Summary

Een Time-lapse, Label-vrije, kwantitatieve fase Imaging studie van slapende en actieve menselijke kankercellen

Published: February 16, 2018
doi:

Summary

Slapende en actieve kanker cel fenotypen werden gekenmerkt met behulp van kwantitatieve fase imaging. Cel proliferatie, migratie en morfologie assays werden geïntegreerd en geanalyseerd in één eenvoudige methode.

Abstract

De overname van het fenotype van de angiogenic is een essentieel onderdeel van de ontsnapping uit de tumor rustperiode. Hoewel verschillende klassieke in vitro testen (bijvoorbeeld, proliferatie, migratie en anderen) en in vivo modellen zijn ontwikkeld om te onderzoeken en karakteriseren van angiogenic en niet-angiogenic cel fenotypen, zijn deze methoden tijd en intensieve arbeid, en vereisen vaak dure reagentia en instrumenten, alsmede aanzienlijke deskundigheid. In een recente studie gebruikten we een nieuwe kwantitatieve fase imaging (QPI) techniek te voeren time-lapse en labeling-gratis karakterisaties voor angiogenic en niet-angiogenic menselijke Osteosarcoom KHOS cellen. Een panel van cellulaire parameters, met inbegrip van de morfologie van de cel proliferatie en motiliteit, werden kwantitatief gemeten en geanalyseerd met behulp van QPI. Deze roman en kwantitatieve benadering biedt de mogelijkheid om voortdurend en niet-gebeurt studie relevante cellulaire processen, gedrag, en kenmerken van kankercellen en andere celtypes in een eenvoudige en geïntegreerde wijze. Dit verslag beschrijft onze experimentele protocol, met inbegrip van de voorbereiding van de cel, QPI acquisitie en data-analyse.

Introduction

Een van de vroegste controlepunten in de ontwikkeling en de vooruitgang van een solide tumor is de overname van het fenotype van de angiogenic, een kenmerk van kanker. Deze progressie omvat allerlei biochemische en moleculaire processen1,2,3. Een technische uitdaging in de studie van deze belangrijke stap in de tumor progressie is het gebrek aan tools om continu en kwantitatief karakteriseren en onderscheid maken tussen angiogenic en niet-angiogenic fenotypes van levende kankercellen op onpartijdige wijze. De traditionele testen wordt gebruikt om te onderzoeken het cellulaire gedrag van angiogenic en niet-angiogenic cellen meestal dure reagentia en instrumenten vereisen, bijvoorbeeld cel proliferatie/migratie testen4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 of aanvullende in-vivo evaluaties4,5,6,8,15,16, evenals vereisen aanzienlijke expertise en intensieve tijd en arbeid consumptie.

Onlangs, kwantitatieve fase imaging (QPI) heeft ontpopt als een nieuwe techniek waarmee time-lapse en labeling-vrije beoordeling van een verscheidenheid van cel morfologie en gedrag parameters17,18,19, 20 , 21 , 22. in tegenstelling tot conventionele optische microscopie, QPI kwantificeert variaties van faseverschuiving pixel voor pixel nadat licht een optische object passeert, en een holograaf reconstrueert met geconverteerde optische dikte en volume, waardoor de directe analyse van levende cellen en de volgende functies: (1) kwantitatieve beeldvorming, (2) niet-invasieve en time-lapse imaging, beeldvorming (3) label-vrij, en (4) gelijktijdige Multi-parameter imaging. Deze eigenschappen maken QPI een krachtig hulpmiddel om te beoordelen en begrijpen van pathologische processen op cellulair niveau.

In een recente studie, die we gebruikt QPI kwantitatief karakteriseren en onderscheid maken tussen angiogenic KHOS-A en niet-angiogenic KHOS-N fenotypes van menselijke Osteosarcoom cellen op een systematische en kwantitatieve wijze combineren van analyses van cel morfologie, proliferatie, en motiliteit23. Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, een panel van cel morfologische en gedrag parameters werden kwantitatief vergeleken tussen angiogenic en niet-angiogenic menselijke Osteosarcoom cellen en vijf kenmerkende verschillen tussen deze twee werden geïdentificeerd fenotypen. Deze nieuwe benadering biedt een geïntegreerde en kwantitatieve platform voor de beoordeling van een verscheidenheid aan biologisch relevante cellulaire kenmerken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn door de Boston Children’s Hospital institutionele bioveiligheid Comité goedgekeurd. 1. cel voorbereiding Ontdooien KHOS-A en -N cellen Opwarmen kweekmedium, dat wil zeggen, de Dulbecco bewerkt Eagle medium aangevuld met 10% (vol/vol) foetaal kalfsserum (FBS) en 1% (vol/vol) penicilline/streptomycine. Nemen van de cryogene flesjes van cellen uit de vloeibare stikstof tank, de onderkant van d…

Representative Results

Figuur 1 toont een typische cel morfologie karakterisering. Afbeeldingen worden gepresenteerd als holographs (figuur 1A-B) en 2D-afbeeldingen (Figuur 1 c-D). Optische cel diktes (berekend op basis van de brekingsindex en optische weglengte) zijn gekwantificeerd via lijn-profiel of een hele cel meting. Scatter percelen van het gebied en de dikte van KHOS-A en KHOS-N c…

Discussion

In deze studie beschrijven we een in vitro, niet-invasieve en label-vrije methode QPI met kwantitatief karakteriseren de fenotypen van het angiogenic en niet-angiogenic van menselijke Osteosarcoom cellen. Meerdere cellulaire parameters hebben gelijktijdig met deze geïntegreerde, hoge-doorvoer methode, met inbegrip van cel gebied, de dikte van de cel, cel volume, proliferatie tarief, verdubbeling van de tijd, migratie directheid, beweeglijkheid, snelheid, migratie en motiliteit is geanalyseerd.

<p class="jov…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de steun van de Breast Cancer Research Foundation en de Advanced Medical Research Foundation.

Materials

T75 flask Corning, NY, USA 353136
6-well plates  Corning, NY, USA 3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11965092
Fetal bovine serum (FBS)  Atlanta Biologicals, GA, USA S11550
Penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific, MA, USA 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 10010023
Beckman Z1 Coulter counter Beckman Coulter, IN, USA Z1 
HoloMonitor M4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden M4 Microscope
Hololid Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden PHI 8020
HStudioM4 Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden HStudioM4 Software

References

  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001 (2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395 (2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O’Toole, P. Ptychography–a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369 (2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546 (2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000 (2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676 (2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976 (2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257 (2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Play Video

Cite This Article
Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. J. Vis. Exp. (132), e57035, doi:10.3791/57035 (2018).

View Video