Summary
Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.
Abstract
Kan - beyin bariyerini (BBB) toksinler ve patojenler dolaşımda beyin microenvironment karşı korur ve beyin homeostazı tutar özel bir engeldir. Asıl bariyer sıkı hücreler arası kavşaklar ve plazma membran üzerinde ifade sızma taşıyıcılar bariyer fonksiyonu sonuçları beyin kapiller endotel hücreleri sitelerdir. Bu işlev perisitlerden ve birlikte nörovasküler birimi (NVU) formu astrocytes tarafından düzenlenmiştir. Felç, Alzheimer hastalığı (Ah), gibi çeşitli nörolojik hastalıklar Beyin Tümörleri bir Engelli BBB işlevi ile ilişkilidir. BBB geçirgenliği değerlendirilmesi bu nedenle nörolojik hastalığın şiddeti ve istihdam tedavi stratejileri başarı değerlendirilmesinde çok önemlidir.
Henüz birkaç fare başarıyla uygulanmış olan sağlam geçirgenliği tahlil hem genetik hem deneysel modeller Burada basit bir mevcut. Son derece nicel ve izleyici Floresans analiz tarafından yaygın olarak uygulanan mikroskobu ile karşılaştırıldığında objektif yöntemidir. Bu yöntemde, fareler intraperitoneally sulu etkisiz floresan izleyiciler fareler anesthetizing tarafından takip bir karışımı ile enjekte edilir. Kardiyak perfüzyon hayvanların beyin, böbrek veya diğer organlara hasat öncesinde gerçekleştirilir. Organları homojenize ve centrifuged floresan ölçüm tarafından süpernatant takip. Hemen önce perfüzyon kardiyak ponksiyon çizilmiş kan damar yuvası normalleştirme amaçla hizmet vermektedir. Doku floresan bir nicel elde etmek için ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş izleyici geçirgenliği dizin. Ek onay için kontralateral hemi-beyin immünhistokimya için korunmuş izleyici Floresans görselleştirme amaçlar için yararlı olabilir.
Introduction
Mikrovasküler endotel hücreleri (ECs) Bazal lamina ensheathed olan yakından ilişkili perisitlerden (PCs) ve sonunda ayakları1 ile membran örtmek astrocytes (ACs) tarafından desteklenen, kan - beyin bariyerini (BBB) oluşur ,2. ECs destekleyen ve bariyer fonksiyonu, öncelikle ACs ve PC'ler, düzenleyen birkaç hücre tipleri ile etkileşim ve aynı zamanda sinir hücreleri ve microglia, Bütün bunlar birlikte form nörovasküler birimi (NVU). NVU kan yoluyla toksinlerin ve patojenler beyin girmesini sınırlayan BBB, işlev için önemlidir. Bu işlev mevcut ve taşıyıcılar gibi p-glikoprotein (P-gp) bu sızma endotel girin molekülleri içine geri eylem nedeniyle ECs arasında sıkı kavşak molekülleri claudin-5, occludin, zonula occludens-1, gibi bir sonucudur gemi Lümen1,2,3. BBB ancak besin (glikoz, demir, amino asitler) gibi temel moleküllerin taşıması için özel taşıyıcılar üzerinde EC plazma membran1,2,3ifade tarafından sağlar. EC katman son derece çeşitli taşıyıcılar luminal (kan bakan) ve özel ve vektörel taşıma fonksiyonu4için,5 izin vermek için abluminal (beyin bakan membranlar) arasındaki dağılımı açısından polarize . BBB sıkıca CNS çevre düzenlenmesi ile ilgili koruyucu olmakla birlikte, CNS ilaç dağıtım fonksiyonel BBB ile Parkinson gibi hastalıklarda için büyük bir sorun olduğunu. BBB disfonksiyonu olan nörolojik hastalıklar bile, özellikle bariyer disfonksiyonu örneğin Alzheimer hastalığı (Ah) gibi belirli ışınlama hedefleri zarar dahil olabilir gibi beyin ilaç dağıtım arttığını kabul edemiyor. Yılında, birkaç amiloid beta taşıyıcılar LRP1, öfke, P-gp gibi dysregulated olduğu bilinmektedir ve bu nedenle bu taşıyıcılar hedefleme beyhude6,7,8olabilir. BBB inme, reklam, menenjit, multipl skleroz ve Beyin Tümörleri9,10,11' gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda bozulmuş. Bariyer fonksiyonu geri tedavi stratejisinin önemli bir parçasıdır ve böylece onun değerlendirmesi önemlidir.
Bu çalışmada, objektif ve biz başarılı bir şekilde her iki transgenik ve deneysel hastalık modelleri10,12,13 birkaç fare satırlarına uygulanır Rodents geçirgenliği tahlil için nicel protokolü bir tarif var ,14. Yöntem izleyiciler damar yuvası kaldırmak için floresan izleyiciler tarafından farelerin perfüzyon takip basit bir mayi iğne temel alır. Beyin ve diğer organlara toplanan yazı perfüzyon ve nesne tarafından değerlendirildi geçirgenliği ve doku homogenates bir plaka okuyucu Floresans ölçümleri dayalı mutlak geçirgenliği dizin vardır. Tüm ham Floresans değerleri doku homogenates veya herhangi bir izleyici almazsınız sham hayvanlardan serum kullanarak arka plan için düzeltilir. Geniş normalizations serum cilt, serum Floresans ve böylece mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir geçirgenliği dizin oluşturan dokular, ağırlığı dahil edilir. Biz daha önce12gerçekleştirilen vardı gibi gruplar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için mutlak geçirgenliği dizin değerlerini kolayca oranları dönüştürülebilir. Aynı anda, saklı hemi-beyin ve böbrek Floresans mikroskobu10tarafından izleyici görselleştirme için yararlanılabilir. Klasik Floresans mikroskobu geçirgenliği bölgesel farklılığı hantal olsa doku bölümü ve yarı kantitatif analiz için görüntü öznel seçim nedeniyle elde etmek önemli olabilir. Ayrıntılı adımlar iletişim kuralında sunulmaktadır ve notlar uygun olan yerlerde eklenir. Bu başarıyla diğer küçük hayvanlar için ölçeklendirilebilir farelerde vivo içinde geçirgenliği tahlil gerçekleştirmek için gerekli bilgileri sağlar. Tahlil tarayıcıları birçok türde uygulanabilir şarj ve boyutu için izin alarak geçirgenliği değerlendirme tarayıcıları farklı floresan spectra ile kombinasyonu tarafından.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanların son derece dikkatli ağrı veya rahatsızlık işlem sırasında en aza indirerek ele. Bu yordam kuruluşumuzun hayvan bakımı kuralları izler ve yerel Komitesi (Regierungspraesidium Darmstadt, onay numarası FK/1044) tarafından onaylanmış.
Vivo geçirgenliği tahlil farelerde için iş adımları şematik Resim 1' de gösterilen. Her adımı ayrıntılarını aşağıda açıklanmıştır.
1. hayvan taşıma
-
Hazırlık ve izleyiciler ve anestezi yönetimi
- En az bir gün önce geçirgenliği tahlil katıştırma doku etiketli tüpler ve kalıpları hazırlamak. Temiz duman başlık altında çalışan ve % 80 etanol ile temizlenmiş araçları kullanarak protokol steril koşullarını korumak. 3-6 ay için geçerli protokol Olgun Yetişkin yaş grubunda erkek veya kadın vahşi-türü (WT) veya angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) CD1 fare kullanın. 10daha önce açıklandığı gibi farelerin Genotipleme gerçekleştirin.
Not: % 80 alkol steril aletlerin oluşturmayacaktır ancak kirlenme hazırlanan numunelerin en aza indirmek olacaktır. - Steril PBS tüm izleyiciler 2 mM stokları sulandırmak ve ışık-20 ° C'de korunan aliquots depolayın
- Tarayıcıları (Tetramethyl rodamine) TMR gibi seçin ve (floresein isothiocyanate) FITC ayrı uyarma/emisyon spectra ve çoğu lizin her iki tarafından Floresans mikroskobu boyalar arasında en az girişime sonuçlanan tamir edilebilir (TMR kullanarak veya FITC sırasıyla filtre) ve fluorometry geçirgenliği tahlil için bir plaka okuyucu tarafından.
Not: TMR dextran 3 kD ve FITC dextran 3 kD çalışmada kullanılan her iki lizin tamir edilebilir olduğunu ve dolayısıyla da immunohistokimyasal analiz sonrası fiksasyon ile aldehitler için bölgesel farklılıklar araştırmak amacıyla kullanılabilir. - Tüm hayvanların son derece dikkatli Kurulusları yönergeleri izleyerek başa. İntraperitoneally her fare her izleyici 100 µL bir 1:1 karışımı10,13' te kullanarak ek bir izleyici birleştirildiğinde bu kadar 200 µL artırılabilir 100 µL izleme çözümü ile enjekte et. PBS autofluorescence arka plan çıkarma için sahte denetimi olarak hizmet etmek için izleyiciler yerine tek başına en az bir hayvan enjekte.
- 5 dakika sonra izleyici enjeksiyon, ketamin ve Xylazine bir IP enjeksiyon hayvanla anestezi (5-10 mg ve 100 mg % 0,9 kg vücut başına Saline ağırlık sırasıyla, kokteyl 25 g fare başına 150 µL).
Not: hayvan anestezi ve perfüzyon/kurban arasındaki dönemi kısa olduğu gibi veteriner merhem gözünü işlem sırasında uygulanmadı nerede herhangi bir gözünde kurutma değildi (10 dakika) görülmektedir.
- En az bir gün önce geçirgenliği tahlil katıştırma doku etiketli tüpler ve kalıpları hazırlamak. Temiz duman başlık altında çalışan ve % 80 etanol ile temizlenmiş araçları kullanarak protokol steril koşullarını korumak. 3-6 ay için geçerli protokol Olgun Yetişkin yaş grubunda erkek veya kadın vahşi-türü (WT) veya angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) CD1 fare kullanın. 10daha önce açıklandığı gibi farelerin Genotipleme gerçekleştirin.
-
Kan toplama ve kardiyak perfüzyon
- Hayvanlar kalp perfüzyon 10 dk sonra anestezik Yönetim için hazır olun. Pençe seğirme yanıt yokluğu hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı emin olmak için kontrol edin.
- Hayvanlar onların sırt üstü yatıyordu ve % 80 etanol karın bölgesinde cilt üzerinde uygulayın. Küçük makas kullanırken, karın duvarı göğüs kafesinin hemen altında küçük bir insizyon attım (2 cm) ile açın. Karaciğer diyaframdan ayırın ve sonra yavaş yavaş plevral boşluğu 15açığa diyafram ile kesti.
- Bilateral göğüs kafesi kesme ve kesme göğüs kemiğinin sol ventrikül göstermek düzeltmek. Peristaltik perfüzyon sistemi için sol ventrikül arka içinde bağlı 21'lik kelebek iğne yerleştirin.
- Sağ atrium ponksiyon ve hızlı bir şekilde (içinde 10 s) 1 mL pipet İpuçları (ile son kesme) kullanarak göğüs boşluğu içine serbest kan 200-300 µL serum koleksiyonu tüplerde toplamak ve buza saklayın.
Not: Bu perfüzyon hayatta olmayan bir yöntemdir. - En kısa zamanda kan toplanır, perfüzyon sistemi (10-12 d/d, 5 mL/dk) geçin ve hayvan 3 dk sıcak (RT) 1 x PBS ile sıvı (Ca'nın ücretsiz2 + /Mg2 + iyonları).
Not: PBS içeren Ca2 +/Mg2 + iyonları perfüzyon sırasında daha iyi kalp etkinlik için yararlı olabilir. Toplam perfüzyon için kullanılan PBS 15-20 mL aralığında miktarıdır. - Perfüzyon kalite karaciğer, rengini işaret ederek değerlendirmek böbreğin perfüzyon sonra beyaz/soluk görünür.
Not: Böbrek veya karaciğer perfüzyon değil mutlaka bir belirtisi olarak arterler (karotis/vertebra) aort beyinden adım 3 hazırlık Atriyal ponksiyon sırasında özellikle sırasında yırtıldı ulaşan beyin perfüzyon.
2. doku işleme
- Organ toplama ve depolama
- Perfüzyon sonunda, servikal çıkması ve hasat beyin ve böbrekler hayvanın ölümü onaylayın. Beyin perfüzyon perfüzyon kalitesi iyi değil zaman hayvanlar geçirgenliği çözümleme dışı bırakmak böylece beyin (görünür kan damarlarının meninkslerde), renk tarafından doğrulayın. Beyin 2 hemibrains bir neşter (şekil 1) kullanarak ayırın.
- Bir neşter bir hemibrain ile olfaktör loblar ve beyincik ücretsiz teşrih ve hemicerebrum 2 mL tüp aktarın. Hemi-beyincik serebellar geçirgenliği değerlendirmesi için gerekli ek bir tüp içinde saklayabilirsiniz.
- Bir tek böbrek için başka bir 2-mL tüp aktarın. Örnekleri hemen kuru buza saklayın.
- Yerel olarak kalan böbrek ve hemi-beyin (beyincik ve olfaktör loblar oluşan) doku-tek en iyi kesim ısı (O.C.T) kuru buza bileşik katıştırın.
- Sonunda, 10, 000 g, 4 ° C'de 10 dakika buz serum koleksiyonu tüpler içinde depolanan kan örnekleri santrifüj kapasitesi Serum supernatants 1,5 mL tüpler için aktarmak ve onları kuru buz kapsayıcısına getirin.
- Kuru buzun-80 ° C dondurucu için daha fazla alay kadar toplanan tüm örneklerini aktarın.
Not: Çözülme donma gibi örnekleri homojenizasyon verimliliği artar sonra olarak homojenizasyon adımlara geçmeden önce dondurmak önemlidir.
- Homojenizasyon ve Santrifüjü
- Aşağı-80 ° C'de dondurulmuş hemi-cerebrum ve böbrek örnekleri buz çözme ve organları içeren tüpler tartın. Bu ağırlıklar doku kilo almak için birkaç boş tüpler (20) ortalama değerini çıkarın. 300 µL ve soğuk 1 200 µL eklemek X PBS böbrek ve hemi-cerebrum, sırasıyla içeren tüpler için.
Not: doku (100 mg altında hemi-beyincik gibi) daha düşük miktarlarda için bireysel tüpler ağırlığında tavsiye edilir. - Yaklaşık 15 vuruş gerçekleştirerek bir elektrik havai karıştırıcı (1, 000 rpm) için bağlı bir politetrafloroetilin (PTFE) havaneli ile orijinal eppendorf tüp her örnekte homojenize (1 vuruş = 1 ve 1 aşağı). PBS ile havaneli örnekleri arasında durulama ve sonraki örnek geçmeden önce kuru silin.
Not: Deterjanlar homojenizasyon sırasında kullanımı ile fluorometry olası girişim nedeniyle kaçınılması. Ancak, doku iyice bir yuvarlak donma sonra çözdürme daha verimli olduğu homojenize gibi hücre içi izleyici de bu protokol için algılandı. - Homojenize örnekleri ışık ve santrifüj 15.000 g, 20 dk, Masa üstü bir santrifüj 4 ° C'de sonunda hep birlikte korunuyorsunuz buz mağaza. Supernatants yeni bir 1,5 mL tüpler için hemen fluorometry ya da daha sonra çözümlenecek-80 ° C'de buzda aktarın.
- Aşağı-80 ° C'de dondurulmuş hemi-cerebrum ve böbrek örnekleri buz çözme ve organları içeren tüpler tartın. Bu ağırlıklar doku kilo almak için birkaç boş tüpler (20) ortalama değerini çıkarın. 300 µL ve soğuk 1 200 µL eklemek X PBS böbrek ve hemi-cerebrum, sırasıyla içeren tüpler için.
- Floresans ölçüm ve miktar
- Önceki adım sonunda donmuş, buzda-80 ˚C ışık folyo ile onları korumak, saklanan doku süpernatant ve serum örnekleri çözülme.
- Seyreltik serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) ya da (as) doku supernatants 50 µL 384-şey siyah bir tabak pipet. Bu doku homogenate arka plan normalde PBS eritici kullanılan daha yüksek olduğu gibi sahte hayvan uygun arka plan çıkarma, emin olmak serum ve doku supernatants için en az bir örnek içerir.
Not: sahte autofluorescence değerleri (veri gösterilmez) çok az bir değişkenlik gözlendi rağmen ortalama 3 sham hayvanların autofluorescence için kullanılabilir. PBS, ayrıca gürültü oranı sinyal örnekleri için beyin örnekleri gibi düşük floresan ile artırabilir ile sulandrarak kullanılan serum miktarı azaltılabilir. Upto 10 µL serum ile 40 µL PBS sulandrarak test edildi. Hava kabarcığı yok wells bulunduğundan emin olun. - 384-şey siyah plaka plaka okuyucuya yerleştirin ve floresan ölçüm seçerek yeni bir komut dosyası açın.
- Kazanç için en iyi ayarlayın ve 550/580 veya 490/520 uyarma/emisyon (nm) değerleri sırasıyla TMR veya FITC dyee için kullanın ve ham Floresans birimleri (RFUs) elde etmek için ölçüm başlatın.
- Ham Floresans birimleri (RFUs) plaka okuyucu geçirgenliği dizin (PI) karşılık gelen sahte değerlerini çıkarılarak sonra hesaplamak için kullanın.
- * Geçirgenliği dizin (mL/g) = (Doku RFUs/g doku ağırlık) / (Serum RFUs/mL serum)
- Örnek hesaplama beyin geçirgenliği dizin (PI) için hayvan GOF1 (Tablo 1):
- GOF1 beyin RFUs - SHAM beyin RFUs 154-22,5 = 131.5 =
- GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs 38305-27 = 38278 =
- Beyin ağırlığı (g) 0.195 =
- Serum hacmi (ml) 0,02 =
- Beyin geçirgenliği dizin (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) 0.352 =
Not: Mutlak ve deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir değerler geçirgenliği dizin hesaplamalar verim. Bunlar ancak 2 grup 12arasında karşılaştırma kolaylığı için oranları olarak sunulabilir. Bu her iki grupta her hayvan PI 1 henüz kontrol grubunda Inter hayvan varyasyon tutmak ile kontrol grubu ortalama sürüş kontrol grubunun ortalama PI ile bölerek elde edilebilir. Bu dönüşüm kontrol grubu 1'e ayarlayın göre deney grubu (veya grup) için değerler sağlar.
- Ayirt görsel izleyici olarak
- Yerli bir cryostat ilgili bölümlerde-20 ° C ayarla ve oda sıcaklığında yerleştirilen slaytlara bölümleri transfer 10 µm içine doku-tek bileşik (O.C.T) (Adım 2.1) gömülü böbrek/hemi-beyin blok kesme. Bir kez bölümleri (yaklaşık 30 dk) kurutulur, slaytlar kadar kullanmak-80 ° C buzluğa aktarın.
- Gününde, boyama slaytlar için 10 dk. 37 ° C'de erimek ve bölümleri için PBS hızlı yıkama ardından oda sıcaklığında 10 dk %4 paraformaladehyde (PFA) ile düzeltin.
- Permeabilization/engelleme arabellek % 1 BSA ve oda sıcaklığında 1 h için % 0,5 Triton X-100 pH 7.5 içeren steril PBS yapılmış bölümlerde kuluçkaya.
- Slaytlar, oda sıcaklığında CD31 birincil antikor ile 1,5 saat için kuluçkaya (0,5 mg/ml, MEC 13,3 klonu), 1: 100 steril PBS, % 0.5 BSA, %0.25 içeren arabellekte PBS üç 5 dk yıkar ardından Triton X-100 (pH 7.2) seyreltilmiş.
- İkincil antikor kuluçka species-specific ile oda sıcaklığında 1 h için yukarıdaki arabellek fluorescently antikorlar seyreltilmiş 1:500 (2 mg/mL) etiketli gerçekleştirin. CD31 için keçi Anti-sıçan Alexa 568 veya Alexa 488 1:500 bir seyreltme kullanılabilir. DAPI içerir (300 µM) ikincil antikor (1:1, 000 seyreltme stoktan) çekirdeği için leke karıştırın.
- Aqua polymount lekeli bölümlerle dağ ve gece karanlıkta oda sıcaklığında polimerizasyon için bırakın.
- Spektral görüntüleme confocal lazer mikroskop sistem tarama kullanarak görüntüleri elde etmek. Görüntüleri NIS elements yazılımı (version 4.3) tarafından analiz. Yazılım Photoshop gibi montaj şekiller oluşturmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz son zamanlarda angiopoietin-2 (Ang-2) fonksiyonu kazanç (GOF) fareler daha yüksek beyin damar geçirgenliği kontrol fareler daha sağlıklı koşullar10' olduğunu ortaya koymuştur. Felç indüklenen farelerde Ayrıca GOF fareler daha büyük enfarktüsü boyutları ve daha büyük geçirgenliği kontrol littermates daha vardı gösterir oldu. Bu sonuçlar geçirgenliği BBB, Ang-2 kritik bir rol gösterir. Protokol bu nedenle GOF fareler kullanılmaktadır ve onları littermates vivo içinde geçirgenliği tahlil açıklamak için denetlemek için karşılaştırıldığında. Ancak, bu yöntem herhangi bir hastalık model, transgenik fare modeli uygulanan veya 10,11,12,13daha önce yaptığımız gibi BBB geçirgenliği alter tedaviler ilaç.
Uzun dolaşım süreleri için daha büyük bir boşluk da önceki çalışmalar16içinde gözlenen damar yuvası üzerinden yol açacak gibi geçirgenliği analiz için kısa sirkülasyon vakit (15 dk) tavsiye edilir. 3 Gümrükleme kD FITC-dextran 2 h (Şekil 2 ), C, D) 15 dk ()Şekil 2 çok daha büyüktür A, B) böbrek de olduğu gibi beyin dokusu içinde. Beyinde, olduğu gibi kan - beyin bariyerini yetişkin bu WT farelerde (Şekil B, D) nedeniyle çok az extravascular izleyici var. Bu yöntemi uygulayarak, Ang-2 GOF içinde izleyici geçirgenliği WT littermates ile karşılaştırıldı. Sonuçları tablo biçiminde (Tablo 1) sunulan yüksek izleyici birikimi kafasından WT fareler için karşılaştırıldığında GOF Fareler gösteriyor. Ancak, bu gruplar arasında böbrek Floresans değiştirilmez. Ayirt görüntüleri onaylamak GOF farelerde ()şekil 3 extravascular izleyici artış B, D) ()şekil 3 WT fareler için karşılaştırıldığında A, C) İzleyici nerede damar yuvası için sınırlı.
Şekil 1. Floresan tarayıcıları kullanarak vivo içinde geçirgenliği tahlil için iş akışı şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kısa ve uzun dolaşım kez izleme izni. Geçirgenliği tahlil, 15 dk bir kısa sirkülasyon zaman izleyici dolaşım süre oluşturulabilmesi için (A, B) 2 h (C, D) sonrası izleme enjeksiyon uzun dolaşım zamanı ile karşılaştırıldı. Dolaşım uzun 2 h böbrek Bazal geçirgenliği yüksek olduğu (C) izleyici birikimi çok düşük miktarlarda FITC dextran-3 kD (yeşil çok yüksek bir boşluk nedeniyle olası bir kısa 15 dk dolaşım zaman (A) göre yol açtı «««Kanal) damar yuvası. Bu etkiyi daha da sıkı kan - beyin bariyerini tarafından (B, D)ile karakterize beyin dramatikti. CD31 (kırmızı kanalı) Boyama damarları ilgi bölgedeki varlığını doğruladı. Her zaman nokta ve hayvanlar için izleyici ile enjekte 2 vahşi-yetişkin CD1 farelerde tip dışında tek bir hayvan temsilcisi görüntüleri onları intravasküler izleyici görselleştirmek için Ventriküler olmadan kurban edildi. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. GOF farelerde beyin geçirgenlik değişiklikler değerlendirmek izleyiciler için boyama ayirt. Artmış geçirgenliği 3 kD TMR-dextran izleyici (kırmızılı) Ang-2 GOF farelerde WT littermates (A, C) korteks bölgesinde göre (B, D) görüntülenir. WT hayvanlarda extravascular izleyici ( B, D beyaz ok) GOF farelerde gözlenen ise izli gemiler (A, C) sınırlıdır. CD31 (Mavili) için birleştirilmiş Albümdeki boyama (A-D) damarları varlığını doğruluyor. Şekil 2 temsilcisi görüntüleri WT ve 2 GOF fareler izleyiciler IP ile enjekte ve 15 dk sonrası enjeksiyon ile perfüzyon feda gösterir. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hayvan kimlik | Beyin ağırlığı (g) | Böbrek ağırlığı (g) | Serum hacmi (mL) | Serum RFU | Böbrek RFU | Beyin RFU | Seçeneklere Dizin (10 ^-3 ml/g) | |
| Böbrek | Beyin | |||||||
| GOF 1 | 0.195 | 0,252 | 0,02 | 38305 | 31051 | 154 | 64.4 | 0.352 |
| GOF 2 | 0.177 | 0.249 | 0,02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0.278 |
| WT 1 | 0.167 | 0.301 | 0,02 | 40904 | 31591 | 64 | 51.2 | 0.122 |
| WT 2 | 0.146 | 0.294 | 0,02 | 39502 | 31768 | 70 | 54,8 | 0.164 |
| SHAM | 0.155 | 0,27 | 0,02 | 27 | 36 | 22,5 | NA | NA |
Tablo 1. Doku geçirgenliği hesaplamalar. Hesaplamalar Ang-2 kazanç--fonksiyonu (GOF) ve vahşi-türü littermates (WT) fareler için açıkça (yaklaşık 2 kat) daha fazla göstermek geçirgenliği dizin geçirgenliği WT fareler için karşılaştırıldığında GOF farelerde beyin. Böbrek geçirgenliği ise 2 grup arasında aynı aralıkta. Bazal böbrek geçirgenliği çok daha büyüktür beyin için sıkı bir engel oluşturmaz böbrek Poşlu endotel nedeniyle beklendiği gibi göre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kan - beyin bariyerini disfonksiyon birincil ve ikincil Beyin Tümörleri veya felç gibi nörolojik bozukluklar, bir dizi ile ilişkilidir. BBB arıza kez hayati CNS ödem ile ilişkilidir. Bu nedenle açılış tetik moleküler mekanizmaları aydınlatma veya BBB kapatılması tedavi önemini nörolojik bozukluklar ve yaygın araştırmacılar tarafından araştırıldı. Ancak, yöntemleri araştırmak için BBB geçirgenliği vivo literatürde bildirilen Floresans görüntüleri17,18 sıkıcı ve öznel miktar üzerinde bağlıdır teknik sorunlar ile ilişkili çoğu kez , 19. Ayrıca, daha sıkı bir engel oluşturmaz yüzeysel beyin damarlarının geçirgenliği göstergesi bu safsata bütün beyin Floresans görüntüleme yöntemleri bazıları şunlardır. Hatta ne zaman miktar gerçekleştirilen hayvanlar önemli kan kesir nedeniyle hatalı yorumu önde gelen periosteum çoğu zaman objektif beyin doku Absorbans (örneğin evans mavi geçirgenliği değerlendirme) temel. Beyin ağırlık geçirgenliği hesaplamalara dahil çoğu zaman ama vasküler geçirgenliği kaynaklanan ödem ağırlığı artırmak ve net geçirgenliği alter olması gerekir başka bir değişkendir. Ayrıca, seks ve hayvan hayvan beyin ağırlık varyasyonları geçirgenliği farklılıklar bulut. 14C sukroz ve [3 H] inulin gibi radyoaktif izleyicileri beyin geçirgenliği dizin için başarıyla uygulanmış olan ama değil çok çeşitli boyut ve ücret olarak geçirgenliği soruşturmaya fluorescently etiketli izleyiciler20dayalı teklif yapmak.
Yukarıdaki nedenlerden dolayı basit, objektif ve kan - beyin bariyerini geçirgenliği vivo farelerde fluorescently etiketli tarayıcıları kullanarak tahmin içinde nicel bir yöntem edindik. Dextrans onların orta yüksek molekül ağırlıklı (3-200 kD) tarafından karakterize hidrofilik polisakkaritler vardır ve şarj edilmiş veya doldurulmamış molekül konjuge fluorophore dayalı olarak elde edilebilir. Endotelyal sıkı kavşak esas olarak claudins tarafından (1, 3, 5 ve 12) kurdu ve occludin, birlikte paracellular boyutunu belirlemek ve seçicilik gözenek artıkları (21' gözden) onların ilk hücre dışı döngü üzerinde present tarafından şarj şarj. Geçirgenliği kan - beyin bariyerini vivo içinde genelinde aynı zamanda glycocalyx ve Bazal lamina BBB22,23her iki tarafında bulunan iki yapı üzerine bağlıdır. Luminally mevcut glycocalyx bir jel kan yoluyla oluştururlar albümin için bir engel olarak da davranır olumsuz ücret oligosakkaritler (heparin sülfatlar) tarafından kurulan yapısı gibi olan. Biz vahşi türü fareler10' a göre işlev farelerin angiopoietin-2 kazanç içinde gözlenen gibi glycocalyx kalınlığı veya kompozisyon değişiklikleri de vasküler permeabilite değişiklikleri ile ilişkili vardır. Membran Öte yandan her iki damar endotel hücreleri ve perisitlerden tarafından parenkima membran veya astrositik membran yapılmış ise yapılan membran oluşan endotel hücreleri abluminal tarafında mevcuttur astrocytes tarafından. Bu Bodrum membranlar da olumsuz uygulanır ve böylece aynı zamanda şarj engelleri hizmet için kapasitesine sahip. Bu bağlamda, konjuge dextrans soruşturma boyutu ve ücret tabanlı geçirgenliği sunuyoruz. Örneğin, TXR-dextran 3 kD bu tarayıcıları birini konjuge yüksek birleştiren nötr, oysa TMR-dextran 3 kD Anyonik, molekül ağırlığı dextran FITC dextran 70 gibi kD aynı karışımı enjekte fareler için bir boyut tabanlı geçirgenliği değerlendirmek. Biz daha da floresan etiketli dextrans geçirgenliği standart ayirt boyama içinde bölgesel farklılıkları keşfetmek için lisin tamir edilebilir doğası avantajlarından yararlanın. Dextrans da genellikle düşük immünojenisite sergi ve böylece iyi izleyiciler hizmet vermektedir. Lucifer sarı, cadaverine, floresein-5-thiosemicarbazide (FTSC), düşük moleküler ağırlıklı aralığında olan diğer izleyiciler arasında yer (0.4-0.8 kD) ve düzeltilebilir.
Bizim yöntemde, izleyiciler tarafından fareler Ventriküler tarafından takip IP yolu enjekte edildi ve beyin homogenates floresan elde ıslak ağırlık ve serum floresan için normalleştirilmiş. Bölümler/görüntülerin miktar klasik kullanılır immunofluorecence yöntemi tarafından olduğu gibi hiçbir seçim olduğu basit ama son derece nicel ve objektif bir yöntem bu. Biz sadece bir hemi-beyin geçirgenliği tahlil için kullanmak ve diğer hemibrain ayirt sagittal bölümler aynı hayvan bölgesel farklılıkları sağlayan analiz ederek boyama için kullanır. Her hemi-beyin kullanımı farklı eşzamanlı ölçümler için bizim protokolündeki ana avantajlarından biridir. Ayrıca, böbrekler, karaciğer, vb gibi diğer organlarda geçirgenliği Bazal geçirgenliği yüksek bu organlarda olduğu gibi iyi bir iç denetim olarak hizmet vermektedir. 2 Grup karşılaştırmak için bir ilk (yani izleyici enjeksiyon almadı) sham hayvan çıkarma yapılması gerekir autofluorescence hem gruplar tüm hayvanlarda ve tüm doku türleri (böbrek, beyin ve serum) her izleyici için ve daha sonra için normalleştirilmiş geçin 2 grup karşılaştırma hesaplamaları. Geçirgenliği dizin (PI) doku doku ağırlık ve serum cilt için normalleştirilmiş serum floresan için bir oranı olarak elde edilen sunulur. Bizim hesaplamalar deneyler ve doku türleri arasında karşılaştırılabilir izleyici geçirgenliği için bir mutlak değer verim. Bu değerler ancak, kolayca oranları veya12de daha önce yaptığımız gibi karşılaştırılan 2 grup arasında yüzde olarak ifade edilebilir. Bu her iki grupta her hayvan PI tüm hayvanların kontrol grubunda ortalama PI ile bölerek elde edilebilir. Hata ve hayvanlar arasında deney grubu için tutmak vermek henüz 1 kontrol grup ortalaması göreli değerler bu denetim grup PI ile 1 sürücü.
IP tarafından izleyiciler enjeksiyon daha kolay, ama daha fazla maliyet yoğun olarak izleyici miktarı artmış gerekiyor i.v enjeksiyon için karşılaştırıldığında. (Gösterilmez) veriler bu konuda izleyici bu neredeyse 2 kat daha yüksek miktar gösteriyor IP enjeksiyonla i.v için karşılaştırıldığında benzer serum Floresans değerler elde etmek için gereklidir. Ayrıca, dolaşım IP rotasındaki i.v kan akışı içine izleyici emilimi için geçen süre nedeniyle kıyasla daha yüksek zamanı. Bu bağlamda, serum Floresans değerlerinde 15 dk sonrası IP enjeksiyon 5 dk sonrası i.v enjeksiyon 0,4-4 arasında düşük ve orta molekül ağırlığı aralıktaki izleyiciler için karşılaştırılabilir kD (veri gösterilmez). Kısa sirkülasyon vakit paracellular geçirgenliği doğrusal ve önemli doku Floresans algılanan yazı perfüzyon kısa sirkülasyon süre (15 dk) sonra ise, ihbar gibi o zaten geçirgenliği fenotip gösterir çünkü öneririz bizim önceki yayınları10,12,13,14. Ama aynı zamanda bir serum Floresans normalleştirme için elde edilemedi. Uzun dolaşım zamanlarda doku izni olan serum Floresans önemli ölçüde azaltır ve böylece serum için normalleştirilmiş geçirgenlik değerleri etkileyebilir, orandadır. İzleyici boyutu/şarj ile ilgili olarak dolaşımını zaman her senaryo için en iyi duruma getirilmiş olsa da, başlangıç noktası olarak bir kısa sirkülasyon zaman öneririz. Plazma gibi yüksek molekül ağırlıklı solutes için de geçerlidir geçirgenlik özelliklerini çoğu etkisiz dextran izleyiciler son derece büyük boy ve Fc gibi hücresel reseptörleri ile belirli etkileşim nedeniyle aksine IgGs ve fibrinojen (150-400 kD) onların yarı ömrü24değiştirmek reseptörleri. Dextrans Öte yandan endotel düzeyi25 herhangi bir özel taşıma sistemi var mı ve beyin endotel hücreleri çok pinocytosis nedeniyle önemli seviyelere tabi olmayan plasmalemma vezikül seviyesinin düşük protein (PLVAP)26 ilişkili , paracellular dextrans ulaşım ana yoldur. Öyle aynı derecede geçirgenliği transgenik farelerde vahşi tipi littermates karşılaştırıldığında ve ayrıca geçirgenlik değişiklikler vahşi türü farelerde tedavi müdahale10sonra, değerlendirildi belgili tanımlık yukarıda yöntem çeşitli senaryolarda başarıyla uygulamış olan 12 , 13 , 14. Özetle, ayirt boyama ile birlikte, burada açıklanan geçirgenliği tahlil basit ve diğer küçük hayvanlar için de uygulanabilir fareler içinde vivo geçirgenliği değerlendirmek için güçlü bir yöntem olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar bu eser desteklemek için Leduq Vakfı tarafından finanse edilen Sphingonet Konsorsiyumu kabul etmek istiyorum. Bu eser de "vasküler farklılaşma ve modelleme" ortak araştırma merkezi tarafından desteklenmiştir (CRC / Transregio23, proje C1) ve 7. FP, COFUND, Goethe uluslararası doktora sonrası programı GO-inç, No 291776 finansman. Daha fazla Kathleen Sommer fareler ile onun teknik yardım için işleme ve Genotipleme anıyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
- Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
- Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
- Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
- Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
- Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
- Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
- Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
- Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
- Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
- Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
- Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
- Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).
