (g) ölçmek: ağırlığını geçerli gün (g) - önceki gün (g) ağırlığı.
- Gıda alımı (g) ölçmek: önceki gün (g) - ağırlığını geçerli gün (g) Gıda Gıda ağırlık.
- Su alımı (mL) ölçmek: [geçerli gün (mL) - önceki gün (mL) su su hacmi] - Ortalama su kaybı tüm denetim kafesleri (mL).
- 2.5 arka arkaya, etanol getirilmesi hemen önce üç gündür bir taban çizgisi tespiti için izin vermek için 5-7, günlerinde adımları yineleyin. Üst üste kayıt toplanamaz, temel ölçü birimlerinin değerlendirme için izin vermek için calıştıkları süresini uzatmakta.
- Bir kez su alımı ± % 10 değişkenliği için son 3 gün anlamına stabilize, etanol erişim TBC (sınırsız erişim) ya da DID (sınırlı erişim) ile başlar.
Not: nadir durumlarda, bir veya iki ek gün konular bu istikrar ulaşmak için gerekli olabilir; ek süre ±10% değişkenlik son 3 gün ortalaması üzerinden görüntülenecek değerleri için gerekliyse, endişelenme.
3. 24 saatlik iki şişe seçim (TBC)
Not: Bir şematik resim 1' de hazır.
- 500 mL ses seviyesinde bir %10 (v/v) etanol çözüm H2O için 447.35 mL 52.65 mL 190 kanıtı tahıl etanol (% ~ 95 etanol) ekleyerek hazırlamak; iyice sallayın emin olun. Etanol hızla buharlaşır göz önüne alındığında, çözümü her 3-4 gün aralığı içinde yerini alır.
Not: Diğer konsantrasyonları etanol de kullanılabilir, ancak yazarlar bu model için bir %10 konsantrasyon öneririz. - TBC, ilk gününde (günde 8 en erken) 1 / 2 su şişeleri, her kafes içinde boş ve taze hazırlanmış etanol çözüm ile ağzına kadar doldurun. Etanol ve su görsel olarak ayırt edici olmak zor olduğunu göz önüne alındığında, açıkça ilgili içerikleri ile şişe etiket. Sadece şişe teybe maskeleme ve bir marker ile veya etiketleme yazarak bir parça şişesinde doğrudan uygulanır.
- Daha fazla su şişesi, gerektiği gibi ekleyin.
- Tümü büyük harf güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin yapma kafesine geri ve herhangi bir hava kabarcıkları veya sızıntı emzik dan yoksun şişe yerleştirin. Çözüm sızdırmaz kap yeniden güvenli. Herhangi bir hava kabarcıkları böylece hava şişe kaçabilir şişesinde sadece dokunarak kaldırın.
- Alternatif olarak her geçen gün şişe konumunu için şartına yer tercih ile ilgili doğru etkiler etkinlik içme (daha fazla bilgi için konuya bakın).
- 2.5 ve devam eden olmuştur, 2.6, günlük ölçümler ek olarak okumak ve etanol alımı düzeyleri de kaydetmek başlar. % 10 etanol alımı ve tercih oranı aşağıdaki denklemleri kullanarak çözümleyin:
- % 10 ölçmek etanol alımı (mL): [geçerli gün (mL) - hacmi önceki gün (mL) etanol etanol hacmi)]-Ortalama tüm denetim kafesleri (mL) etanol kaybı.
- % 10 ölçmek etanol alımı (g/kg): [% 10 etanol alımı (mL) 0.07893 g/mL x] / vücut ağırlığı (kg).
- Tercihi % ölçmek: [% 10 etanol alımı (mL) / su (mL)] x 100.
- En kısa zamanda etanol alımı istikrarlı hale geldi, bir tek denetim (tuzlu) mayi (IP) enjeksiyon (vücut ağırlığının 0,01 mL/g) sırasında günlük ölçüm rutin her fare için yönetmek. Bu şekilde, konular enjeksiyon için alışmış.
- İstikrar ± % 10 değişkenlik son 3 gün (aynı bölüm 2.8) ortalaması üzerinden olarak tanımlanır.
Not: Etanol düzeyleri stabilize etmek için 1 hafta kadar sürebilir. Fare bir önceki deneyden yeniden kullanılmakta olan ve etanol önceki maruz oldu bu özellikle doğrudur. Sadece uyuşturucu çözülmeye kullanılan çözücü denetimidir.
- İstikrar ± % 10 değişkenlik son 3 gün (aynı bölüm 2.8) ortalaması üzerinden olarak tanımlanır.
- Düşük değişkenlik etanol temeliyle fareler dozaj içine split yeniden kurulmuş, bir kez tüm grupları kabaca benzer böylece etanol alımı değerleri kullanarak grupları etanol alımı değerlerin ortalamasını.
- Bir grup (tuz almaya devam) denetimi diğer deneysel olarak atayın (0,01 mL/g vücut ağırlığının, incelenen ilacın ı.p. enjeksiyon). Günlük ilaç dozaj, ya bir akut veya çok günlük süre için başlar. Daha sonra Denetim sonrası uyuşturucu etkileri (isteğe bağlı) test etmek için yeniden kullanılmaya olabilir.
Not: 24 saat uzun bir süre izlenir içme çünkü dozaj yönetim zaman karanlık döngüsü bağlı değildir.
- Bir grup (tuz almaya devam) denetimi diğer deneysel olarak atayın (0,01 mL/g vücut ağırlığının, incelenen ilacın ı.p. enjeksiyon). Günlük ilaç dozaj, ya bir akut veya çok günlük süre için başlar. Daha sonra Denetim sonrası uyuşturucu etkileri (isteğe bağlı) test etmek için yeniden kullanılmaya olabilir.
4. karanlıkta (yaptım) İçme
Not: Şekil 3' te bir şematik hazırlanır.
- Her gün zamanlanan etanol erişim (gün 1-4) su hacmi, gıda alımı ve vücut ağırlığı, ölçümleri kaydetmek ve ilaç dozaj gerçekleştirin. Bunu önceden belirlenen bir süre içinde İlaç dozları uygun olarak seçilir, böylece bileşiktir, ışık-siklet sırasında yapmak / veya içme süresi boyunca en fazla beyin konsantrasyonu yaklaşıyor.
Not: 1-3 gün sadece kısa bir süre içinde bol düzeyde etanol içme fareler alışmana gerekiyordu unutmayın. Fareler BEC düzeyleri için insan 0,08 karşılaştırılabilir ulaşmak olmayan iken; "eğitim" Bugünlerde günde 4, biraz daha içki oturumu sırasında onlar aslında bu seviyeye içer misin emin olun.- Bütün fareler gün 4 gün 1-3 ve denetim veya uyuşturucu denetimi (serum) ver. Bu DID yordamı uyuşturucu (2. hafta) ve sonrası ilaç (4 hafta) içme oturum öncesi ilaç (1. hafta) dahil etmek için 3 hafta span üzerinden gerçekleşir.
- Not: Bu ilaç dozaj hafta içi, gün 3 etanol alımı düzeyleri fareler ya da her iki grup etanol alımı düzeyde en az değişkenlik olduğu bir şekilde denetim veya ilaç grubu atamak için kullanılır. Bu 3 günlük ortalama olarak göre gruplara atar TBC benzemez.
- %20 (v/v) etanol çözeltisi (20E) 500 mL ses seviyesinde H2O için 394.75 mL 105.25 mL 190 kanıtı tahıl etanol (% ~ 95 etanol) ekleyerek hazırlamak; iyice sallayın emin olun.
- DID başlar başlamaz su şişeleri sadece alkol şişeleri ile değiştirilebilir içme oturum başlangıcından önce etanol şişeleri doldurun.
- Tüm DID oturumunda (adım 4.5-4.8), hayvanların rahatsız etme gibi bir kırmızı ışık far kullanın.
- Oturum 3 saat karanlık çevrimi başlaması planlanan, içme DID başında her fare için su hacmi kaydedin. Sonra her su şişesi 20E çözüm bir şişe ile değiştirin ve başlangıç etanol ses kaydı.
- Okuyun ve son etanol Cilt 2 saat sonra 1-3 gün içme oturum ve daha sonra gün 4'te 4 saat sonunda kaydetmek. Aşağıdaki denklemleri kullanarak % 20 etanol alımı analiz.
- % 20 ölçmek etanol alımı (mL): [etanol oturum (mL) - etanol oturum (mL) içme başında hacmi içme sonunda hacmi] - Ortalama etanol kaybı tüm denetim kafesleri (mL).
- % 20 ölçmek etanol alımı (g/kg): [% 20 etanol alımı (mL) 0.15786 g/mL x] / vücut ağırlığı (kg).
- Su ile günde hemen sonra etanol birimleri kayıt ve erişim yeniden tanıtımı önce 4 yalnızca, her fare (isteğe bağlı) kan etanol konsantrasyonu değerlendirmek için kan toplamak.
Not: Herhangi bir terminal kan toplama yöntemi, retro-orbital sinüs kan toplama veya safen ven kan toplama gibi kullanılabilir. Yararlı protokollerde Parasuraman ve ark. için bkz: 21 ve Yardley vd. 20.- LCMS veya piyasada bulunan makineleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle analiz ( Tablo malzemelerigörmek).
- Tüm etanol şişe su şişeleri ve kayıt su hacmi ile değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıdaki temsilcisi araştırmalarda sosyal içme iki şişe seçim (TBC) paradigması kullanarak örnek alınarak tasarlanmıştır. Kısaca, fareler ve bunlardan biri su ve diğer bir % 10 (v/v) etanol çözüm bulunan çözüm, iki şişe erişimi vardı. Konular daha sonra bölünmüş ve her grup varyasyon az miktarda etanol alımı düzeyleriyle ortalama böylece eşit olarak uyuşturucu tedavi grupları, moxidectin (MOX) serum fizyolojik kontrol, vs atanan.
24-h döneminde ilk temel 10E alımı stabilize 14.46 ± 1.85 g/kg (n = 8) enjeksiyonları ve daha sonra yeniden 14.14 g/kg stabilize salin enjeksiyonu sonrası. Bir akut doz (5 mg/kg) MOX etanol alımı ve tercih etkilerini değerlendirmek için etkinlik içme biçilen öncesi MOX, MOX ve sonrası MOX yapıldı. Biz MOX tek bir doz alkol alımı öncesi MOX enjeksiyonları ile karşılaştırıldığında % 45'aşan azaltılmış anlamlı bulundu [F (2, 22) 26.33, p = < 0,0001] (Şekil 2A) ve tercih [F (2, 14) 17.35, p = < 0,0001] (Şekil 2B ) % 30 fazla. 10e alımı ve tercih kaldı salin önemli ölçüde daha düşük hemen MOX tedavi ertesi günü (% 25'den fazla ve %15 sırasıyla) MOX Enjeksiyon sonrası Şekil 2' de gösterilen).
Yayımlanmamış bir pilot çalışmada, aşırı içme şişe içeren 20E başlayan bir 3-h 3 gün üst üste daha uzun bir erişim için sirkadiyen karanlık fazına sayede fareler günlük sınırlı erişimi (2 h) karanlık (DID) yordamda içme kullanma örnek alınarak tasarlanmıştır dönem (4 h) günde 4 (Şekil 4). Dişi fareler (n = 12, 6 fare/grup) yönetilen serum enjeksiyonları (IP) günlerde 1-4 temel 20E kuruldu gün 4 (öncesi ilaç). Günlerde 2nd 1-3 haftalık döngüsü, tüm fare yeni bir günlük tuz enjeksiyon aldı. Etanol alımı değerleri 3 günden sonra fareler iki gruba bölmek için kullanılan (n = 6 / grup), daha sonra alınan bir enjeksiyon MOX (5 mg/kg) (IP) veya serum gün 4 (ilaç). Gün 1-4 ve etanol alımı günlük serum enjeksiyonları tüm fareler alınan aşağıdaki hafta yine gün 4 (mesaj uyuşturucu) ölçüldü. 5 mg/kg MOX analiz ve önemli ölçüde azaltılmış alkol alımı % 54, aşan tespit akut yönetim öncesi ilaç enjeksiyonları ile karşılaştırıldığında (t = 7.635, p < 0.0001)
Resim 1 . İki şişe seçim şematikBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . İki şişe seçim (TBC). MOX (5 mg/kg) % 10 v/v etanol (10E) alımı (A) ve (B) 24 saat erişim iki şişe seçim paradigması kullanarak kadın C57BL/6J farelerde tercih azaltır. 3 gün üst üste istikrarlı içme düzeyleri ulaşmak sonra MOX yönetiliyordu. Barlar MOX enjeksiyon (beyaz; önce günden ortalama 10E alımı düzeylerini göstermek Öncesi MOX), gün MOX enjeksiyon (siyah; MOX) ve bir gün sonra MOX enjeksiyon (gri; Yazı MOX). Değerleri 12 fareler için Ortalama ± SEM temsil eder. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ve *** P < Pre MOX (en soldaki yatay çizgi) veya sonrası MOX (en sağdaki yatay çizgi), Tukey karşı 0,0001'ın birden fazla karşılaştırma post-hoc testi. Huynh N. ve arkdeğiştiren. 19 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Karanlık şematik içmeBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Karanlıkta (yaptım) içme. MOX (5 mg/kg) % 20 v/v etanol (20E) alımı bir karanlık paradigmada içme kullanarak kadın C57BL/6J farelerde azaltır. Çubuklar MOX enjeksiyon (ilaç) hafta ve ondan MOX enjeksiyon (sonrası ilaç) hafta önce MOX enjeksiyon (öncesi ilaç), ortalama 20E alımı düzeyleri gösterir. Değerleri ortalama ± SEM 12 fareler (6/grup) için serum ve MOX gruplar arasında temsil eder. P < 0,0001 karşı öncesi ilaç (en soldaki yatay çizgi) ya da sonrası ilaç (en sağdaki yatay çizgi), Tukey çoklu karşılaştırma post-hoc testi 's. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dünya çapında tahminler kadar 76 milyon kişi bir tanı için alkol kullanım bozukluğu (AUD) emri için ölçütlere uyan gösterir. Ne yazık ki, ilaç tedavisi mevcut büyük ölçüde etkisiz ve daha da geliştirilmesi bu klinik nüfus20ihtiyaçlarını dengelemek gereklidir. Bu amaçla, aşağıdaki protokol iki paradigmalar içme en temel kemirgen örnekli tarafından bu çaba kolaylaştırmak amaçlamaktadır: iki şişe Seçmeli (TBC) ve karanlıkta (DID) içme. Her iki model de edimsel olmayan öz yönetim etanol, mademki fareler etanol sözlü olarak yemek ölçmek. TBC paradigma, etanol (% 10 v/v) ve su her ikisi elde edilebilir sürekli olarak bir epizodik ve kademeli etanol tüketimi desen bir sonucu nispeten düşük kan etanol seviyelerinde kaynaklanan vardır. Bu model bir tercih tastant etanol alımı alt düzeylerini değerlendirmek için en iyi ve bu nedenle, insan "ılımlı" içmeye benzer olduğu söyleniyor. Şekil 2 yukarıdaki TBC paradigma için temsil edici sonuçlar gösterir.
Öte yandan, DID içinde modeli etanol (% 20 v/v) yalnızca sınırlı bir süre için kullanılabilir. TBC, bu model etanol C57BL/6J fareler etanol fazla çok hızlı bir şekilde onların sirkadiyen döngüsü en aktif aşamasında tüketen gerçek yararlanarak, davranışsal ilgili konsantrasyonları bir bileşik etkilerini ele alıyor. 3rd s gün 4 gün 1-3 ve 4 h 2 h süresiyle karanlık çevrimi başlayan 4 gün üst üste için içme seanslar oluşur. Bu yordamı kullanarak, fareler genellikle tarafım ulaşmak için yeterli etanol tüketmek > 100 mg/dL ve davranışsal bağımlılık yapan maddeler kanıtı sergilemek. DID paradigma için temsilcisi bizim sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Her ne kadar biz did değil ölçü tarafım bu fareler için içme düzeyleri tarafım 100 mg/dL13,14,15elde literatürde bildirilen benzer.
Her iki paradigmalar kısıtlamalar bulunmaktadır. Oral gavages farmakolojik kurşun bileşikleri test için tercih edilen yöntem yönetim olduğunda örnekleri sırasında her iki paradigmalar etanol kendini yönetiminde esophogeal travma neden yordam tarafından engelleyebilir. Bu etanol (% 20) daha yüksek bir konsantrasyon kullanır ve hangi mevcut örnekleri nerede İlaç dozları gerektiren hayvanlar daha önce başlamak için içme oturum kurtarmak için yeterli zaman vardı olabilir DID modeli için özellikle doğrudur yordam. Bu bir kontrol grubuna karşılık gelen düzey tarafım için de beklenen 0,08 içme belirgin olacaktır. Bizim laboratuarımızda kuvvet besleme DID ve TBC ile de zorluklarla yaşadım. Böylece onlar bir sözlü olarak eriterek ince şerit (ODS)19kullanarak teslim bizim bileşikler formüle tarafından bu sorunlara geçici iş başardık.
Ayrıca, DID modelde özellikle, etanol erişim süresi içinde bu yüzden kısa dönemdir aslında verilen ilaç dozaj İlaç dozları uygun olarak seçilen ışık döngüsü sırasında önceden belirlenen bir süre içinde yapmanız gerekir böylece bileşik yeri / veya içme süresi boyunca en fazla beyin konsantrasyonu yaklaşıyor. Farmakokinetik çözümleme gerçekleştirilemez alternatif bir yaklaşım TBC kullanarak uyuşturucu davranışsal etkileri bir saat ders değerlendirme yapmak için olurdu. Uyuşturucu yönetilen19gerekirken bu mantık, içme etkinliği saatlik olarak izleme ve en yüksek Anti-alkol etkileri, belirleyen bir makul strateji.
Aşağıdaki iletişim kuralı alkolizm alan AUD8farklı fizyolojik ve davranışsal yönleri araştırmak için birçok hayvan modeli olsa da, iki yaygın olarak kullanılan paradigmalar, sonuçları arasında karşılaştırmalar için sağlar açıklar laboratuvarları. İkinci yararı bu yöntemlerin kullanılmaları uygun akut ve kronik çalışmaları sırasında yukarıda verilen örnekler benzer yapım basit olmasıdır. Ayrıca, edimsel klima ve buhar odası paradigmalar gibi diğer yaygın olarak kullanılan alkol paradigmalar aksine burada tarif var metodoloji özel ekipman için gerek kalmadan yapılabilir. Anecdotally, İçme aparatı neredeyse tüm bileşenleri bir prototip Kurumsal vivaryum bulunabilir olasıdır. Böylece en iyi gol her denemenin uygun burada açıklanan iletişim kuralları değiştirmek için çeşitli yolları da vardır. Örneğin, bizim DID tek içme oturumunda (sırasında gün 4 gün) bir ilaç akut etkilerini test etmek için en iyi yöntemdir. Ancak, biz çok günlük ilaç dozaj 4 gün üst üste 2 saatlik erişimi, erişim geçerli 2 saatlik gün 1-3 ve 4 gün19saat karşı içme oturumlara artırmada tarafından tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Fareler de transfer birinden paradigma / farklı veya ek doz için yeniden test başka bir, maddeler ve birleşimler, basit 1-2 hafta silinerek geçiş noktayla arasında.
Bu yöntemlerle gözlenen içme herhangi bir ilaçla değişim etkileri alkol için seçmeli olup veya onlar zehirlenmesi sonucu olup olmadığını belirlemek için iyice araştırılmalı belirtilmelidir. Denetimler hakkında daha fazla bilgi için okuyucu Yardley ve arkbakmalıdır. 20 tek yok paradigması bu durum tüm yönleriyle modelleyebilirsiniz. Bunun yerine, her paradigma inceliyor genellikle birkaç AUD. ile ilişkili anahtar öznitelikleri Burada açıklanan TBC ve DID modelleri bağımlılığı döngüsü aşırı bağımlılık yapan maddeler aşamasına bağlı. Bahçedeki yardımcı programı daha kapsamlı bir anlayış için birden fazla preklinik içme modeli kullanılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dissosiyatif kimlik bozukluğu ve LA mucitler ivermectin repurposing için bir patent ve ilgili avermectins alkol kullanım bozuklukları tedavisi için vardır. Yazarlar hiçbir diğer çatışmaları var ve tamamen kağıt bilimsel içeriği için sorumludur.
Acknowledgments
Bu eser desteklenen, kısmen verir araştırma tarafından SC CTSI NIH/NCRR/NCATS - UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) ve USC Eczacılık Okulu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
