Summary
全身麻酔を使用してプロシージャの間にマウスの福利を評価するためのプロトコルを開発しました。グルココルチコイド代謝物を分析しただけでなく幸福のレベルを示す行動パラメーターのシリーズ。プロトコルは、動物を中心とした科学的な厳しさの度合いを推定する一般的な援助として使用できます。
Abstract
ラッセルとトリーバーチの原則 (交換、削減、洗練された) が開発した 3 r、合わせて科学的な研究は、可能な限り動物実験に代わる方法を使用してください。動物実験に代わるものがない、実験動物使用数の合計は貴重なデータを取得するための必要最小限にする必要があります。さらに、痛み、苦しみ、そして実験手順に伴う苦痛を最小限にする適切な洗練の手段が適用されるべき。痛み、苦しみ、そして苦痛の程度を分類に使用されるカテゴリは、非回復、軽度、中程度、または重度 (EU 指令 2010年/63) です。カテゴリは、個々 のケースで適用するには、それは科学的に正しいツールを使用する重要です。
ここで示したよくあ評価プロトコル中に全身麻酔を使用するプロシージャです。プロトコルは穴を掘るなど幸福の指標としての動作の造巣ホーム ケージ活動、マウスのしかめっつらスケールと豪華な行動に焦点を当てください。また、特性不安関連行動の自由探索的パラダイムを使用します。24 時間麻酔後に急性ストレスの指標として糞便中コルチコステロン代謝物を測定します。
プロトコルはマウスの全身麻酔の幸福の科学的に確かな情報を提供します。その簡単のためプロトコル簡単に適応でき計画研究の統合します。それが EU 指令 2010年/63 のカテゴリーにおける苦悩を分類するスケールを提供していない研究者が科学的データを用いた手法の厳しさの度合いを見積もることができます。それは、動物を中心とした科学的方法で幸福の評価を改善する方法を提供します。
Introduction
EU ディレクティブ 2010年/631は、ラッセルとバーチ2によって開発された 3 r 原則 (交換、削減、改良) は動物実験が必要な場合に適用することを定めています。EU 指令の究極の目標はすべての動物テストを段階的に、ディレクティブ、当分の間、いくつかの動物実験がまだ必要な人間と動物の健康を守る研究を行うことを認めています。したがって、動物実験は、任意の別の方法で置き換えることはできません、実験動物の最小数のみは、信頼性の高い結果を得られます。さらに、痛み、苦しみ、そして実験プロシージャを伴う苦痛の量は適切な洗練の手段を使用して最小化する必要があります。EU ディレクティブ 2010年/63 は、手順の重大度は、非回復、軽度、中程度、または重度の1として前向き分類される必要が定めています。重症度分類は、ケースバイ ケースに基づいて決定は、特定の手順の重大度を推定するための科学的ツールを持つことが重要です。
モートンとグリフィス3提案としてスコア シートは、幸福4に対するマイナスの効果を含む正常な状態からの任意の偏差を検出するに必要不可欠なツールです。スコアシートが遡及的痛み、苦しみを決定する使用され、実験によって引き起こされると (例えば体重、毛皮、歩行)、個々 の動物の物理的な状態で目に見える変化に焦点を当てる。附属書 VIII の EU 指令 2010年/63 は、それぞれに重要度カテゴリの例を示します、データに基づく科学的を使用して指定されたプロシージャの厳しさの度合いを推定する研究者まだ欠如ツール。
否定的な幸福を示す指標の不在は、動物の状態を判断する唯一の方法ではないです。肯定的な幸福を指す指標の存在はまた重要な5,6,7,8です。たとえば、動物は穴を掘るのような豪華な行動を表示や入れ子建物動作に不可欠なニーズが満たされたときのみ。幸福を縮小した場合高級動作5,7を拒否する最初のです。幸福の評価で使用されるプロトコルは、詳細かつ包括的な9の彼らの幸福感を評価するために物理的な生理学的/生化学的、および動物の心理状態を指すインジケーターを含める必要があります。
洗練されたコンテキスト内でプロトコルはこれらの要件を満たすために、マウス10の福利に全身麻酔を含む手順の効果を評価するために開発されました。同時に目標は、与えられた実験にプロトコルの簡単な統合を有効にする追加のストレスを最小限に抑えることでした。プロトコルは、行動、活動、食物摂取、入れ子などホーム ケージ動作と特性不安関連行動を掘り進むと見なします。さらに、糞マウス顔をしかめるスケール (MGS) とコルチコステロン代謝物質の非侵襲的な分析を含みます。プロトコルは、科学的かつ動物中心に幸福の評価を容易にして厳しさの度合いの分類をサポートする福利に関する情報を提供するために設計されています。スコア シートの他のプロシージャの重症度分類に有用な情報を提供できます。プロトコルを実行する簡単です広範な装置を必要としない、研究の結果に影響を与えることがなく継続的な実験に統合できます。注意すべきこと動物の研究: レポートので生体実験 (到着) ガイドライン11は、動物実験、改善設計、分析、およびレポートの目的を含むすべての調査で観察されます。
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Protocol
研究ドイツ動物福祉法が定めたガイドラインに従って行われ、ベルリン州当局によって承認された ("Landesamt こだわり健康を祝して und Soziales"、許可証番号: G0053/15)。
注: このプロトコルの主な目的は、グルココルチコイド代謝産物の繰り返しなされる麻酔の効果を調べるためだった。使用される動物の数を決定するためのサンプル サイズの計算を行った: n ≥ 2 (s/μ1- μ2) ×2 (zα +βz) ×2。μ1- μ2が作られていますサイズ計算力およびサンプルの作成手段の間の違い (α = 5%、β = 80%); zα = 1.96 と zβ = 0.84 が標準正規分布の分位数。図 1は、このプロトコルのタイム ラインを示します。プロトコルのパラメーターは、コントロールのレベルとの違いを示しています、動物を密接に監視する必要があり、パラメーターは適当な期間の後に再度測定する必要があります。たとえば、特性不安関連行動が増加する場合この動作テスト必要がありますもう一度一週間後、完全復旧までの期間を確認するため。タイム ポイント、このプロトコルでは定義されている期間は、他のプロシージャで使用するために合わせることができます。時間ポイントを変更すると、馴化期間はプロトコルで説明されているように保つ必要があります。マウスの動作に影響を与えるかもしれない要因を減らすためには、マウスの通常の動作を妨げてはテストの後より多くの操作が必要なテストを実施しなければなりません。図 2は、スコアリングのサマリー シートを用いたプロトコルのすべてのテストをまとめたものです。図 3は、テスト結果を解釈する方法の概要を与える幸福のグレードの簡略化されたスケールを提供します。
1. マウスを実験者による処理に娯楽 habituating
- 別の施設または仕入先から取得されて、少なくとも 2 週間の動物施設に慣らすためにネズミを許可します。
- グループのマウスの家および 12:12 h の光: 暗いサイクル (室温 22 ± 2 ° C; 相対湿度 55 ± 10%) の標準的な条件の下でそれらを維持します。
- 標準濃縮としてトンネルと綿の nestlets をすべてのグループに提供食品や水の自由。
- トンネルやカップ、少なくとも12のテスト前一週間を処理するすべてのマウスを慣らします。
ストレスや不安、幸福に影響を与えるとも、このプロトコルの12の結果に大きな影響は、注: を引き起こすことができる尾によってマウスを拾います。
2. 行動の実験室と装置の準備
注: は、テストでは、理想的には動物が飼われている部屋の近くの別の部屋を提供します。手順を実施する前に、テストの部屋、少なくとも 60 分ホーム檻の中でマウスを転送します。可能であれば、このプロトコル手順の実施、同じ実験室でのすべてのテストを実施します。
- 穴を掘る動作8をテストし、MGS13 (図 4) で使用するため写真を撮影する観測ケージを準備します。
- 約 220 mm × 290 mm の面積と高さ 390 mm のガラスの箱を使用します。
- このボックスの寝具材料の約 0.5 cm の床をカバーします。
- 新しい環境によって引き起こされる苦痛を減らすために新しい寝具材料の上にホームのケージから使用される寝具材料の一握りを散布図します。
- 食品、食事と水供給は通常同じ種類を提供します。
注意: もし可能であれば、マウスは寝具の材料と水鉢を埋めることができるので水のボトルを使用します。
- ケージを準備 (タイプ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) をマウスを個別に収容されて 24 時間観察期間 (図 5)。
注: 個々 の住宅の期間を最小限にするため、この期間中に動作、ホーム ケージ活動、食物摂取量と糞便コルチコステロン代謝産物 (FCM) の造巣のデータを収集します。- 苦痛を減らすためにケージ (約 0.5 cm 深) と散布使用寝具素材新素材の上にホームのケージから糞便がなく一握りの材料を新しい寝具の場所。
- 環境エンリッチメント (材料の表を参照) だけ14として定義された重量の標準化された正方形の綿の nestlet を提供します。
注: 商業 nestlets は重量で異なる場合があります。したがって、我々 は執事によって記述されている nestlet の重量を変更し、代わりに 2.7 g142.0 g を使用します。 - 赤外線センサーを使用してホーム ケージ活性を測定するとき、ケージの上部に赤外線センサーをマウント (材料の表を参照)。
- 食べ物、食事、通常付属している同じ種類を提供して広告自由の水します。
3. マウスのしかめっつらスケール
注: 写真の 3 つの時点で観察ケージで、MGS の撮影です: (i) 2 日前処置後 (iii) 150 分、手順の後 (ii) 30 分 MGS のレコードのベースライン レベル プロシージャ。幸福は損なわれる、MGS のスコアが増加します。増加の MGS のスコアは 150 分後まだ観察される、後の段階で追加の写真を取る。
- 写真の高解像度カメラを使用します。
- そっと観察ケージにマウスを転送し、少なくとも 30 分間、新しい環境に慣らすために、マウスを許可します。
- 約を継続的に取るたびに、30-40 写真ポイント 1-2 分以内。
- すべての写真を並べ替えるには、正面または側面写真の鮮明さを選択してぼやけた写真や正面または側面ビューよりも他の視点からマウスの顔を見る写真を破棄します。
- 各時間のポイント、(つまり2 日前の手順、手順の後の 30 分と手順の後 150 分) 各マウスから一枚の写真がランダムに選択します。
- 体の位置は、表示されている13ではないマウスの頭だけを表示する写真をトリミングします。
- それぞれの写真に 1 枚のスプレッドシート ファイルを作成し、各シートに MGS の 5 顔アクション ユニットを含むテーブルを追加します。
注: ファイルには、写真投稿手順と同様に、ベースラインの写真が含まれています。 - シートの順序をランダム化します。
- ラングフォードらによって開発された MGS を使用し、3 ポイント スケールを使用して顔のアクション ユニットをスコアそれらを以前受けた 3 つの独立した人にコンピューター画面上のファイルを提示 (0 = 存在しない、1 = 中程度の提示、2 明らかに =現在)。
注: 得点パラメーター13次に基づいて: 軌道引き締め (「しっかりと閉瞼や目スクイズの眼窩領域の狭小化」);鼻のふくらみ (「丸みを帯びた鼻の橋の上に見える皮膚の延長」);頬の膨らみ ("凸"の外観頬筋);耳の位置 (「耳か、垂直方向の尾根に戻って描画されている耳のヒントのおかげでそのフォームを特徴と離れて引っ張られ、彼らのベースラインの位置から戻って」);ウィスカ変更 ("のベースラインからのひげの動き位置いずれかの後方、顔またはフォワードに対して最後に立っているかのようひげがまた一緒に群生」)。 - 通り (ラングフォードらから適応のスコアを分析します。13)。
- MGS スコアを生成するそれぞれの写真にすべての表情のユニットを平均します。
注: 顔アクション ユニットの一つも、得点がない場合は平均残りの顔アクション ユニットです。 - ベースライン写真各マウスの MGS 違いスコアを取得する写真ポスト プロシージャの平均からの平均値を減算します。
- 人 (関連ある標本のノンパラ メトリック検定) の MGS 違いスコアの違いをテストします。
注: 場合有意差 (p < 0.05)、スコアすべての写真やいくつかの写真のスコアだけが、人の間違いかどうかを決定します。後者が true の場合は、これらの写真の得点を繰り返します。それ以外の場合、人は MGS トレーニングを繰り返して、写真を再びスコアします。 - 平均、MGS 差異スコア各マウスの別の得点から得られる場合は、すべての人の結果が大幅に違いはありません。
- ノンパラ メトリック検定を使用すると、研究グループ間の平均 MGS 違いスコアを比較します。
- MGS スコアを生成するそれぞれの写真にすべての表情のユニットを平均します。
4. 穴を掘る行動8,,1516
- 巣穴を準備するには、通常標準的な不透明なプラスチック水ボトル (250 mL、150 mm の長さ、直径 55 mm、ボトルの首の直径 45 mm)8食として供給される 140 ± 2 g の餌ペレットを配置します。
注: マウスを好むワイド チューブ、68 の mm の直径の穴使用できます執事16のとおり。 - 巣の場所は順化の手続きの前に 5 日間ホーム ケージに餌ペレットでいっぱい。
注: 檻の中正規食品調剤ユニットは削除されませんする必要があります、マウスが使用されている食品ペレットでいっぱいにする必要がありますもこれに。 - 2 回手続き (ベースライン) の前に 2 日間のテストを行う最後の 30 分の投稿手順を実行します。
- 少なくとも 30 分、MGS の写真が撮影された観測ケージに慣らすマウスをしましょう。
- プラスチック製の水のボトルの場所は食品ペレット観測ケージの後ろの壁に平行に満ちています。
- 2 h 後に穴に残って食品ペレット (g) の重量を量る。
- 初期重量 (%) を基準にしてマウスで穴から削除食品ペレットの重量を計算します。
5. 24 時間観察期間
注: マウス、2.2 で説明されているように、個別に収容されます。(図 5)、24 h にわたり、食品を測定するために摂取量、ホーム ケージ活動巣作り行動と FCM レベル。24 時間観測が行われる二度: (ii) プロシージャの日に基準レベルは前の手順 (i) 2 日。
-
食品の摂取量
- 体重 (スコア シートの部分) の任意の変化を評価するために定期的 (例えば麻酔、麻酔、麻酔後 2 日と毎週麻酔後の直前に前に、2 日) でマウスの重量を量る。
注: 体重は、体重の 1 グラムあたりの食品摂取量の計算に必要です。水の摂取量は、24 時間観測期間中も測定できます。食品の摂取量が減少し、幸福感が損なわれます。 - ケージ (約 100 g) の食品単位で提供する標準的な食品食事療法 (グラム) の初期の重量を決定します。
- 24 時間観察期間の終わりに標準的な食品ダイエットの重量を決定します。
- 食品流出の慎重に食品の単位の下にケージ側をスキャンし、任意の余分な食品ペレット食品ユニットの残りの餌ペレットの重量が判明を追加します。
- 単位体重当たりの食品の摂取量を計算します。
- 体重 (スコア シートの部分) の任意の変化を評価するために定期的 (例えば麻酔、麻酔、麻酔後 2 日と毎週麻酔後の直前に前に、2 日) でマウスの重量を量る。
-
ホーム ケージ活動
注: 次の手順は、赤外線センサーの使用を参照してください (資料の表を参照)、ホーム ケージ活動が別のプログラムも行われるが。ホーム ケージ活動制御レベル (例えば自発運動の抑制、多動性) からの偏差障害者幸福の印であるかもしれない。- プログラムを起動します。
- 1 分のサンプル間隔と衝動が 24 時間 1 分ごとを記録されることを意味、24 h の捕捉時間を選択します。
注: 実験者が何度か部屋に入る記録を開始した後場合、のみ使用、マウスが邪魔なかったときの期間からのデータ (すなわち暗期)。 - インパルスの 10 分間隔をまとめます。
- (インパルス × 分) 時間曲線下の領域を計算します。
-
巣作り行動
注: 複雑・高の巣は幸福を示すインジケーターとして使用できます。- 正方形の綿 nestlet を配置 (材料の表を参照してください) 檻の真ん中に定義された重量 (例えば2.0 g)。
- 次の朝、約 2 時間点灯後執事14によると 5 点満点 (下記参照) に巣をスコアします。初期 nestlet 重量の少なくとも 5% を任意の untorn の nestlet の部分の重量を量る。スコア通り14巣
- 90% そのままの nestlet の場合は「1」スコアを割り当てます。
- 50-90% そのままの場合は、「2」スコアを割り当てます。
- 割り当てるスコア「3」の場合は、nestlet の 50-90% は千切り。
- 割り当てる 90% 以上は千切り、巣はフラット、その円周の 50% 未満が丸くマウス本体高さより高い場合に「4」を獲得します。
- 割り当てるより 90 %nestlet は千切り、巣が高いとその円周の 50% 以上が背を丸めてマウスの平均身長よりも高い場合、「5」をスコアします。
-
糞便中コルチコステロン代謝物
注: コントロール レベル以上 FCM の増加 24 時間麻酔後に急性ストレスのレベルに合わせてください。- 24 時間観察期間の終わりに鉗子を使用してケージからすべて乾燥糞便ペレットを収集し、尿で汚染されたぬれたペレットを排除します。
- パルメらによると FCM を抽出します。17、次のようにします。
- 60-70 ° C の温度で乾燥糞便
- モルタルを使用して糞便をホモジナイズしてください。
- 複数の渦に 30 分間遠心管中の 80% メタノール 1 mL に 0.05 g の因数を振る。
- 15 分間 2500 x g でサンプルを遠心します。
- 別の遠心チューブに上清の 0.5 mL のピペットします。
- -18 ° C 最低糞便 (物) を保存します。
- 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one 酵素免疫測定法 (EIA)18,19または別の完全に検証された EIA を使用して FCM を分析します。
- FCM ベースライン FCM 濃度に対する濃度値の変化率を計算します。
6. 無料探索的パラダイム
- ラックからホームのケージを取る、24 時間観測期間の終わりにテーブルの表面に置きます。
- ケージの長い側に 45 ° の角度でケージに (食糧または水のボトル) なしグリッド ケージ上部を配置します。
注: マウスの隠れ場所として、巣を破壊しないが、巣の上ケージ上部を斜めに配置。 - モニターまたはビデオ記録約 1.5 m の距離から 10 分間マウス。
- タイマーを開始します。
- すべて時マウス (ケージの上のすべての 4 つの足) のケージの上に登って (ケージの床に足を 1 つまたは複数) とケージ上部の葉に注意してください。
注: いくつかのマウスがケージの上に登って、ケージの端に沿って歩くためにそれを残します。いくつかのマウスをケージの上にリアできます。マウスがまだ上のケージなら、これらの場合を扱います。
- バートらの後にパラメーターを評価します。20。
- 待機時間 (単位は秒) の最初の調査を分析します。
- 探検の数を分析します。
- 探査の合計時間 (秒) を分析します。
注: 最初の調査、探査、数が少ないと探査の低総期間に待ち時間特性不安の高いレベルを示すことができます。
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Representative Results
このプロトコルはもともと C57BL/6JRj マウスのイソフルラン麻酔の経験を 1 つの幸福を評価するために開発された (45 分麻酔セッションは 1 つ、n = 13 女性) または繰り返しのイソフルラン麻酔 (6 麻酔 45 分のセッション 3-4 日で麻酔セッション、n 間 = 13 女性) マウスの幸福と比較して (n = 女性 6 名)10麻酔を受け取らなかったが、同じ手段によるとテストされました。イソフルラン麻酔と対照マウスと比較して C57BL/6JRj マウスの福利に繰り返しイソフルラン麻酔の 1 つ経験の影響を検討しました。ここでは、女性の C57BL/6JRj マウスの代表的な結果は、以前は Hohlbaumらで公開いくつかのデータを含む以前に未発表の結果と同様に、 10のとおりです。
統計解析
各パラメーターの探索的データ解析と正規のテストを行った。(すなわち、単一のイソフルラン麻酔コントロールは、図の説明で述べたように、イソフルラン麻酔をそれぞれテストを使用して行った繰り返されます研究グループの相違点。データが正規分布の仮定を満たして 1 ウェイ分散分析を行った。非通常クラスカル-ウォリス-テストの差を利用した分散データを行った p < 0.05 で有意と考えられました。
ベースライン値
基準値、手順が実施される前に収集は、治療グループは、それぞれのパラメーターで異なるかどうかを決定するために重要です。図 6図 7図 8図 9 図 10に示されているように、MGS のベースライン レベルのスコア (p = 0.762、クラスカル-ウォリス検定)、穴を掘るのような豪華な行動 (p = 0.896、クラスカル-ウォリス検定) とネスト (p = 0.723、クラスカル-ウォリス検定)、食物摂取 (p = 0.398、1 ウェイ分散) とホーム ケージ活動 (p = 0.208、クラスカル-ウォリス検定) 大幅グループ間に差はなかった。さらに、ベースライン FCM 濃度に有意差は認めない (角かっこ [ng/50 mg] で中央値、四分位範囲: 制御: 123.01 (82.70-193.46); 単一麻酔: 118.31 (101.73 153.54); 繰り返しなされる麻酔: 129.55 (92.58 139.48)) (pクラスカル-ウォリス検定 0.904 を =)。ベースラインのレベルの相違が発生した場合は、デルタ値が計算できます。
マウスのしかめっつらスケール
コントロールと重要なより高いスコアが発見されたの麻酔の 1 つの経験に MGS の平均スコアを比較すると、(p = 0.001) 最後は麻酔セッションを繰り返した後、(p 0.021 =) 最後麻酔 (図 6 a) 後 30 分で引き起こされる.最後麻酔後 150 分で群間差がもはや (p = 0.910)。
ベースライン MGS スコアが常に 0 に等しくないことという事実を考慮するには、プロトコルに従って MGS 違いスコア算出しました。両方シングルの麻酔の経験 (p = 0.002) と繰り返しなされる麻酔 (p = 0.008) 麻酔後 30 分でコントロールと MGS 違いスコアを増加します。最後の麻酔後 150 分ですべてのマウスのコントロール レベルに戻っていた (p = 開く 0, 617) (図 6 b)10。
穴を掘る動作
麻酔が食品の重量の割合を大幅に削減を繰り返しコントロールと巣穴から削除マウスのペレット (p = 0.036 Kruksal ウォリス検定) (図 7)10。
巣作り行動
コントロール、繰り返しなされる麻酔は、麻酔の経験を 1 つ間巣スコアに有意差はありませんでした (p = 0.240、Kruksal ウォリス検定) (図 8)10。
食品の摂取量
最後の麻酔後 1 日で有意繰り返しなされる麻酔を受けていたマウス単一の麻酔を経験していたマウスと比較して摂食量の減少 (p = 約 0.047、1 ウェイ分散分析)。対照的に、一週間後、受けたマウス繰り返される麻酔コントロールよりも著しくより多くの食料を消費 (p = 0.012、1 ウェイ ANOVA) または単一の麻酔を受けたマウス (p = 0.001、1 ウェイ ANOVA) (図 9)10。
ホーム ケージ活動
最後の麻酔後 1 日で放射能曲線の下の領域で示される暗期ホーム ケージ活動に差はなかった単一麻酔、繰り返しなされる麻酔またはコントロール治療を受けたマウスの間で (p = 0.498、Kruskal-Wallis-Test) (図 10)10。
無料探索的パラダイム
テストが実施されたとき、すべてのマウスはケージ上部を探検しました。ただし、最後の麻酔後 1 日受けたマウス繰り返し麻酔 (角かっこ [s] で中央値、四分位範囲: 78.00 (55.00 89.00)) コントロールよりも時間でかなり後でケージの上部を探検 (31.00 (18.25 42.75); p = 0.009、Kruskal-Wallis-Test) と 1 つの麻酔を受けたマウス (27.00 (21.00 45.50); p = 0.001、クラスカル-ウォリス検定)、前述10を公開します。探査 (図 11 a) ・探検 (図 11 b) の数のパラメーターの合計時間は、最初の探査に待ち時間に似ています。麻酔がコントロールと探求の数を大幅に削減を繰り返し (p = 0.023、クラスカル-ウォリス検定) と探査の合計期間 (p = 0.032、クラスカル-ウォリス検定) 最後の麻酔後 1 日で単一麻酔対。8 日最後の麻酔、すべてのパラメーター、すなわち最初の探査に待機時間後 (コントロール: 27.50 (13.50 47.25); 単一の麻酔: 18.00 (9.50-38.50); 繰り返しなされる麻酔: 20.00 (12.50 42.00); p = 0.722、クラスカル-ウォリス検定)、数探検 (p = 0.057)、探査の期間を合計し、(p 0.579)、もはや異なる研究グループ (図 11) 間。
糞便中コルチコステロン代謝物
ベースラインの計算基準値を取得、する割合の変更を考慮するために、グループ間に有意差が見つかりませんでした (p = 0.119、クラスカル-ウォリス検定) (図 12)10。
図 1: プロトコルのタイムラインします。グレーと白の着色されたフィールドは闇を象徴してそれぞれ日の期間の光します。に応じて、このプロトコルを適応させる可能性があります。「バロウに慣れ」は、マウスが穴居性テストを行うことができる前に彼ら家ケージの穴としてプラスチック製の水ボトルを使用してに慣れる必要があることを意味します。B、ベースライン値;FCM、糞便中コルチコステロン代謝産物。この図は、Hohlbaumらから変更されています。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サマリーのスコアリング シート。このシートは、すべてのテストが含まれています、それぞれの個々 のマウスの記入することができます。テストを行うとき、日付と時刻を追加する必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 幸福の等級のスケールします。スケールからの範囲「幸福健常者」(緑)「幸福障害」(赤)、エクスプレス テスト結果を簡単な方法での意味。幸福の指標に関する知識のこの段階で我々 は幸福だけ一般的なステートメントは、各テストの成績に明確な声明をことはできません。MGS、マウスのしかめっつらスケール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 観測ケージ。このケージは、テスト動作を掘り進むのとマウス顔をしかめるスケール (MGS) によると分析する写真を撮るために使用されます。ケージの前面がクリア、黒またはマウスとは対照的に白によってマウスの毛皮の色、他の 3 つの壁を着色する必要があります。ガラスの箱の床は家のケージから使用される寝具材料を含む寝具材料の約 0.5 cm で覆われています。標準的な食料と水を提供しています。可能であれば、水のボトルではなく、ボウル使用してください、マウスは寝具の材料とボウルを埋めることができるので。少なくとも 30 分の馴化期間の後穴が追加されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 24 時間観察期間。巣づくり行動、ホーム ケージ アクティビティ、および食品の摂取量を評価して糞便中コルチコステロン代謝産物 (FCM) を測定する糞便のサンプルを収集するには、マウスが 24 h に対して個別に収容されて (ケージ ・ タイプ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm; 素材の寝具約 0.5 cm に使用されるとの深いホーム ケージから素材を寝具の上に散在している、綿 nestlet、水道水および標準的な食品ダイエット広告自由)。赤外線センサーは、ケージの上にマウントされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: マウスのしかめっつらスケール (MGS).ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。ドットは、1.5 3.0 × IQR の間の値と外れ値です。色のアスタリスクは、3.0 × IQR より大きい値と外れ値です。(A) 意味 MGS スコアします。(B) 意味 MGS はスコアを差します。p 値は、クラスカル ・ ウォリス検定を算出した: * p < 0.05;* * p < 0.01。(カメラ、スケール) は技術的な故障のため 4 マウス単一, 局所麻酔群では統計から除外するならなかった。この図は、Hohlbaumらから変更されています。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 穴を掘る動作します。ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。色のアスタリスクは、3.0 × IQR より大きい値と外れ値です。p 値は、クラスカル ・ ウォリス検定を算出した: * p < 0.05。(カメラ、スケール) は技術的な故障のため単一, 局所麻酔群で 4 つのマウスは統計的解析から除外しなければならなかった。この図は、Hohlbaumらから変更されています。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 動作の造巣します。ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。ドットは、1.5 3.0 × IQR の間の値と外れ値です。p 値は、クラスカル-ウォリス-テストを算出しました。d の日。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 食物摂取。データは、平均 ± 標準偏差です。p 値は、1 ウェイ分散 (post hoc テューキー HSD) を算出した: * p < 0.05;* * p < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: Home ケージ活動。ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。ドットは、1.5 3.0 × IQR の間の値と外れ値です。p 値は、テスト: クラスカル-ウォリスを算出したこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 無料探索的パラダイム。ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。ドットは、1.5 3.0 × IQR の間の値と外れ値です。色のアスタリスクは、3.0 × IQR より大きい値と外れ値です。(探査の A) 合計期間です。(B) 調査の数です。p 値は、クラスカル ・ ウォリス検定を算出した: * p < 0.05。この図は、Hohlbaumらから変更されています。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 12: 糞便コルチコステロン代謝産物 (FCM).ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します、ボックスのエッジは 25回75番目の四分位数。ひげは、1.5 × IQR 以上である値を表します。色のアスタリスクは、3.0 × IQR より大きい値と外れ値です。FCM のレベルは、2 日前までに、1 日の投稿の手順を測定しました。それぞれの基準値に対する FCM 濃度 [%] 変化率を算出しました。クラスカル-ウォリス-テストを使用してデータを分析したこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルは、単一の麻酔または繰り返しのイソフルラン麻酔を受けた C57BL/6JRj マウスの福利を評価するために元々 開発されました。結果は幸福を評価するため機密性の高いメソッドが他の手段 (例えば無料探索的パラダイム MGS、穴居性の食品の摂取量) と同様に、高級な動作テストをするを確認します。繰り返しイソフルラン麻酔には、特性不安関連行動、MGS、潜砂行動の短期的な影響が原因発生します。さらに、食品摂取量10に影響を与える繰り返しイソフルラン麻酔が登場。
無料探索的パラダイムに減らされた探索行動が示されているし、何度も麻酔したマウスで高い特性不安のレベルが一度だけ麻酔したマウスとコントロールと比較してその結果。ただし、すべてのグループのマウスは、グリッド ケージ トップ10,20を検討しました。不安関連行動を調査するとき、特性および状態不安21,22の間で区別することが重要です。不慣れな環境でマウスを置く状態不安を誘発します。対照的に、自由探索的パラダイムは動物ホーム檻の中で滞在することができ、したがって、不安を調査します。
モーター活性の低下によって説明できない繰り返しなされる麻酔後のマウスの探索行動が減少します。ホーム ケージ暗期活動は、研究グループ間大幅に差はなかった。これは、マウスが無料探索的パラダイムのテストが実行されたとき麻酔から既に物理的に回復したことを示します。
MGS は実際に痛みを評価するために開発されたが、顔の表情がストレスと肯定的な感情13,23によって改変されてもこと証拠があります。マウスの顔の写真は、両方のシングルと繰り返しのイソフルラン麻酔が麻酔後当面の期間の短期的には、MGS のスコアを増加する示されます。MGS 違いスコアは依然 1 以下、ストレスのレベルは軽度10に登場。結果は賛成ミラーらの最近の観測24,25レベル 150 分を制御する返されるマウス投稿麻酔10であることを示した。
穴を掘ると巣づくり行動のような豪華な行動、種特異的な幸福7とマウス26の良い一般的な健康の指標となることができます。マウスは、不可欠なニーズが満たされたときにだけ高級動作を示します。幸福を縮小した場合、高級動作は最初障害5,7にいます。穴を掘ると巣作りが苦痛を与えない6,8、損なわれることが、海馬病変がこれら 2 つの動作15,27に影響を与えることができる証拠があることを示した前の研究,28,29,30,31。
高級動作は、(動作の造巣) の次の日の朝、麻酔後初期 (潜入行動) で調べた。順化 (代わりに、個々 の住宅の集合住宅) と行動計測 (24 h ではなくだけ 2 h) の期間について変更された動作執事らによって開発され、Jirkofらによって採用を掘り進むためのテスト8,15,16。
それは幸福の減損を直ちに麻酔10も Jirkofらにより報告されている投稿があったことを示唆している麻酔減る穴を掘る動作を繰り返し注目8. ときマウスが麻酔から回復するより多くの時間を持っていたら、次の日の朝に建てた高と複雑な巣が幸福10を経験していたこと示されました。これらの調査結果は、以前の時間32で巣を獲得する以前の報告と異なります。したがって、プロトコルの適応し、前に巣をスコアに役に立つ場合があります。ただし、巣づくり行動の概日リズムは、マウスが暗期32の終わりに彼らの巣を準備する傾向があるまだ考慮する必要があります。
食品の摂取量はわずか 1 日繰り返しなされる麻酔後を減少したが、1 週間後に増加しました。マウスは体重を失いませんでした、(Hohlbaumらを参照してください。10) 補償機構のいくつかの種類が発生する可能性が、食物摂取に関して幸福の障害は軽度10として分類される必要があります。食品の摂取量は、術後の苦痛、幸福と術後悪心26と27術後のストレスによって損なわれることがマウスで食欲に洞察力を提供します。
FCM は確実にマウス33,34,35の応力を示します。ピーク FCM 濃度は通常ストレッサー後 8-10 h を発生するが、腸管通過時間18によって異なります。このプロトコルに含まれているため、またホーム ケージの活動を監視することが重要です。排泄の FCM18の概日リズムの効果のため 24 時間麻酔後期間 24 時間 FCM 濃度反射急性ストレスの期間にわたって糞便のサンプルを収集することをお勧めします。FCM のレベルは異なる個々 の個々 から、ベースラインを基準として FCM レベル値の変化率を算出しました。現在の調査の FCM 結果は、繰り返しなされる麻酔も麻酔の 1 つ経験大幅増加視床下部-下垂体-副腎 (HPA) 軸活動10示されます。
すべてのすべてで、所見はイソフルラン麻酔短期的な穏やかな苦痛し、幸福をイソフルラン麻酔10の単一の経験よりもわずかに多く麻酔後初期の障害が繰り返されます。
幸福を評価するためにプロトコルに動物の追加苦痛を課すことはできません。現在のプロトコルの制限は、血漿コルチコステロン レベル36を増やす知られている 24 h 観測期間中に個々 の住宅を含むということです。ただし、個々 の住宅はホーム ケージ活動、食品の摂取量、巣作り行動、FCM レベルに関する個人の有効なデータを収集するために必要です。個々 の住宅の期間は (すなわち24 時間観察期間中) に同時にこれらの 4 つのパラメーターを調べることで最小化されました。コントロール マウスが同じテストを受けた個々 の住宅によって偏っているから結果を防ぐために、その結果を考慮しました。グループ住宅環境でこれらのパラメーターを測定する方法があります、使用される (例えばホーム ケージ活動37と食物摂取のためホーム ケージを自動分析システム) よう必要があります。ただし、自動化されたホーム ケージ システム解析できない場合があります、追加の機器が必要です。研究は、個人ではなく動物のグループに焦点を当て、ホーム ケージ活動、食物摂取、巣作り行動と FCM レベルはマウスのグループの評価も可能性があります。彼らは区別される場合がありますので、目に見えてマークにマウスを必要なだけ無料の探索的パラダイムも同様です。グループ内のすべてのマウスを慎重にチェック必要がありますグループの福利を縮小した場合 (スコアシートおよび臨床試験使用) マウスまたはマウスを識別するために懸念しています。グループの値の感度を決定するグループ レベルで今後の観察が必要です。
洗練された、に関してこのプロトコルに適応できでマウスのある特定のプロシージャの影響を査定する進行中の研究に統合します。特定の手順と研究デザインによってこの議定書から最も適した検査を選択してください。ここでは、穴を掘るとテスト、MGS、自由探索的パラダイムと食物摂取の測定の造巣登場特に有益であること。マウスの挙動が概日リズム38通り、定義された時点ですべてのグループのマウスの行動テストを実行することをお勧めします。マウスは、午後38よりも朝よりアクティブです。ただし、朝テスト研究デザインは、別の時、テストを行われる可能性があります。また、すべてのグループに対して同じ時点で各々 の単一テストを実施することが重要です。それ以外の場合、パラメーターの概日リズムの影響は内、あるいは集団間の相違で起因できます。さらに、扱われたマウスとマウスで結果を比較することができるように、研究では制御マウスが含まれます。マウスは、扱われたマウスと同じ時間ポイントでテストされなければなりません。プロトコルは、よくされて、障害を示している場合プロシージャは、洗練された必要があります、プロトコルが繰り返されます。このアプローチは、手順を改良するための努力が効果的であったかどうかを示すことができます。
この議定書は、プロシージャによって引き起こされる厳しさの度合いを推定する一般的な援助として使用できます。したがって、それは科学、動物中心のレベルのプロシージャの重症度を分類するのに役立ちます。ただし、プロトコルは、軽度、中程度、または重度としてプロシージャを分類するための尺度を提供しません。プロシージャの重症度を分類するために附属書 VIII の EU 指令 2010年/63 例を参照する必要です。
結論としては、この議定書は全身麻酔を使用する時の手順、動物を中心とした科学的な方法でマウスの幸福の体系的な評価をサポートします。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ザビーネ ・ ジェイコブス サンプル コレクション、エディス ・ Klobetz-・ ラッサムの FCM 解析を支援するためのおかげで PD 博士医獣医します。habil。統計分析を支援するため Roswitha メルルと原稿の校正のための Wiebke ・ ゲントナー。研究ベルリン-ブランデンブルク研究プラットフォーム BB3R の一部 (www.bb3r.de) は、ドイツ連邦教育省、研究によって資金が供給された (許可番号: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluran | CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH | 1214 | |
| InfraMot - Sensore Units | TSE Systems | 302015-SENS | |
| InfraMot - Control Units | TSE Systems | 302015-C/16 | |
| InfraMot - Software | TSE Systems | 302015-S | |
| Nestlet N | Ancare - Plexx | NES3600 | |
| Camera EOS 350D | Canon |
References
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