Summary
Alcohol gebruik stoornis (AUD) is een grote nationale gezondheidsprobleem en de ontwikkeling van effectievere behandelingen is vereist ter compensatie van de behoeften van deze patiënten populatie. Te dien einde het volgende protocol maakt gebruik van twee eenvoudige knaagdier drinken modellen om te beoordelen van de preklinische werkzaamheid van anti-alcohol loodverbindingen.
Abstract
Alcohol gebruik stoornis (AUD) is een groot probleem met meer dan een geschatte 76 miljoen mensen wereldwijd aan de diagnostische criteria voldoet. Huidige behandelingen zijn beperkt tot drie FDA-goedgekeurde medicijnen die grotendeels ineffectief zelfs wanneer gecombineerd met psychosociale interventie zijn, zoals blijkt door de hoge relapse tarief. De zoektocht naar meer nieuwe behandelingen vertegenwoordigt als zodanig een belangrijke volksgezondheid doel. Te dien einde het volgende protocol maakt gebruik van twee eenvoudige knaagdier drinken modellen om te beoordelen van de preklinische werkzaamheid van anti-alcohol loodverbindingen: twee-fles keuze (TBC) en drinken in het donker (DID). De voormalige kunt muizen op vrijwillige drankje in matiging, terwijl de laatstgenoemde muizen tot de vrijwillige induceert consumeren een grote hoeveelheid alcohol in een korte periode dat binge drinken nabootst. De aard van de eenvoudige en hoge doorvoer van beide van deze paradigma's mogelijk voor snelle screening van farmacologische agenten of voor het identificeren van muizenstammen die bepaalde vrijwillige drinkgedrag vertonen.
Introduction
Voor de afgelopen 25 plus jaren aanzienlijke inspanningen heeft gebracht aan de ontwikkeling van medicijnen voor de behandeling van de wanorde van het gebruik van Alcohol (AUD)1. Hoewel veel vooruitgang hebben geboekt, AUD blijft een belangrijk volksgezondheidsprobleem, meer dan 18 miljoen Amerikanen beïnvloeden en kost meer dan 220 miljard dollar jaarlijks2,3. Momenteel zijn er slechts drie FDA-goedgekeurde medicijnen, disulfiram, naltrexon en acamprosaat, die allemaal de inconsistente resultaten in klinische proeven en het beperkte succes zelfs wanneer gecombineerd met psychosociale interventie in de kliniek-instellingen hebben opgeleverd 4 , 5 , 6 , 7.
Een primaire reden voor mislukkingen van huidige AUD therapie is gekoppeld aan de heterogene aard van AUD8. Terwijl zowel milieu- en genetische factoren dragen bij aan de ontwikkeling van AUD, verantwoordelijk erfelijkheidsgraad voor naar schatting 50-60% van het risico van begin9. Vergelijkbaar met de behandeling van depressie, het is algemeen aanvaard dat patiënten die lijden aan AUD moet een verscheidenheid van medicijnen die zijn toegesneden op de behoeften van elke patiënt10.
Duidelijk, is er dringend behoefte aan meer doeltreffende behandelingen die zou worden vergemakkelijkt als het al moeizaam en tijdrovend proces van drugontdekking gestroomlijnde3 waren. Te dien einde toont het volgende protocol de preklinische toepasselijkheid van twee knaagdier drinken modellen te onderzoeken de neurobiologische basis van AUD11op grote schaal gebruikt. Meer in het bijzonder, de methode geïntroduceerd hierin kan beoordelen van de werkzaamheid van kandidaat-stoffen bij het beperken van aan alcohol consumptie in zowel "gematigde" en "binge drinken" scenario's met behulp van de twee-fles keuze (TBC) en drinken in het donker (DID) paradigma's, respectievelijk. Beide paradigma's onderzoeken niet-operante ethanol zelfbestuur, waarbij muizen inslikken ethanol mondeling en op wil, en daarom illustreren hoge gezicht en constructvaliditeit als een model van menselijke alcoholisme11.
TBC drinken, ook bekend als vrije keuze, drinken, drinken, voorkeur of sociaal drinken, zijn twee flessen van oplossing continu beschikbaar in hun kooi. Een fles water bevat, en anderzijds een verdunde oplossing van ethanol, waarbij de concentratie van ethanol kan worden gevarieerd (bv., 5-30% v/v)11,12. De muizen hebben constant toegang tot beide flessen, en dus kunnen kiezen hoeveel te drinken van elke fles.
Dit model evalueert de ethanol consumptie van elke muis (g/kg), evenals de ethanol voorkeur verhouding (hoeveelheid ethanol verbruikt ÷ totaal volume vloeistof verbruikt). Het routinematig wordt gebruikt om te drinken niveaus van verschillende stammen van muizen, of na een specifieke genetische manipulatie met elkaar vergelijken (bv., gene knock-out of knockdown) en resultaten in bloed ethanol concentraties (BECs) vergelijkbaar met wat wordt gevonden bij de mens als drinken in matiging13,14.
In de DID-procedure, 3 h na de start van de donkere cyclus, wordt de kooi fles water uitgewisseld met een fles van 20% (v/v) ethanol-oplossing voor een beperkte toegang drinken sessie. Het drinken sessies optreden als opeenvolgende 4-daagse cyclus, duurzame 2 h op dagen 1-3 en 4 uur op dag 4. 1-3 dagen dienen als een alcohol-gewenning periode vóór het testen op dag 4. Bijgevolg, muizen betrouwbaar genoeg ethanol ter verwezenlijking van BECs zal verbruiken > 100 mg/dL en dientengevolge, vertonen de gedragsmatige gevolgen van dronkenschap gevonden bij de mens die zijn drankmisbruik13,14,15. Toegang tot water is beschikbaar op alle tijden dan de drinken sessie.
Er zijn verschillende variaties van het drinken van beperkte toegang. Bijvoorbeeld, in de intermitterende access-objectmodel ontvangen muizen twee flessen (een met water en de andere met 20% (v/v)-ethanol) alleen op maandag, woensdag en vrijdag met een wachttijd 24 uur en 48 uur op weekdagen en weekend, respectievelijk16. Na verscheidene weken van intermitterende toegang, de muizen zal geleidelijk aan en vrijwillig escaleren drinken niveaus, uiteindelijk het bereiken van BECS vergelijkbaar met wat is waargenomen in de DID-model. De DID, lijkt echter het meest gebruikte model om te beoordelen binge-achtige drinkgedrag. Andere modellen van het drinken van intermitterende bestaan, maar ze vertrouwen op het beperken van de toegang tot voedsel of damp kamer veroorzaakte stijging van vrijwillige zelfbestuur, waardoor ze minder vertegenwoordiger van vrijwillige menselijke alcohol consumptie16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies van de University of Southern California Health Sciences Campus.
1. experimentele opstelling en montage
- Verwerven alle volgende leveringen en chemicaliën voor de aanvang van de studie: muizen, kooien/metalen kooi toppen, beddengoed, voedsel, water, ethanol, pipets, sipper toppen, shrink wrap, mes, zip-banden, tape, Bunsenbrander, schaal, koplicht.
- C57BL/6J muizen, of van een commerciële bron of een in-house kolonie, houdend in mening dat muizen groep gehuisvest tot tijd kunnen van testikel te verkrijgen.
Opmerking: Het totale aantal muizen aangeschaft is afhankelijk van de complexiteit van de proefopzet. Plan voor ongeveer 12-15 muizen per groep, met pilot studies niet kleiner zijn dan 5-7 muizen per groep. In de representatieve resultaten hieronder gebruikt wij een eenvoudige twee-groep set-up om te kunnen beoordelen van de oorzaak-gevolg-relatie met behulp van een enkele dosis (5 mg/kg) van de drug (MOX). - Volg de onderstaande stappen om het monteren van de flessen18.
- Verwarm een utility mes met behulp van een bunsenbrander.
- Met dit mes, snijd ongeveer een duim uit de uiteinden van het boven- en onderkant van een plastic 18 mL serologische Pipetteer.
- Merk op dat kleinere volume pipets (dat wil zeggen, 10 mL) kunnen ook worden gebruikt om de precisie van de meting.
- Warm de Pipetteer onder een warmte-pistool.
- Plaats de kogellager sipper buis in de "onderkant" van de pipet (met andere woorden, de opening die het dichtst bij de 18 mL dash-lijn).
- Verzegel de sipper buis in plaats met krimp omslag met behulp van een commercieel voorhanden verschrompelen wrap pistool.
- Dop van de andere opening met een silicone-stop.
2. dierlijke gewenning
- Begin ten minste 1 week vóór de begindatum van het experiment, de muizen overbrengen naar de kamer waar de experimentele procedures worden uitgevoerd zullen, zodat ze aan de voorwaarden van de veeteelt acclimatiseren kunnen (inclusief de omgevingstemperatuur (21 ± 1 ° C) en de 12-h omgekeerde licht/donker cyclus, met lichten uit om 12 uur). Zorg ervoor dat institutionele richtlijnen volgen en kennis van de daartoe geëigende kanalen alvorens de dieren van de ene locatie naar de andere.
- Als muizen worden overgedragen van een standaard licht/donker cyclus toestaan 2 weken extra gewenning tijd.
- Vul de nieuwe flessen tot de rand met water. Zorg ervoor dat het GLB is gesloten veilig en verstoken van eventuele luchtbellen of lekken uit de teut omhoog loopt. Als oplossing lekt, beveiligt u het GLB opnieuw in. Luchtbellen verwijderen door simpelweg te tikken op de fles, zodat de lucht kan ontsnappen aan de buis.
- Bij aankomst, één huis elke muis in standaard polycarbonaat/Polysulfon kooien met beddengoed en een metalen raster kooi top; Verwijder het deksel van de kooi zoals het zal niet langer worden gebruikt.
- Bieden toegang tot voedsel en water bottle(s) ad libitum.
- Elke fles tot de bovenkant van de kooi beveiligen door inwikkeling een kunststof zip gelijkspel rond elke fles om het op zijn plaats houden. Trim eventuele overtollige plastic uit de zip-band om ervoor te zorgen dat het niet in de kooi uitsteken doet.
Opmerking: Voor het drinken in de donkere (DID)-procedure, is slechts een enkele fles water vereist. Gewenning aan de twee fles keuze (TBC) paradigma, vereist echter dat de kooi set-up omvatten twee flessen water. Als de metalen raster hopper geboden is ontworpen om te houden alleen een enkele fles voor oplossing, buig voorzichtig uit elkaar zijn bars om ruimte voor een extra plaat aan de tweede fles voor TBC te maken.
- Ten minste 3 muis gratis controle kooien instellen. Dit zal zorgen voor de monitoring van eventuele vocht verlies veroorzaakt door verdamping of morsen uit de flessen, die gewoon een natuurlijk fenomeen dat gebeurt is zoals kooien zijn geplaatst op en uit de kooi rek (zie stap 2.6.3 en 3.6.1 4.6.1 voor vergelijkingen).
- Beginnen op dag 4 van de acclimatisering 1-week één behuizing, meten en registreren van de dagelijkse lichaam en voedsel gewichten van elke muis, met behulp van een schaal, (in grammen) evenals de wateropname, met behulp van de etsen naast de omgekeerde fles om te registreren het hoogste punt van de meniscus (in mL).
- Hoewel het standaard wetenschappelijke praktijk om te lezen het laagste punt van de holle meniscus, omdat de flessen in een omgekeerde positie tijdens de meting blijven, neem het hoogste punt van de meniscus.
- Beoordeling van de parameters van 2.5 met behulp van de onderstaande vergelijkingen:
- Meten van de wijziging van het lichaam-gewicht (g): gewicht van de huidige dag (g) - gewicht van de vorige dag (g).
- Meten van de voedsel-inname (g): gewicht van voedsel op de vorige dag (g) - gewicht van voedsel op de huidige dag (g).
- Meten van de wateropname (mL): [hoeveelheid water op de huidige dag (mL) - hoeveelheid water op de vorige dag (mL)] - gemiddelde waterverlies uit alle controle kooien (mL).
- Herhaal stap 2.5 opeenvolgend, op dagen 5-7, zodat voor de bepaling van een basislijn voor de drie dagen onmiddellijk vóór de invoering van ethanol. Als een opeenvolgende opname kan niet worden verzameld, verlengt de voorrangstermijn van de acclimatisering te scheppen voor de evaluatie van basislijnmetingen.
- Zodra de wateropname gestabiliseerd naar variabiliteit van ± 10% van het gemiddelde van de laatste 3 dagen, beginnen ethanol toegang met TBC (onbeperkte toegang) of DID (beperkte toegang).
Opmerking: Bij zeldzame gelegenheid, één tot twee extra dagen nodig kunnen zijn voor onderwerpen voor de verwezenlijking van deze stabiliteit; schrik niet als extra tijd nodig is voor de waarden weer te geven van ±10% variabiliteit van het gemiddelde van de laatste 3 dagen.
3. 24-uurs twee fles keuze (TBC)
Opmerking: Een schematische bereid is in Figuur 1.
- Bereiden van een oplossing van 10% (v/v) ethanol op een volume van 500 mL door 52.65 mL 190 bewijs graan-ethanol (~ 95% ethanol) toe te voegen aan 447.35 mL H2O; Zorg ervoor dat grondig te schudden. Gezien het feit dat ethanol snel verdampt, vervangt u de oplossing in elke 3-4 dagje interval.
Opmerking: Andere concentraties van ethanol kunnen ook worden gebruikt, maar de auteurs raden een concentratie van 10% voor dit model. - Op de eerste dag van TBC, (dag 8 ten vroegste) 1 van de 2 flessen water, in elke kooi, leeg en vul deze tot de rand met de vers bereid ethanol-oplossing. Gezien het feit dat ethanol en water moeilijk zijn te onderscheiden visueel, duidelijk label de flessen met de bijbehorende inhoud. Plak een stukje masking tape aan de fles en het labelen met een marker of door te schrijven gewoon rechtstreeks op de fles.
- Voeg meer oplossing naar de waterfles, zo nodig.
- Plaats flessen terug op de kooi, ervoor te zorgen dat alle caps veilig zijn gesloten en verstoken van eventuele luchtbellen of lekken uit de teut omhoog loopt. Als de oplossing lekt, opnieuw beveiligt het GLB. Luchtbellen verwijderen door simpelweg te tikken op de fles, zodat de lucht kan ontsnappen aan de fles.
- Plaatsvervanger de positie van de flessen om de andere dag te juiste geconditioneerde plaats voorkeur gerelateerde invloeden in het drinken van activiteit (Zie bespreking voor meer informatie).
- Naast de dagelijkse metingen van 2.5 en 2.6, die lopende zijn, beginnen te lezen en opnemen van ethanol innameniveaus ook. Het analyseren van de 10% ethanol inname en voorkeur verhouding met behulp van de volgende vergelijkingen:
- Meten van de 10% Ethanol inname (mL): [volume van ethanol op de huidige dag (mL) - volume van ethanol op de vorige dag (mL))]-gemiddelde ethanol verlies uit alle controle kooien (mL).
- Meten van de 10% Ethanol inname (g/kg): [10% ethanol inname (mL) x 0.07893 g/mL] / lichaamsgewicht (kg).
- Meten van de voorkeur %: [10% Ethanol inname (mL) / Water (mL)] x 100.
- Zodra de ethanol inname is stabiel geworden, beheren een enkel besturingselement (zoute) intraperitoneaal (i.p.) injectie (0,01 mL/g lichaamsgewicht) aan elke muis tijdens de dagelijkse routine van de meting. Op deze manier onderwerpen de injectie zelf gewend geraakt.
- Stabiliteit wordt gedefinieerd als de variabiliteit van ± 10% van het gemiddelde van de laatste 3 dagen (hetzelfde als in punt 2.8).
Opmerking: Het kan duren tot 1 week voor ethanol niveaus te stabiliseren. Dit is vooral waar als muizen opnieuw van een eerdere experiment gebruikt worden en eerdere blootstelling aan ethanol hebben gehad. Het besturingselement is gewoon het oplosmiddel gebruikt te ontbinden van de drug.
- Stabiliteit wordt gedefinieerd als de variabiliteit van ± 10% van het gemiddelde van de laatste 3 dagen (hetzelfde als in punt 2.8).
- Zodra een basislijn ethanol met lage variabiliteit hersteld is, de muizen gesplitst dosering groeperingen die zich bedienen van de ethanol inname waarden zodat alle groepen ruwweg gelijkaardig hebben gemiddelden ethanol inname.
- Één groep aanwijzen als het besturingselement (blijven ontvangen van zoutoplossing) en de andere als de experimentele (i.p. injectie van het onderzochte geneesmiddel op 0,01 mL/g van het lichaamsgewicht). Dagelijkse dosering, drug, hetzij voor de duur van een acute of meerdaags beginnen. Vervolgens kunt het besturingselement weer worden opgenomen voor het testen van de post drug effecten (optioneel).
Opmerking: Omdat het over een lange periode van 24 uur drinken wordt gecontroleerd, de tijd van dosering administratie is niet afhankelijk van de donker cyclus.
- Één groep aanwijzen als het besturingselement (blijven ontvangen van zoutoplossing) en de andere als de experimentele (i.p. injectie van het onderzochte geneesmiddel op 0,01 mL/g van het lichaamsgewicht). Dagelijkse dosering, drug, hetzij voor de duur van een acute of meerdaags beginnen. Vervolgens kunt het besturingselement weer worden opgenomen voor het testen van de post drug effecten (optioneel).
4. drinken in het donker (deed)
Opmerking: Een schematische bereid is in Figuur 3.
- Op elke dag van geplande ethanol toegang (1-4 dagen) opnemen van de metingen, voor water volume, inname van voedsel en lichaamsgewicht, en voeren drug doseren. Dit doen tijdens een vooraf geselecteerde tijd de lichte cyclus die wordt gekozen overeenkomstig de farmacokinetiek van de drug, zodat de compound op / of nadert de maximale hersenen concentratie tijdens het drinken.
Nota: Herinner me 1-3 dagen zijn bedoeld om te acclimatiseren gewoon de muizen aan het drinken van overvloedige niveaus van ethanol in een korte periode van tijd. Hoewel muizen geen BEC niveau vergelijkbaar met de menselijke 0.08 bereiken; deze "" opleidingsdagen ervoor zorgen dat op dag 4, tijdens de lichtjes langer drinken sessie, zij in feite op dat niveau drinken zal.- Geef alle muizen het besturingselement (zoutoplossing) op de dagen 1-3, en het besturingselement of drug op dag 4. Deze procedure DID vindt plaats via de overspanning van 3 weken op te nemen een pre drug (week 1), drugs (week 2), en na drug (week 4) drinken sessie.
- Opmerking: Merk op dat tijdens de week van drug-dosering, dag 3 ethanol innameniveaus worden gebruikt voor het toewijzen van muizen aan of de groep van het besturingselement of drug op een manier waar de innameniveaus ethanol van beide groepen de minste variabiliteit hebben. Dit is in tegenstelling tot TBC, waarmee groepen op basis van een gemiddelde over 3 dagen toegewezen.
- Bereid een 20% (v/v) ethanol oplossing (20E) op een volume van 500 mL door toevoeging van 105.25 mL 190 bewijs graan-ethanol (~ 95% ethanol) aan 394.75 mL H2O; Zorg ervoor dat grondig te schudden.
- Vul de flessen ethanol vóór het begin van het drinken sessie zodat, zodra de DID begint de flessen water gewoon kan worden vervangen door de flessen alcohol.
- Tijdens de hele sessie van DID (stappen 4.5-4.8), gebruiken een koplicht rood-licht dat de dieren niet te storen.
- Opnemen aan het begin van de DID drinken sessie, gepland om te beginnen van 3 uur in het donker cyclus, de hoeveelheid water voor elke muis. Vervolgens elke fles water vervangen door een fles van de 20E-oplossing en het begin ethanol volume opnemen.
- Afgelezen en genoteerd van het definitieve ethanol volume 2 uur later, aan het einde van de drinken sessie op dagen 1-3 en 4 uur later op dag 4. Het analyseren van de inname van 20% ethanol met behulp van de volgende vergelijkingen.
- Meten van de 20% Ethanol inname (mL): [volume van ethanol aan einde van de sessie (mL) - volume van ethanol aan begin van de sessie (mL) drinken drinken] - gemiddelde ethanol verlies uit alle controle kooien (mL).
- Meten van de 20% Ethanol inname (g/kg): [20% Ethanol inname (mL) x 0.15786 g/mL] / lichaamsgewicht (kg).
- Op dag 4 alleen, onmiddellijk na het opnemen van ethanol volumes en voor herintroductie van toegang tot water, verzamelen van bloed om te beoordelen van de bloed ethanol concentratie van elke muis (optioneel).
Opmerking: Een niet-eindstandige bloed collectie methode kan worden gebruikt, zoals retro-orbitaal sinus bloed collectie of bloed saphenous ader. Zie Naslaginformatie voor Parasuraman et al. voor nuttige protocollen 21 en Yardley et al. 20.- Analyses met behulp van verschillende methoden, met inbegrip van LCMS of commercieel beschikbare machines uit te voeren (Zie Tabel van materialen).
- Vervang alle ethanol flessen met flessen water en record water volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de volgende representatieve onderzoeken, was sociaal drinken gemodelleerd met behulp van de twee-fles keuze (TBC) paradigma. Kort, muizen hadden toegang tot twee flessen van oplossing, waarvan er één water en anderzijds een oplossing van 10% (v/v) ethanol bevatte. Onderwerpen waren vervolgens splitsen en gelijkmatig toegewezen aan drug behandelgroepen, moxidectin (MOX) vs. zoute controle, zodat elke groep zou hebben gemiddeld ethanol innameniveaus met de minste hoeveelheid variatie.
Eerste basislijn 10E inname tijdens de periode van 24 uur gestabiliseerd op 14.46 ± 1.85 g/kg (n = 8) voordat injecties begon, en nadien opnieuw gestabiliseerd op 14.14 g/kg post zoute injecties. Om te beoordelen van de gevolgen van een acute dosis (5 mg/kg) van MOX naar ethanol intake en voorkeur, was drinken activiteit beoordeeld pre MOX, MOX en post MOX. We vonden dat een enkelvoudige dosis van MOX alcoholgebruik meer dan 45%, in vergelijking met de pre MOX injecties aanzienlijk verminderd [F (2, 22) 26.33, p = < 0,0001](Figuur 2),en voorkeur [F (2, 14) 17.35, p = < 0,0001] (Figuur 2B ) meer dan 30%. 10e inname en voorkeur beide bleven aanzienlijk lager is dan de zoutoplossing op de dag dat onmiddellijk na de behandeling van de MOX (door meer dan 25% en 15% respectievelijk) weergegeven als post MOX injecties in Figuur 2).
In een niet-gepubliceerde pilot-studie, was binge drinken gemodelleerd met behulp van het drinkwater in de donkere (DID) procedure waarbij muizen dagelijks toegang (2 h beperkte had) naar één fles met 20E begin 3-h in de circadiane donkere fase, gedurende 3 opeenvolgende dagen, met een langere toegang periode (4 uur) op dag 4 (Figuur 4). Vrouwelijke muizen (n = 12, 6 muizen/groep) werden door de overheid gereguleerde zoute injecties (i.p.) op dagen 1-4 met basislijn 20E gevestigd op dag 4 (pre Drug). Op dag 1-3 van de 2nd wekelijks cyclus, alle muizen ontvangen nog een dagelijkse zoute injectie. De ethanol inname waarden vanaf dag 3 werden vervolgens gebruikt om de muizen verdeeld in twee groepen (n = 6 / groep) die vervolgens ontving ofwel één injectie (i.p.) van MOX (5 mg/kg) of zoutoplossing op dag 4 (Drug). De volgende week die alle muizen dagelijks zoute injecties over dagen 1-4 en ethanol inname ontvangen werd nogmaals gemeten op dag 4 (post Drug). Acute administratie van 5 mg/kg MOX was geanalyseerd en vond tot aanzienlijk lagere alcoholinname meer dan 54%, vergeleken met pre Drug injecties (t = 7.635, p < 0.0001)
Figuur 1 . Twee-fles keuze schematischeKlik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Twee fles keuze (TBC). MOX (5 mg/kg) vermindert 10% v/v ethanol (10E) inname (A) en (B) voorkeur in vrouwelijke C57BL/6J muizen met behulp van een twee-fles van de keuze paradigma van 24 uur toegang. Na het bereiken van stabiele drinken niveaus gedurende 3 opeenvolgende dagen, werd MOX toegediend. Gemiddelde 10E innameniveaus de staven van de dag voorafgaand aan de MOX-injectie (wit; Pre MOX), de dag van de MOX-injectie (zwart; MOX) en de dag na de injectie van de MOX (gray; Post MOX). Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM voor 12 muizen. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.001, en *** P < 0,0001 versus Pre MOX (meest linkse horizontale lijn) of Post MOX (meest rechtse horizontale lijn), Tukey meerdere vergelijking post-hoc toets is. Vanaf Huynh N. et al.gewijzigd. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Drinken in de donkere schematischeKlik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Drinken in het donker (deed). MOX (5 mg/kg) vermindert 20% v/v ethanol (20E) inname in vrouwelijke C57BL/6J muizen met behulp van een drinken in de donkere paradigma. De staven gemiddelde 20E innameniveaus op de week voorafgaand aan de MOX-injectie (pre Drug), de week van de MOX-injectie (Drug) en de week na de injectie van de MOX (na Drug). Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM voor 12 muizen (6/group) tussen zoutoplossing en MOX groepen. P < 0,0001 versus pre Drug (meest linkse horizontale lijn) of na Drug (meest rechtse horizontale lijn), Tukey meerdere vergelijking post-hoc toets is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wereldwijd ramingen blijkt dat maar liefst 76 miljoen mensen voldoen aan de criteria om te rechtvaardigen een diagnose voor Alcohol gebruik stoornis (AUD). Helaas, farmaceutische behandelingen die momenteel beschikbaar zijn grotendeels ineffectief en verdere ontwikkeling is noodzakelijk ter compensatie van de behoeften van deze klinische bevolking20. Te dien einde de volgende protocol is gericht op het vergemakkelijken van dit streven door het voorbeeldig voor twee van de meest elementaire knaagdier paradigma's drinken: twee-fles-keuze (TBC) en drinken in het donker (DID). Beide modellen meten niet-operante zelfbestuur van ethanol, waardoor muizen ethanol mondeling inslikken. In de TBC zijn paradigma, ethanol (10% v/v) en water beide beschikbaar voortdurend, wat resulteert in relatief lage ethanol bloedspiegels die een gevolg zijn van een episodisch en geleidelijke ethanol consumptiepatroon. Dit model is het beste voor de beoordeling van lagere niveaus van ethanol inname als een voorkeur tastant en daarom wordt gezegd dat vergelijkbaar is met de menselijke "matig" drinken. Figuur 2 hierboven toont representatieve resultaten voor de TBC-paradigma.
Aan de andere kant, in de DID is model ethanol (20% v/v) alleen beschikbaar voor een beperkte hoeveelheid tijd. In tegenstelling tot TBC evalueert dit model de effecten van een stof op de gedragsgestoorde relevante concentraties van ethanol, profiteren van het feit dat C57BL/6J muizen grote hoeveelheden ethanol zeer snel in de meest actieve fase van hun circadiane cyclus verbruiken zal. Deze drinken sessies optreden gedurende 4 opeenvolgende dagen, beginnen bij de 3rd h in het donker cyclus, met een duur van 2 h op dagen 1-3 en 4 uur op dag 4. Met deze procedure, muizen meestal consumeren genoeg ethanol om BECs > 100 mg/dL en vertonen gedrags bewijs van dronkenschap. Onze representatieve resultaten voor de paradigma DID worden weergegeven in Figuur 4. Hoewel we BECs niet voor deze muizen meten deed, zijn hun drinken niveaus vergelijkbaar met die gemeld in de literatuur dat BECs meer dan 100 mg/dL13,14,15 bereikt.
Beide paradigma's hebben beperkingen. Tijdens exemplaren als mondelinge gavages de voorkeur wijze van toediening voor farmacologische testen van loodverbindingen, esophogeal trauma veroorzaakt door de procedure kan een belemmering vormen ethanol zelfbestuur in beide paradigma's. Dit geldt met name voor het DID-model, die een hogere concentratie van ethanol (20%) wordt gebruikt en die kunnen huidige gevallen waar de farmacokinetiek van de drug vereisen de drinken sessie starten voordat de dieren hebben gehad voldoende tijd om te herstellen van de procedure. Dit zou duidelijk in een controlegroep drinken op niveaus die overeenkomen met tot BECs ver beneden de verwachte 0.08. We hebben moeite met force voedingen zowel met de DID en TBC ervaren in ons lab. We konden deze problemen omzeilen door het formuleren van onze compounds, zodat ze konden worden geleverd met behulp van een mondeling oplossen smalle strook (ODS)19.
Bovendien, in de DID-model in het bijzonder gezien het feit dat de toegangsperiode ethanol zo kort van duur is, drug dosering moet gebeuren tijdens een vooraf geselecteerde tijd de lichte cyclus die wordt gekozen overeenkomstig de farmacokinetiek van de drug zodat de samengestelde is op / of nadert de maximale hersenen concentratie tijdens het drinken. Als een farmacokinetische analyse kan niet worden uitgevoerd, zou een alternatieve aanpak zijn om een tijd cursus evalueren van de gedragsmatige effecten van het geneesmiddel met behulp van TBC. Na deze logica, door drinken bewakingsactiviteit op uurbasis, en het bepalen van de piek anti-alcohol effecten, een kon redelijk strategize wanneer drugs door de overheid gereguleerde19 worden moeten.
Terwijl het veld van alcoholisme verschillende diermodellen heeft te onderzoeken van de verschillende fysiologische en gedragsmatige aspecten van AUD8, beschrijft het volgende protocol twee veelgebruikte paradigma's, die het mogelijk maakt voor de vergelijkingen van de resultaten over laboratoria. Een tweede voordeel is dat deze methoden heel simpel zijn: benutten hun handige tijdens acute en chronische studie gelijkaardig aan de voorbeelden hierboven. Bovendien, in tegenstelling tot andere veelgebruikte alcohol paradigma's, zoals Operante conditionering en damp kamer paradigma's, kan de methodologie die wij hier hebben beschreven worden uitgevoerd zonder de behoefte aan speciale apparatuur. Anekdotische, is het waarschijnlijk dat bijna alle onderdelen van het drinken apparaat kunnen worden gevonden in een prototypische institutionele vivarium. Er zijn ook verschillende manieren om het wijzigen van de protocollen die hier wordt beschreven, zodat ze best de doelstellingen van elk experiment passen kunnen. Bijvoorbeeld, onze DID procedure het beste is voor de acute effecten van een geneesmiddel te testen op een enkele drinken sessie (overdag dag 4). We hebben echter aangetoond dat Meerdaags drug dosering kan worden geëvalueerd door de zijvlakken van de drinken sessies tot 4 opeenvolgende dagen van 2 uur per dag toegang, in tegenstelling tot de huidige 2 uren van toegang op de dagen 1-3 en 4 uur op dag 419. Muizen kunnen ook worden overgedragen van de ene paradigma naar de andere, of opnieuw getest voor extra doses / verschillende verbindingen, met een eenvoudige 1-2-weekse washout periode ertussen.
Er zij op gewezen dat de drug-geïnduceerde wijzigingen in drinken waargenomen door middel van deze methoden grondig moet worden onderzocht om te bepalen of de effecten selectief voor alcohol zijn of als ze misschien wel het resultaat van toxiciteit. Voor meer informatie over besturingselementen moet de lezer verwijzen naar Yardley et al. 20 geen enkele paradigma model kunt alle aspecten van deze aandoening. In plaats daarvan onderzoekt elk paradigma meestal een paar van de belangrijkste kenmerken die zijn gekoppeld aan AUD. De TBC- en DID modellen hier beschreven, zijn gekoppeld aan de fuif/intoxicatie fase van de cyclus van de verslaving. Voor een grondiger inzicht in het nut van de compound, moeten meerdere preklinische drinken modellen worden benut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DLD en LA zijn uitvinders op een octrooi voor de herbestemming van ivermectine en verwante avermectins voor de behandeling van aandoeningen van het gebruik van alcohol. De auteurs hebben geen andere conflicten van belang en bent volledig verantwoordelijk voor de wetenschappelijke inhoud van het papier.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund, gedeeltelijk door onderzoek verleent SC CTSI NIH/NCRR/NCATS--UL1TR000130 (D.L.D.), AA022448 (D.L.D.) en de USC School voor farmacie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L graduated cylinder | VWR | https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co | To prepare ethanol solution. |
| 1 L glass bottle | Pyrex (Fisher Scientific) | https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752 | To prepare ethanol solution. |
| 100 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311 | To prepare ethanol solution. |
| Analox | One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine | ||
| ball-bearing sipper tubes | Ancare Corp. | http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point | Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100 |
| C57BL/6J Mice | Jackson lab | https://www.jax.org/strain/000664 | May also come from internal breeding colony |
| disposable serological pipets | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged | 10 mL, 18 mL, or 25 mL |
| ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC | Decon Labs (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec | --- |
| heat gun | Master Appliances Corp. | http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/ | |
| heat shrink tubing | --- | --- | Diameter: 3/8 inches |
| industrial knife/blade | --- | --- | --- |
| metal cage plate | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| mouse RO water | --- | --- | Should be available through the university/institutional vivarium |
| portable electronic scale | Ohaus (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus | --- |
| red light headlamp | nyteBright (Amazon) | https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1 | --- |
| silicone stoppers | Fisher | --- | --- |
| thermometer | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232 | --- |
| weigh boat | VWR International (VWR) | https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes | The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative |
References
- Litten, R. Z., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Discovery, Development, and Adoption of Medications to Treat Alcohol Use Disorder: Goals for the Phases of Medications Development. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (7), 1368-1379 (2016).
- Grant, B. F., Dawson, D. A., Stinson, F. S., Chou, S. P., Dufour, M. C., Pickering, R. P. The 12-month prevalence and trends in DSM-IV alcohol abuse and dependence: United States, 1991-1992 and 2001-2002. Drug and Alcohol Dependence. 74 (3), 223-234 (2004).
- Sacks, J. J., Gonzales, K. R., Bouchery, E. E., Tomedi, L. E., Brewer, R. D. National and State Costs of Excessive Alcohol Consumption. American Journal of Preventive Medicine. 49 (5), 73-79 (2015).
- Litten, R. Z., et al. Medications development to treat alcohol dependence: a vision for the next decade. Addiction Biology. 17 (3), 513-527 (2012).
- Alcoholism: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry Food and Drug Administration. , Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm433618.pdf (2015).
- Johnson Medication Treatment of Different Types of Alcoholism. American Journal of Psychiatry. 167 (6), 630-639 (2010).
- Litten, R. Z., Wilford, B. B., Falk, D. E., Ryan, M. L., Fertig, J. B. Potential medications for the treatment of alcohol use disorder: An evaluation of clinical efficacy and safety. Substance Abuse. 37 (2), 286-298 (2016).
- Litten, R. Z., Ryan, M. L., Falk, D. E., Reilly, M., Fertig, J. B., Koob, G. F. Heterogeneity of Alcohol Use Disorder: Understanding Mechanisms to Advance Personalized Treatment. Alcoholism: Clinical and Experimental. Research. 39 (4), 579-584 (2015).
- Schuckit, M. A., et al. A Genome-Wide Search for Genes That Relate to a Low Level of Response to Alcohol. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 25 (3), 323-329 (2001).
- Batki, S. L., Pennington, D. L. Toward Personalized Medicine in the Pharmacotherapy of Alcohol Use Disorder: Targeting Patient Genes and Patient Goals. American Journal of Psychiatry. 171 (4), 391-394 (2014).
- Koob, G. F. Theoretical frameworks and mechanistic aspects of alcohol addiction: alcohol addiction as a reward deficit disorder. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 3-30 (2013).
- Yoneyama, N., Crabbe, J. C., Ford, M. M., Murillo, A., Finn, D. A. Voluntary ethanol consumption in 22 inbred mouse strains. Alcohol. 42 (3), 149-160 (2008).
- Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
- Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: A model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
- Crabbe, J. C., Spence, S. E., Brown, L. L., Metten, P. Alcohol preference drinking in a mouse line selectively bred for high drinking in the dark. Alcohol. 45 (5), 427-440 (2011).
- Sprow, G. M., Thiele, T. E. The neurobiology of binge-like ethanol drinking: Evidence from rodent models. Physiology & Behavior. 106 (3), 325-331 (2012).
- Neasta, J., Hamida, B., Yowell, Q., Carnicella, S., Ron, D. Role for mammalian target of rapamycin complex 1 signaling in neuroadaptations underlying alcohol-related disorders. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (46), 20093-20098 (2010).
- Huynh, N., et al. Preclinical development of moxidectin as a novel therapeutic for alcohol use disorder. Neuropharmacology. 113, Pt A 60-70 (2017).
- Egli, M. Can experimental paradigms and animal models be used to discover clinically effective medications for alcoholism. Addiction Biology. 10 (4), 309-319 (2005).
- Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63 (2), 190-201 (2012).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
