Summary
Ruhende und aktive Krebs Zelle Phänotypen zeichneten sich mit quantitativen Phase Bildgebung. Cell Proliferation, Migration und Morphologie-Assays wurden integriert und in einer einfachen Methode analysiert.
Abstract
Der Erwerb des Phänotyps Angiogenese ist ein wesentlicher Bestandteil der Flucht aus dem Tumor Dormanz. Obwohl mehrere klassische in-vitro- Assays (z. B.Proliferation, Migration und andere) und in-Vivo -Modelle entwickelt wurden, um zu untersuchen und Angiogenese und nicht-angiogenen Zelle Phänotypen zu charakterisieren, sind diese Methoden Zeit arbeitsintensiv und erfordern oft teure Reagenzien sowie Instrumente und Fachwissen. In einer aktuellen Studie haben wir eine neuartige quantitative Phase imaging (QPI) Technik Zeitraffer und Kennzeichnung-freie Charakterisierungen von Angiogenese und nicht-angiogenen menschlichen Osteosarkom KHOS Zellen führen. Ein Gremium von zellulären Parameter, einschließlich der Zellmorphologie, Proliferation und Motilität, wurden quantitativ gemessen und mit QPI analysiert. Dieser Roman und quantitativen Ansatz bietet die Möglichkeit, kontinuierlich und nicht-invasiv relevante zelluläre Prozesse, Verhaltensweisen und Eigenschaften von Krebszellen und andere Zelltypen in integrierten und einfach zu studieren. Dieser Bericht beschreibt unser experimentelle Protokoll, einschließlich Zelle Vorbereitung, QPI Erwerb und Datenanalyse.
Introduction
Einer der frühesten Checkpoints in die Entwicklung und das Fortschreiten eines soliden Tumors ist der Erwerb von angiogenen Phänotypus, ein Markenzeichen von Krebs. Diese Progression umfasst eine Vielzahl von biochemischen und molekularen Prozessen1,2,3. Eine technische Herausforderung in der Studie von diesen wichtigen Schritt im Tumorprogression ist das Fehlen von Werkzeugen, um kontinuierlich und quantitativ charakterisieren und unterscheiden zwischen angiogenen und nicht-angiogenen Phänotypen von live Krebszellen unvoreingenommen. Die traditionelle Assays verwendet wird, um die zellulären Verhaltensweisen von Angiogenese und nicht-angiogenen Zellen untersuchen, in der Regel erfordern teure Reagenzien und Instrumente, z. B. Verbreitung/Zellwanderung assays4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 oder ergänzende in Vivo Bewertungen4,5,6,8,15,16, sowie erfordern Fachwissen und intensive Zeit und Arbeitskosten Verbrauch.
Vor kurzem hat quantitative Phase imaging (QPI) als eine neuartige Technik herausgebildet, die Time-Lapse und Kennzeichnung-freie Bewertung einer Vielzahl von Zelle Morphologie und Verhalten Parameter17,18,19, ermöglicht 20 , 21 , 22. im Gegensatz zu konventionellen Lichtmikroskopie QPI quantifiziert Variationen der Phasenverschiebung Pixel für Pixel nach Licht ein optisches Objekt durchläuft und rekonstruiert ein Autograph mit umgebauten optische Stärke und Volumen, wodurch die direkte Analyse von lebenden Zellen und die folgenden Funktionen: (1) quantitative Bildgebung, Zeitraffer und (2) nicht-invasive Bildgebung, (3) markierungsfreie Bildgebung und (4) gleichzeitige Multi-Parameter-Bildgebung. Diese Eigenschaften machen QPI ein leistungsfähiges Instrument zur Bewertung und pathologische Prozesse auf zellulärer Ebene zu verstehen.
In einer aktuellen Studie genutzt wir QPI um quantitativ charakterisieren und unterscheiden zwischen angiogenen KHOS-a und -angiogenen KHOS-N Phänotypen der menschlichen Osteosarkom Zellen in einer systematischen und quantitative Weise, Kombination von Analysen der Zellmorphologie, Proliferation und Motilität23. Bildanalyse-Software, ein Panel mit der Zelle morphologische und Verhalten wurden Parameter quantitativ zwischen angiogenen und nicht-angiogenen menschlichen Osteosarkom Zellen verglichen und fünf charakteristische Unterschiede zwischen diesen beiden identifiziert wurden Phänotypen. Dieser neuartige Ansatz bietet eine integrierte und quantitative Plattform für die Bewertung einer Vielzahl von biologisch relevante zellulären Eigenschaften.
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Protocol
Die hier beschriebenen Methoden wurden von der Boston Kinder Krankenhaus institutionelle Biosafety Committee genehmigt.
1. Zelle-Vorbereitung
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Auftauen KHOS-a und -N-Zellen
- Aufwärmen im Kulturmedium, d.h.geändert Dulbecco den Eagle Medium mit 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum (FBS) und 1 % (Vol/Vol) Penicillin/Streptomycin ergänzt.
- Nehmen Sie die kryogenen Fläschchen von Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank, Tauchen Sie unten die Fläschchen in warmem Wasser in einem 37 ° C Wasserbad ein und schütteln Sie die kryogenen Fläschchen um das Auftauen zu beschleunigen. Halten Sie den Deckel des kryogenen Fläschchen von Kontakt mit Wasser, um Verunreinigungen zu vermeiden. Sobald Zellen aufgetaut sind, Sterilisieren der kryogenen Durchstechflasche mit 70 % Ethanol Lösung sprühen und wischen das Fläschchen.
- Aspirieren Sie in einer Laminar-Flow-Kapuze sofort die Zellsuspension aus der kryogenen Durchstechflasche und auszusetzen Sie sanft in 10 mL erwärmt Kulturmedium (siehe 1.1.1). Zentrifugieren Sie Zellsuspensionen bei rund 200 X g für ca. 5-7 min.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL erwärmt Kulturmedium, und übertragen Sie in ein Fläschchen T75. Sanft pipette mehrmals Zellen gleichmäßig mit einer 10 mL Pipettieren auszusetzen.
- Legen Sie die Flasche in einen Inkubator 37 ° C mit 5 % (Vol/Vol) CO2 und feuchte Atmosphäre. Lassen Sie Zellen für mindestens 12 h befestigen.
- Ca. 3-7 Tage bis zum Zusammenfluss von 80-100 % inkubieren Sie Zellen. Ändern Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage.
-
Splitting KHOS-a und -N-Zellen
- Die Nährmedien aus der Flasche zu entfernen.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 mL sterilem PBS (1 X) ohne Kalzium und Magnesium, um nicht adhärente Zellen oder Bruch zu entfernen.
- Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung in die Flasche, und kurz schwenken Sie die Flasche um sicherzustellen, dass die Trypsin-EDTA gleichmäßig verteilt ist.
- Inkubieren Sie die Flasche für ca. 2-3 min in einem 37 ° C Inkubator oder 3-5 min bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei ca. 400 X Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Zellen sind aufgerundet und losgelöst.
- Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie 10 mL Kulturmedium und pipette vorsichtig das Medium nach oben und unten mehrmals Zelle Aggregate in einer Einzelzelle Suspension mit einer 10 mL Pipettieren aufzubrechen.
- Anzahl Zellen Zelle Zähler. Samen Sie die Zellsuspension in neuen T75 Fläschchen bei einer Dichte von 2 × 106 Zellen oder ein Verhältnis von 1:4.
- Zellen auf 80-100 % Zusammenfluss wachsen vor der Aussaat für den QPI-Experiment zu ermöglichen.
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Seeding KHOS-a und -N-Zellen für QPI
- Samen KHOS-a und -N-Zellen in 6-Well-Platten bei der Dichte von 50.000-300.000 Zellen/Brunnen mit 5 mL Kulturmedium nach Auszählung mit einer Zelle Zähler.
Hinweis: Die Aussaatdichte ist abhängig von der Zelle Proliferationsrate und den bildgebenden Zeitraum um < 100 % Zusammenfluss bei imaging-Akquisition. - Inkubieren Sie Zellen für mindestens 12 h um Anlage ermöglichen.
- Verändern Sie das Medium mit frischen Medien vor der Durchführung QPI.
- Samen KHOS-a und -N-Zellen in 6-Well-Platten bei der Dichte von 50.000-300.000 Zellen/Brunnen mit 5 mL Kulturmedium nach Auszählung mit einer Zelle Zähler.
(2) QPI-Übernahme
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Deckglas einrichten
- Das Deckglas durch mehrere Male mit entionisiertem Wasser spülen reinigen und Sterilisieren mit 75 % Ethanol-Lösung durch Untertauchen für 15 min. das Deckglas in eine sterile Laminar-Flow-Haube zum Trocknen gelegt.
- Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einem 6-Well-Platte, offensichtliche Luftblasen zu vermeiden. Sicherstellen Sie, dass die Unterseite des Deckglases in Kulturmedien (mindestens 5 mL/Na) eingetaucht ist.
- Legen Sie die Platte in den Brutschrank (37 ° C, 5 % CO2und feuchte Atmosphäre) mindestens 15 min lang equilibrate. Wenn Nebel auf das Deckglas bildet, verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen abwischen.
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Imaging-Zellen mit dem Mikroskop
- Öffnen Sie die Software, um das System, einschließlich Selbstkalibrierung von Belichtungszeit, Muster Kontrast und Hologramm Lärm zu initialisieren. Stellen Sie sicher, dass die Werte akzeptabel sind (gezeigt im grünen oder gelben Bereich).
- Platz 6-Well-Platte auf die Bühne des QPI-Mikroskops.
- Klicken Sie auf "Live Capture", und wählen Sie "Manuell" im "Software Fokus." Grob die Phasenbilder von Zellen durch Einstellung des Abstandes der Arbeit im "Microscope Setting" konzentrieren, Umrisse für Zellen in Phasenbilder zu erhalten. Ändern Sie auf "Automatisch" in "Software konzentrieren."
- Klicken Sie auf "Neues Experiment" erstelle ich ein neues Experiment. Beginnen Sie mit der Auswahl des Bildes Erwerb Positionen mit der Maus oder den Pfeiltasten auf dem numerischen Pad. Klicken Sie auf "Remember" nach jeder Auswahl. Normalerweise werden 3-5 Standorte für jede Probe ausgewählt.
- Richten Sie die bildgebenden Intervalle und Zeitraum im Abschnitt "Zeitraffer".
Hinweis: Um Krebszellen deutlich zu verfolgen, sollten die Intervalle werden kürzer als 5 min. 48 Stunden als die Frist für die Kombination QPI Analyse festgelegt ist. - Starten Sie das Experiment durch Klicken auf "Capture", die automatisch zu konzentrieren und die Bilder zu den Zeitpunkten Einstellung zu erwerben.
(3) Datenanalyse
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Zellanalyse Morphologie
- Klicken Sie auf "Zellen zu identifizieren." Passen Sie die numerischen Einstellung für "Hintergrund-Schwelle", so dass Zellbereiche auch Hintergrundgeräusche getrennt sind. Passen Sie die Anzahl der Einstellung für "Objektgröße" um sicherzustellen, dass jede Zelle einen Kern hat. Pflegen Sie konsistente Parameter für Proben, die müssen verglichen werden, da diese die letzte Fläche und das Volumen Messungen beeinflussen können. Manuell ändern Sie Zelle Segmente mithilfe von "Manuelle Änderungen,", wenn nötig.
- Verwenden Sie die Funktion "Analysieren von Daten" in der Software, um Zellen zu analysieren. Eine neue Datenanalyse zu starten, indem Sie auf "Neue Analyse." Ziehen Sie die ausgewählten Bilder in "Quelle Frames" Tab und Zelle Morphologie Parameter einschließlich Zellbereich (µm-2), optische Dicke (µm) und Volumen (µm3) für jede einzelne Zelle. Scatter Plot oder Histogramm-Modus und Export Daten als Tabellen oder Abbildungen zu wählen.
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Verbreitung der Zellanalyse
- Wählen Sie mindestens 5 Bilder für die verschiedenen Zeitpunkte von Interesse (z.B., Initial, 12 h, 24 h, 36 h und 48 h). Rekord-Zell-Zahlen, die durch die Software bereitgestellt werden.
- Zur Abschätzung der Verdopplungszeit Zellzahlen nach Normalisierung mit den ersten Zahlen des Grundstückes und exponentielle Wachstumskurven entsprechen.
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Zelle Bewegungsanalyse
- Verwenden Sie die Funktion "Track Zellen" in der Software. Klicken Sie auf "Neue Analyse" um eine neue Datenanalyse zu starten. Drag-Serie von Bildern für einen ausgewählten Zeitraum (z.B.4 h nach 24 h Inkubation) in die Registerkarte "Quelle Frames" und wählen nach dem Zufallsprinzip 10-30 Zellen Zellen unter den Auswahlmodus "Zellen hinzufügen". Schließen Sie die Zellen an den Rändern und diejenigen aus dem Blickfeld.
- Überprüfen Sie sorgfältig die Verfolgung in der Reihe der Bilder. Für den Fall, dass das System verliert die Spur einer Zelle oder die falsche Zelle tracks, manuell anpassen der Tracking-Zelle indem Sie auf "Identifizieren", um Zellen zu identifizieren oder klicken auf "Speicherort ändern" unter "Auswahlmodus" die Zellenposition ändern.
- Wählen Sie rose Plot Zelle Trajektorien in "Plot-Bewegung" oder Grundstück für die andere Bewegung-bezogenen Parameter in "Plotobjekte," wie Motilität Geschwindigkeit (µm/h), Motilität (µm), Migration (µm) und Migration Direktheit. Exportieren Sie die Daten als Tabellen oder Abbildungen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine typische Zelle Morphologie Charakterisierung. Bilder werden als Hologramme (Abbildung 1A-B) und 2D-Bilder (Abbildung 1-D) dargestellt. Optische Zelle dicken (berechnet aus dem Brechungsindex und optische Weglänge) werden per Linienprofil oder eine ganze Zelle Messung quantifiziert. Scatter plots der Gegend und der Dicke der KHOS-A und KHOS-N-Zellen für eine ganze Zelle gemessen dargestellt wurden, wie in Abbildung 1E-G, wo diese beiden Phänotypen unterschiedliche Verteilungsmuster angezeigt. Die durchschnittlichen Zahlen aus dem Histogramm (Abbildung 1 H-M) oder die exportierten Dateien gezeigt, dass KHOS-A Zellen kleiner Zellbereiche und größere dicken als KHOS-N-Zellen haben.
Verwenden die Zelle Zählfunktion, erhielten Zelle Verbreitung Profile (Abbildung 2). Diese zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen KHOS-a und -N-Zellen. Darüber hinaus konnte die Verdopplungszeit Zelle aus der Verbreitung Kurve (d. h., 24-26 h), geschätzt werden, die auch keine signifikanten Unterschiede zeigten.
Abbildung 3A -D zeigt die typischen Verfolgung von KHOS-a und -N-Zellen in ungerichteten (zufällig) motion-Modus und die entsprechenden Bahnen. Die durchschnittliche Zelle Motilität (Abbildung 3E-F), Motilität Geschwindigkeit ()Abbildung 3-H), Migration Distanz ()Abbildung 3I-J), und Migration Direktheit ()Abbildung 3 K-L) versus Aufnahmezeit aufgetragen wurden. Im Vergleich zu KHOS-N Zellen, zeigte KHOS-A Zellen Motilität schneller, was zu mehr Beweglichkeit und Migration Abstand.
Abbildung 1: Zelle Morphologie Charakterisierung. (A-B) Repräsentative Hologramme von KHOS-A (A) und -N-Zellen (B) durch quantitative phase Bildgebung. Maßstabsleiste ist 191,4 µm. Kartenausschnitte in der rechten unteren Ecke die quantitative Linienform der optischen Dicke für die blaue Linie gezeichnet in den Bildern zeigen. (C-D) Vertreter QPI Bilder der Zelle Segmentierung für KHOS-A (C) und -N-Zellen (D). Maßstabsleiste ist 100 µm. Zellen an den Rändern zur Quantifizierung ausgeschlossen wurden. (E-G) Gemessene Dicke versus Bereich für einzelne Zellen von KHOS-A (E) und -N-Zellen (F). Jeder Punkt steht für eine einzelne Zelle (n = 200-300). Die Überlappung Handlung (G) zeigt deutlich unterschiedliche Abstrahlverhalten für KHOS-A und -N-Zellen. (H-M) Die Histogramme der Zelle Dicke (H-ich), Fläche (J-K)und Volumen (L-M) -Verteilung für KHOS-A (H, J, L) und -N-Zellen (I, K, M). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Zell-Proliferation Charakterisierung. Der obere Bereich zeigt Segmentierung der repräsentativen Zelle für Zelle Zahlen zählen. Maßstabsleiste ist 100 µm. Die Bodenplatte zeigt die entsprechenden Proliferationsrate der berechneten Zelle. Daten präsentiert sich als Mittelwert ± Standardabweichung. Studenten t-Test (ungepaarte, zweiseitige) wurde für statistische Auswertungen verwendet. Testergebnisse waren bedeutende betrachtet, wenn p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zelle Bewegung Charakterisierung. (A-B) Repräsentative Zelle Tracking Bilder für KHOS-A (A) und -N (B) Zellen. Maßstabsleiste ist 100 µm. ausgewählte Zellen mit unterschiedlichen Farben dargestellt sind. Zelle Motilität in 4 h Zeitraum aufgezeichnet wird mit der entsprechenden farbigen Linie dargestellt. (C-D) Zelle Flugbahnen von KHOS-A (C) und -N (D) Zellen dargestellt unter dem Gesichtspunkt der Ursprung (0,0). Jede Zeile repräsentiert eine einzelne Zelle. KHOS-A-Zellen zeigten eine mehr zerstreut Muster verglichen mit KHOS-N-Zellen (n = 10). (E-L) Erfasst quantitative Parameter während des untersuchten Zeitraums für Zelle Bewegung von KHOS-A (E, G, I, K) und -N (F, H, J, L) Zellen, einschließlich Zelle Motilität (E-F), Motilität Geschwindigkeit (G-H), Migration Abstand (I-J ), und Migration Direktheit (K-L). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie beschreiben wir eine in-vitro-, nicht-invasiv und markierungsfreie Methode mit QPI, um die Angiogenese und nicht-angiogenen Phänotypen der menschlichen Osteosarkom Zellen quantitativ zu charakterisieren. Durch diese integrierte, Hochdurchsatz-Methode, einschließlich der Zelle, Zelle Dicke, Zellvolumen, Proliferationsrate, Verdoppelung der Zeit, Migration Direktheit, Motilität Geschwindigkeit, Migration und Motilität wurden gleichzeitig mehrere zellulären Parameter analysiert.
Verglichen mit der konventionellen Assays, die Zellmorphologie und Zelle Verhalten zu beurteilen, diese Methode nicht nur spart Zeit und Arbeit, sondern bietet auch genaue und detaillierte Informationen. Die Lage des QPI-Systems (innerhalb der Zelle Inkubator) reduziert z. B. Störungen von Umweltveränderungen wie Fotografieren in einer Umgebung (Raumtemperatur und Atmosphäre)23. Darüber hinaus konnte optische Zelle Dicke und Volumen von Phasenverschiebung, konvertiert mit QPI, abgerufen werden, wobei nur Zellbereich von der traditionellen Zelle bildgebende Verfahren gemessen wird. Diese Funktion des QPI erzeugt mehr detaillierte Informationen für quantitative Vergleiche der verschiedenen Zelle Phänotypen.
Richtige Aussaatdichte der Zellen von Interesse ist von entscheidender Bedeutung in der aktuellen Methode. Während die bildgebenden Aufnahmephase Zellen sollen weniger als ein konfluierende Monolage aufgrund der Einschränkung dieser kohärenten QPI-Technik, dass imaging Erwerb nur mit einem Fokus Panel durchgeführt werden konnten die Teilinformationen in der z verlieren kann Richtung (d.h. überlagerte Zellen). Darüber hinaus sind Charakterisierungen mit QPI auf das 2D Format, das nicht optimal für Zellinvasion in Z-Richtung in die extrazelluläre Matrix ist beschränkt. Mehreren voreingestellten Brennweiten sind für die zukünftige Entwicklung der QPI-Methode erforderlich.
Neben Zellzählung bietet QPI Bildgebung auch informative Bilder für das Studium der Mitose der Zelle ohne weitere Kennzeichnung21,23,24. Während der Zellteilung durch die offensichtliche Abnahme Zelle Fläche und das Volumen erkennbar war, hat die Fähigkeit, Objektiv und quantitativ definieren und Zellzyklus Phasen für einzelne Zellen zu unterscheiden noch eingerichtet werden. Diese Funktion würde die Forschung in Bezug auf Zellanalyse für Stammzell-Differenzierung, Medikamente und Zellzyklus Festnahme erheblich erleichtern.
Durch die Vorteile des Seins quantitative markierungsfreie und einfach zu bedienen haben diese Methode auch nützliche klinische Anwendungen25,26,27,28,29,30 . Dieses System könnte beispielsweise in der Charakterisierung von heterogenen Zellpopulationen, einschließlich der ruhende und aktive Zellen im menschlichen Tumoren eingesetzt werden. Die gekennzeichnete Zelle morphologischen und verhaltensbezogene Unterschiede zwischen ruhende und aktive Krebszellen können potenziell zu entschlüsseln, die molekularen Mechanismen Tumor Dormanz in menschlichen Krebserkrankungen verwendet werden.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen dankbar die Unterstützung der Breast Cancer Research Foundation und der Advanced Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
References
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