Summary
Vi utvecklade ett protokoll för att bedöma välbefinnande hos möss under förfaranden med narkos. En serie av beteendemässiga parametrar som anger nivåer av välbefinnande samt glukokortikoid metaboliter analyserades. Protokollet kan fungera som ett allmänt stöd att uppskatta graden av svårighetsgraden i en vetenskaplig, djur-centrerad sätt.
Abstract
I linje med de 3R principen (Replacement, minskning, förfining) utvecklat av Russel och Burch, bör vetenskaplig forskning använda alternativ till djurförsök när det är möjligt. När det finns inget alternativ till djurförsök, bör det totala antalet försöksdjur som används vara ett minimum som krävs för att få värdefulla data. Dessutom bör lämpliga förfining åtgärder vidtas för att minimera smärta, lidande och ångest som åtföljer det experimentella förfarandet. De kategorier som används för att klassificera graden av smärta, lidande och ångest är icke-återvinning, mild, måttlig eller svår (EU direktiv 2010/63). För att bestämma vilka kategorier tillämpas i enskilda fall, är det viktigt att använda vetenskapligt verktyg.
Protokollet brunn-vara-bedömning som presenteras här är utformad för förfaranden som används för narkos. Protokollet fokuserar på buren aktivitet, mus grimas skala och lyx beteenden såsom grävande och bygger beteende som indikatorer för välbefinnande boet. Den använder också gratis förberedande paradigm för drag ångest-relaterade beteenden. Fekal kortikosteron metaboliter som indikatorer på akut stress mäts under perioden 24-h efter narkos.
Protokollet ger vetenskapligt solid information om välbefinnandet hos möss efter narkos. Tack vare sin enkelhet, kan protokollet enkelt anpassas och integreras i en planerad studie. Även om det inte ger en skala för att klassificera nöd i kategorier enligt de EU-direktiv 2010/63, kan det hjälpa forskarna att uppskatta graden av svårighetsgraden av en procedur med vetenskapligt korrekta data. Det ger ett sätt att förbättra bedömningen av välbefinnande på ett sätt som vetenskapliga, djur-centrerad.
Introduction
EU: S direktiv 2010/631 föreskrivs att den 3R-principen (ersättning, begränsning, förfining) som utvecklats av Russel och Burch2 tillämpas närhelst djurförsök är nödvändigt. Det yttersta målet för EU-direktivet är att fasa ut alla djurförsök, men direktivet erkänner att, för närvarande vissa djurförsök fortfarande behövs för att bedriva forskning som kommer att skydda människors och djurs hälsa. Således, om ett djurförsök inte kan ersättas med någon alternativ metod, är bara det minsta antalet försöksdjur som används för att få tillförlitliga resultat. Dessutom ska mängden smärta, lidande och ångest som åtföljer experimentella rutiner minimeras genom att använda lämpliga förfining. EU: S direktiv 2010/63 föreskrivs att svårighetsgraden av ett förfarande prospektivt måste klassificeras som icke-recovery, mild, måttlig eller svår1. Som svårighetsgrad klassificering avgörs på grundval av fall, är det viktigt att ha vetenskapligt verktyg att uppskatta svårighetsgraden av ett visst förfarande.
Poäng ark som föreslagits av Morton och Griffith3 är ett viktigt verktyg för att upptäcka eventuella avvikelser från normal status, inklusive negativa effekter på välbefinnande4. Poäng ark används för att efterhand bestämma smärta, lidande, och ångest som orsakas av ett experiment och fokus på synliga förändringar i det fysiska tillståndet av enskilda djur (t.ex., kroppsvikt, päls, gånganalys). Även om, bilaga VIII i EU: S direktiv 2010/63 ger exempel på varje kategori i svårighetsgrad, forskare fortfarande saknar verktyg för att uppskatta graden av svårighetsgraden av en given procedur med vetenskapligt baserade data.
Avsaknad av indikatorer som visar negativ välbefinnande är inte det enda sättet att avgöra tillstånd för djuret. förekomsten av indikatorer pekar på positiv välbefinnande är också viktiga5,6,7,8. Till exempel djur Visa lyx beteenden som grävande och kapsla byggnad beteende endast när alla deras grundläggande behov är uppfyllda. Om välbefinnande minskas, är lyx beteenden först att minska5,7. Protokoll som ska användas vid bedömningen av välbefinnande bör omfatta indikatorer pekar på den fysiska, fysiologiska/biokemiska och psykologiska tillstånd av djur för att utvärdera deras välbefinnande i en detaljerad och omfattande sätt9.
Inom ramen för förfining utvecklades ett protokoll att uppfylla dessa krav och bedöma effekterna av ett förfarande som inbegriper narkos på välbefinnande av möss10. Samtidigt var målet att minimera ytterligare stress för att aktivera enkel integrering av protokollet i en given experiment. Protokollet anser grävande beteende, buren beteende som aktivitet, födointag och kapsling och drag ångest-relaterade beteenden. Det innehåller dessutom mus grimas skala (MGS) och icke-invasiv analysen av kortikosteron metaboliter i avföring. Protokollet syftar till att underlätta bedömningen av välbefinnande på ett vetenskapligt och djur-centrerad sätt och ge information om välbefinnande som stöder klassificering av graden av svårighetsgrad. Förutom Poäng ark, kan det ge användbar information för allvarlighetsgrad klassificering av ett förfarande. Eftersom protokollet är lätt att genomföra och kräver ingen omfattande utrustning, kan det integreras i ett pågående experiment utan att påverka resultaten av en studie. Det bör noteras att djuret forskningen: rapportering av i Vivo experiment (ankomst) riktlinje11 är att observeras i alla studier som involverar djurförsök, med målet att förbättra design, analys och rapportering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien utfördes enligt de riktlinjer som fastställts av tyska djurskyddslagen och godkändes av den Berlin statliga myndigheten (”Landesamt für Gesundheit und Soziales”, tillstånd nummer: G0053/15).
Obs: Huvudsyftet med detta protokoll var att undersöka effekten av upprepad anestesi på glukokortikoid metaboliter. En prov storlek beräkning utfördes för att bestämma antalet djur som skall användas: n ≥ 2 × (s / µ1- µ2)2 × (zα + zβ)2. µ1- µ2 är skillnaden mellan populationsmedelvärdena som makt och prov storlek beräkningar görs (α = 5%, β = 80%); zα = 1,96 och zβ = 0.84 är quantiles av standardnormalfördelningen. Figur 1 illustrerar raden tid i detta protokoll. Om en parameter i protokollet visar en skillnad med kontrollnivå, djuret ska övervakas noga och parametern bör mätas igen efter en lämplig period. Till exempel om drag ångest-relaterade beteenden ökar, bör detta beteende testas igen en vecka senare för att kunna avgöra fram till fullständig återhämtning. Tidpunkter och perioder som definieras i detta protokoll kan anpassas för användning med andra förfaranden. När du ändrar tidpunkter, bör tillvänjning perioder hållas som beskrivs i protokollet. För att minska faktorer som kan påverka mössens beteende, bör tester som kräver mer manipulation utföras efter tester som inte stör det normala beteendet hos möss. Figur 2 sammanfattas alla tester av protokollet med en sammanfattande scoring ark. Figur 3 ger förenklad skalor för kvalitet av välbefinnande, som ger en översikt över hur man ska tolka testresultaten.
1. tillvänjning möss till hantering av försöksledaren
- Tillåta möss till habituerar till djuranläggningen i minst 2 veckor efter att de har erhållits från en annan anläggning eller leverantör.
- Hus möss i grupper och underhålla dem under standart villkorar (rumstemperatur 22 ± 2 ° C, relativ luftfuktighet 55 ± 10%) på en ljus: mörk cykel av 12:12 h.
- Ge alla grupper med en tunnel och bomull nestlets som standard berikande, och ge mat och vatten ad libitum.
- Habituerar alla möss av tunnel eller kopp hanterar minst en vecka före testning12.
Obs: Plocka upp möss i svansen kan framkalla stress eller ångest, vilket i sin tur påverkar välbefinnande och har också en inverkan på resultaten av detta protokoll12.
2. förbereda beteendemässiga testning rum och apparaturar
Obs: Ge ett separat rum för provning, idealiskt nära rummet där djuren hålls. Transportera möss i sina hem burar till testning rum minst 60 min innan rättegången äger rum. Om möjligt, utföra alla tester för detta protokoll i samma provning rum där förfarandet utförs.
- Förbereda en observation bur att testa hålhäckande beteende8 och ta fotografier för användning i MGS13 (figur 4).
- Använd ett glas låda med en golvyta på cirka 220 mm × 290 mm och en höjd av 390 mm.
- Täcka golvet i denna box med ca 0,5 cm av strömedel.
- Strö en handfull använt strö material från buren ovanpå det nya sängkläder materialet att minska ångest som orsakas av den nya miljön.
- Ge mat, samma typ som levereras normalt som kost och vatten.
Obs: om möjligt, använda vattenflaskor, eftersom möss kan fylla vatten skålar med strömedel.
- Förbereda en bur (typ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) för 24-h observationsperioden, som hålls möss individuellt (figur 5).
Obs: För att minimera längden på enskilda bostäder, samla in data för boet bygga beteende, buren aktivitet, födointag och fekal kortikosteron metaboliter (FCM) under denna period.- Plats nytt strömedel i buren (ca 0,5 cm djupt) och scatter en handfull använt strö material utan avföring från buren ovanpå det nya materialet, för att minska ångest.
- Tillhandahåller en standardiserad fyrkantig bomull nestlet med en definierad vikt, som miljömässiga anrikning endast (se tabell material)14.
Obs: Kommersiella nestlets skilja i vikt. Därför vi vikten på den nestlet som beskrivs av Deacon och används 2,0 g i stället för 2,7 g14. - Montera den infraröda sensorn ovanpå buren, när du använder en infraröd sensor för att mäta buren aktivitet (se tabell material).
- Ge mat, samma typ som levereras normalt som kost, och vatten ad libitum.
3. mus grimas skala
Obs: Fotografier för MGS tas i observation buren vid tre tidpunkter: a 2 dagar innan förfarandet för att spela in utgångsnivåerna MGS, (ii) 30 min efter ingreppet och (iii) 150 min efter ingreppet. När välbefinnande är nedsatt, öka poäng på MGS. Om ökad MGS noter observeras fortfarande efter 150 min, ta ytterligare fotografier i ett senare skede.
- Använd en HD-kamera för fotografering.
- Försiktigt föra musen till observation buren och låt musen för att habituerar till den nya miljön i minst 30 min.
- Kontinuerligt tar ungefär 30-40 fotografier för varje gång pekar inom 1-2 min.
- Sortera alla fotografier genom att markera de skarpa frontal eller laterala fotografierna och kasta suddiga foton eller foton som visar musen ansikten från andra perspektiv än frontal-eller laterala.
- Slumpmässigt välja ett foto från varje tidpunkt, (dvs 2 dagar före förfarandet, 30 min efter ingreppet, och 150 min efter ingreppet) för varje mus.
- Beskära fotografier för att visa endast chefen för musen så att kroppsställning inte är synliga13.
- Skapa en kalkylbladsfil med ett ark för varje foto och lägga till en tabell inklusive de fem facial action enheterna av MGS på varje ark.
Obs: Filen innehåller baslinjen fotografier samt fotografier efter proceduren. - Slumpa ordning på arken.
- Presentera filen på en datorskärm till tre oberoende personer, som utbildats tidigare att använda den MGS som utvecklats av Langford et al. och har dem Poäng facial action enheterna med hjälp av en 3-gradig-skala (0 = saknas, 1 = måttligt presentera, 2 = självklart närvarande).
Obs: Scoring är baserad på följande parametrar13: Orbital åtdragning (”förträngning av omloppsbanor området, med ett tätt slutna ögonlock eller ett öga squeeze”); näsa utbuktning (”rundade förlängning av hud synlig på bron i näsan”); kinden utbuktning (”konvex utseende av kinden muskeln”); öra position (”öron drog isär och tillbaka från deras baslinjen ställning eller med lodräta åsar som bildar på grund av tips av öronen dras tillbaka”); Whisker förändring (”rörligheten för morrhår från deras baslinjen placera antingen bakåt, mot ansikte eller framåt, som om står på slutet; morrhår kan också klumpar ihop ”). - Analysera resultat, enligt följande (anpassad från Langford o.a. ( 13).
- Genomsnittliga alla facial action enheter för varje fotografi för att generera den MGS poängen.
Obs: Om en av de facial action enheterna inte kunde vara poängsätts, genomsnittlig kvarvarande facial action enheter. - Subtrahera medelvärdet för baslinje fotograferar från medelvärdet för de fotografier efter proceduren att få en MGS skillnaden Poäng för varje mus.
- Test för skillnader i MGS skillnaden poängen mellan personerna (icke-parametriska test för relaterade prover).
Obs: Om det finns en signifikant skillnad (p < 0,05), avgöra om värderingar för alla bilder eller endast betyg av några fotografier skiljer sig åt mellan personer. Om det senare är sant, upprepa poängsättning av dessa fotografier. Annars bör personerna upprepa MGS utbildningen och sedan Poäng fotograferar igen. - Genomsnittliga MGS skillnaden poängen erhålls från de olika målskyttar för varje mus, om resultaten av alla personer inte betydligt avviker.
- Använda en icke-parametriska statistiska test för att jämföra MGS skillnaden poängen i genomsnitt mellan basgrupperna.
- Genomsnittliga alla facial action enheter för varje fotografi för att generera den MGS poängen.
4. grävande beteende8,15,16
- Förbereda hålor genom att placera 140 ± 2 g mat pellets levereras normalt som diet i en standard ogenomskinlig plast vatten flaska (250 mL, längd 150 mm, 55 mm i diameter, 45 mm diameter på buteljera hånglar)8.
Obs: Som möss föredrar breda rör, hålor med en diameter på 68 mm kan användas som beskrivs av Deacon16. - Plats håla fylld med mat pellets i buren 5 dagar före ingreppet för acklimatisering.
Obs: Regelbundna mat-dispensering enheten i buren bör inte tömmas men bör också förbli fyllda med mat pellets, som möss används till detta. - Genomföra testet två gånger, 2 dagar före ingreppet (baslinje); genomföra de sista 30 min efter proceduren samt.
- Låt musen habituerar för minst 30 min till observation buren där fotografier för MGS togs.
- Placera vatten plastflaska fylld med mat pellets parallell till den baksida väggen av observation buren.
- Väga mat pellets (g) kvar i hålan efter 2 h.
- Räkna ut vikten av mat pellets bort från håla av möss i förhållande till ursprungliga vikt (%).
5. 24-h observationsperiod
Obs: Möss är inrymda individuellt, såsom beskrivs i 2.2. (Figur 5), för en period av 24 h, för att mäta mat intag, buren aktivitet, kapsla byggnad beteende och FCM nivåer. 24-h observationen sker två gånger: a 2 dagar före ingreppet för utgångsnivåerna, (ii) på dagen för proceduren.
-
Födointag
- Väga möss med jämna mellanrum (t.ex. 2 dagar före anestesi, omedelbart före anestesi, 2 dagar efter anestesi och vecka efter anestesi), för att utvärdera eventuella förändringar i kroppsvikt (del av bladet Poäng).
Obs: Kroppsvikt krävs att beräkna födointag per gram kroppsvikt. Vattenintag kan också mätas under 24-h observationsperioden. Om födointag minskas, kan välbefinnande vara nedsatt. - Bestämma den ursprungliga vikten av standard kost (gram) som tillhandahålls i enheten mat i buren (ca 100 g).
- Fastställa vikten av vanlig kost i slutet av 24-h observationsperioden.
- Skanna den bur sidan under mat enheten noggrant för mat spill och lägga till någon extra mat pellets hittade vikten av mat pellets kvar i enheten mat.
- Beräkna födointag per enhet kroppsvikt.
- Väga möss med jämna mellanrum (t.ex. 2 dagar före anestesi, omedelbart före anestesi, 2 dagar efter anestesi och vecka efter anestesi), för att utvärdera eventuella förändringar i kroppsvikt (del av bladet Poäng).
-
Buren aktivitet
Obs: Följande instruktioner se användningen av en infraröd sensor (se tabell material), men buren aktivitet kan också bedömas med alternativa program. Avvikelse av buren aktivitet från kontrollnivåer (t.ex. hypoaktivitet, hyperaktivitet) kan vara ett tecken på nedsatt välbefinnande.- Starta programmet.
- Välja en samplingsintervallet 1 min och en förvärv 24 h, vilket innebär att impulser registreras varje minut under 24 h.
Obs: Om försöksledaren kommer in i rummet flera gånger efter inspelningen har startat, endast använda uppgifter från perioder, då möss inte var störd (dvs. under den mörka perioden). - Summera 10-minuters intervall av impulser.
- Beräkna arean under tidskurvan (impulser × min).
-
Boet byggnad beteende
Obs: Komplexa och höga Bon kan fungera som en indikator av välbefinnande.- Placera en fyrkantig bomull nestlet (se Tabell för material) med en definierad vikt (t.ex. 2.0 g) i mitten av buren.
- Poäng boet på en 5-gradig skala (se nedan) enligt Deacon14 följande morgon, ca 2 h efter ljuset tänds. Väga untorn nestlet delar som är minst 5% av den ursprungliga nestlet vikten. Poäng Bon som följer14
- Tilldela Poäng för ”1” om 90% av nestlet som är intakt.
- Tilldela Poäng för ”2” om det är 50-90% intakt.
- Tilldela poäng ”3” om 50-90% av nestlet är strimlad.
- Tilldela poäng ”4” om mer än 90% är strimlad men boet är platt, och mindre än 50% av dess omkrets är högre än mus kroppslängd när uppkrupen.
- Tilldela poäng ”5” om mer än 90% nestlet är strimlad och boet är hög, och mer än 50% av dess omkrets är högre än kroppslängd av krullat upp musen.
-
Fekal kortikosteron metaboliter
Obs: Ökningar av FCM ovanför kontroll återspeglar akut stressnivåer under perioden 24-h postanesthetic.- Samla alla torra fekal pellets från buren med hjälp av pincetten i slutet av 24-h observationsperioden och eliminera våta pellets förorenade med urin.
- Extrahera FCM enligt Palme o.a. 17, enligt följande.
- Torra fecal prov vid en temperatur på 60-70 ° C.
- Homogenisera fecal prov med hjälp av en mortel.
- Skaka en alikvot av 0,05 g med 1 mL 80-procentig metanol i ett centrifugrör i 30 min på en multi virvel.
- Centrifugera proverna vid 2500 x g i 15 min.
- Pipettera 0,5 mL av supernatanten till en annan centrifugrör.
- Lagra fecal prov (och extrakt) minst-18 ° C.
- Analysera FCM använder en 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzyme immunoassay (EIA)18,19 eller en annan fullt validerade MKB.
- Beräkna den procentuella förändringen av FCM koncentrationer i förhållande till baslinjen FCM koncentrationerna.
6. gratis förberedande paradigm
- Ta buren av racket och placera den på en bordsytan i slutet av 24-h observationsperioden.
- Placera en inrutade bur topp (utan mat eller vatten flaskor) i buren med en vinkel av 45° mot den längre sidan av buren.
Obs: Förstör inte boet, som fungerar som ett gömställe för musen, men placera buren upp diagonalt ovanför boet. - Bildskärm eller video-record möss för 10 min från ett avstånd av ca 1,5 m.
- Starta timern.
- Observera tiderna när musen klättrar på bur toppen (med alla fyra tassar på bur överst) eller lämnar buren upp (med en eller flera tassar på golvet bur).
Obs: Vissa möss kan klättra upp buren upp och lämna det för att promenera längs kanten av buren. Vissa möss bakre även ovanpå buren. Behandla dessa fall som om mössen var fortfarande på bur överst.
- Utvärdera parametrar efter Bert o.a. 20.
- Analysera latens till första utforskning (i sekunder).
- Analysera antal upptäcktsfärder.
- Analysera totala varaktighet (sekunder) av utforskning.
Obs: En hög latens till första prospektering, ett lågt antal upptäcktsfärder och låg sammanlagt prospektering kan innebära högre drag ångest nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll utvecklades ursprungligen för att bedöma välbefinnande C57BL/6JRj möss efter en enda erfarenhet av isofluran anestesi (en 45-minuters anestesi session, n = 13 kvinnor) eller upprepade isofluran anestesi (sex 45-min anestesi sessioner med 3-4 dagar mellan den anestesi sessioner, n = 13 kvinnor) jämfört med kontroll möss välbefinnande (n = 6 honor)10, som fick ingen anestesi men testades enligt samma åtgärder. Vi bedömt effekterna av en enda erfarenhet av isofluran anestesi och upprepade isofluran anestesi på wellen-being av C57BL/6JRj möss jämfört med obehandlad kontroll möss. Här, representativa resultat av C57BL/6JRj honmöss, inklusive vissa data tidigare publicerad i Hohlbaum et al. 10, liksom tidigare opublicerade resultat, visas.
Statistisk analys
Explorativ dataanalys och tester för normalitet utfördes för varje parameter. Skillnader mellan studiegrupperna (dvs. kontroll, enda isofluran anestesi, upprepade isofluran anestesi analyserades i respektive test, som anges i figur legender. När data träffade normalfördelning antaganden, utfördes 1-vägs ANOVA. Icke-normalt distribuerade data analyserades med Kruskal-Wallis-Test. skillnaderna ansågs signifikant på p < 0,05.
Utgångsvärden
Utgångsvärdena, samlas in innan förfarandet utförs, är avgörande för att fastställa om grupperna skiljer sig åt i parametern respektive. Som framgår i figur 6, figur 7, figur 8, figur 9 och figur 10, baslinjenivåer av MGS Poäng (p = 0.762, Kruskal-Wallis-Test), lyx beteenden som grävande (p = 0.896, Kruskal-Wallis-Test) och häckande (p = 0.723, Kruskal-Wallis-Test), matintag (p = 0.398, 1-vägs ANOVA), och buren aktivitet (p = 0.208, Kruskal-Wallis-Test) skilde sig inte signifikant mellan grupperna. Dessutom inga signifikanta skillnader i baslinjen FCM koncentrationer hittades (median, interquartile utbud inom parentes [ng/50 mg]: kontroll: 123.01 (82,70-193.46); enda anestesi: 118.31 (101.73-153.54), upprepade anestesi: 129.55 (92,58-139.48)) (p) = 0,904, Kruskal-Wallis-Test). Om skillnader i baslinjen uppstår, kan delta värden beräknas.
Mus grimas skala
När de genomsnittliga MGS-score jämförs, signifikant högre poäng kontra kontroll hittades efter den enda erfarenheten av anestesi (p = 0,001) och efter sist upprepad anestesi session (p = 0,021) orsakade på 30 min efter sista anestesi (figur 6A) . På 150 min efter sista anestesi, det fanns inte längre skillnader mellan grupperna (p = 0.910).
För att ta hänsyn till det faktum att baslinjen MGS noter inte är lika med 0 i alla fall, beräknades MGS skillnaden Poäng som beskrivs i protokollet. Både en enda erfarenhet av anestesi (p = 0,002) och upprepade anestesi (p = 0,008) ökade MGS skillnaden poängen kontra kontroll på 30 min efter anestesi. På 150 min efter den senaste anestesi, alla möss hade återvänt till kontrollnivåer (p = 0.617) (figur 6B)10.
Grävande beteende
Upprepade anestesi minskas avsevärt procentandelen av vikten av mat pellets möss bort från håla kontra kontroll (p = 0,036, Kruksal-Wallis-Test) (figur 7)10.
Boet byggnad beteende
Det fanns inga signifikanta skillnader i boet poängen mellan en enda erfarenhet av anestesi, upprepade anestesi och kontroll (p = 0,240, Kruksal-Wallis-Test) (figur 8)10.
Födointag
1 dag efter den sista anestesi, möss som hade genomgått upprepade anestesi visade betydligt minskat födointag jämfört med möss som hade upplevt enda anestesi (p = 0,047, 1-vägs ANOVA). Däremot en vecka senare, möss som hade fått upprepade anestesi förbrukas betydligt mer mat än kontroller (p = 0,012, 1-vägs ANOVA) eller möss som hade fått en enda anestesi (p = 0,001, 1-vägs ANOVA) (figur 9)10.
Buren aktivitet
1 dag efter den sista anestesi, buren aktivitet under den mörka perioden anges av arean under kurvan är aktivitet, avsevärt skilde sig inte bland möss som hade fått en enda anestesi, upprepade anestesi eller kontroll behandling (p = 0,498, Kruskal-Wallis-Test) (figur 10)10.
Gratis förberedande paradigm
Alla möss utforskade bur toppen, när testet genomfördes. Men 1 dag efter den sista anestesi, möss som hade fått upprepad anestesi (median, interquartile utbud inom parentes [s]: 78,00 (55,00-89,00)) utforskade buren upp betydligt senare i tid än gjorde kontroller (31,00 (18,25-42,75); p = 0,009, Kruskal-Wallis-Test) och möss som hade fått en enda anestesi (27,00 (21.00-45,50); p = 0,001, Kruskal-Wallis-Test), som tidigare publicerats10. Den parametrar sammanlagt utforskning (Fig. 11A) och antal upptäcktsfärder (Fig. 11B) är analoga med latens till första prospekteringsborrning. Upprepade anestesi avsevärt minskat antalet explorations kontra kontroll (p = 0.023, Kruskal-Wallis-Test) och den totala varaktigheten av utforskning (p = 0,032, Kruskal-Wallis-Test) kontra en enda anestesi på 1 dag efter den sista anestesi. 8 dagar efter den sista anestesi, alla parametrar, dvs latens till första utforskning (kontroll: 27,50 (13,50-47,25); enda anestesi: 18.00 (9,50-38,50); upprepade anestesi: 20.00 (12,50-42,00); p = 0.722, Kruskal-Wallis-Test), antal upptäcktsfärder (p = 0.057), och den totala varaktigheten av utforskning (p = 0.579), inte längre skilde sig mellan studiegrupperna (figur 11).
Fekal kortikosteron metaboliter
För att beakta utgångsvärden erhållits, procentuell förändring relativt baslinjen har beräknats och inga signifikanta skillnader mellan grupperna (p = 0,119, Kruskal-Wallis-Test) (figur 12)10.
Figur 1 : Tid linje protokoll. Grå och vit färgade fälten symboliserar mörker och ljus perioder av en dag, respektive. Beroende på förfarandet för kan detta protokoll anpassas. ”Tillvänjning till håla” innebär att möss behöver acklimatiserad till att använda plast vatten flaskan som en håla i deras hem bur, innan hålhäckande provningen kan utföras. B, utgångsvärde; FCM, fekal kortikosteron metaboliter. Denna siffra har ändrats från Hohlbaum et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Scoring sammanfattningsblad. Detta blad innehåller alla tester och kan fyllas i för varje enskild mus. Datum och tid bör läggas när provningen utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Skalor klass välbefinnande. De skalor varierar från ”välbefinnande unimpaired” (grön) till ”välbefinnande nedsatt” (röd) och express innebörden av resultaten på ett förenklat sätt. I detta skede av kunskap om indikatorer för välbefinnande, kan inte vi göra ett definitivt uttalande på grad av välbefinnande för varje test, bara ett allmänt uttalande. MGS, mus grimas skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Observation bur. Denna bur används för test av grävande beteende och att ta fotografier ska analyseras enligt mus grimas skala (MGS). Framsidan av buren är tydlig och, beroende på päls färgerna på möss, övriga tre väggarna bör vara färgad antingen svart eller vitt som kontrast till mössen. Golvet i rutan glas är täckt med ca 0,5 cm av sängkläder material inklusive använt strö material från buren. Vanlig mat och vatten finns. Om möjligt, bör vattenflaskor i stället för skålar användas, eftersom möss kan fylla skålar med strömedel. Efter en tillvänjning minst 30 min läggs håla. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : 24-h observationsperiod. Att bedöma bygger beteende, buren aktivitet och födointag boet och samla fecal prov att mäta fekal kortikosteron metaboliter (FCM), möss är inrymt individuellt för 24 h (bur typ III: 420 mm × 260 mm × 150 mm; strömedel cirka 0,5 cm djupt med begagnade strömedel från buren utspridda på toppen, en bomull nestlet, kranvatten och standard mat kost ad libitum). En infraröd sensor är monterad på toppen av buren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Mus grimas skala (MGS). Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Prickarna är avvikare med värden mellan 1,5-3,0 × IQR. Färgade asterisker är avvikare med värden större än 3,0 × IQR. (A) menar MGS poäng. (B) menar MGS skillnad poäng. p-värdena beräknades med Kruskal-Wallis-Test: * p < 0,05; ** p < 0,01. På grund av ett tekniskt fel (kamera, skala) hade fyra möss i gruppen enda anestesi skall uteslutas från statistiken. Denna siffra har ändrats från Hohlbaum et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : Grävande beteende. Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Färgade asterisker är avvikare med värden större än 3,0 × IQR. p-värdena beräknades med Kruskal-Wallis-Test: * p < 0,05. På grund av ett tekniskt fel (kamera, skala) hade fyra möss i gruppen enda anestesi skall uteslutas från den statistiska analysen. Denna siffra har ändrats från Hohlbaum et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8 : Bygger beteende boet. Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Prickarna är avvikare med värden mellan 1,5-3,0 × IQR. p-värdena beräknades med Kruskal-Wallis-Test; d, dagen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Födointag. Uppgifterna är medelvärde ± standardavvikelse. p-värdena beräknades med 1-vägs ANOVA (post-hoc-Tukey-HSD): * p < 0,05; ** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Hem bur aktivitet. Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Prickarna är avvikare med värden mellan 1,5-3,0 × IQR. p-värdena beräknades med Kruskal-Wallis-Test. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 11 : Gratis förberedande paradigm. Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Prickarna är avvikare med värden mellan 1,5-3,0 × IQR. Färgade asterisker är avvikare med värden större än 3,0 × IQR. (A) total varaktighet av utforskning. (B) antal upptäcktsfärder. p-värdena beräknades med Kruskal-Wallis-Test: * p < 0,05. Denna siffra har ändrats från Hohlbaum et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 12 : Fekal kortikosteron metaboliter (FCM). Rutan representerar interkvartilintervall (IQR), box kanter är den 25: e och 75: e kvartilen. Morrhåren representerar värden som är större än 1,5 × IQR. Färgade asterisker är avvikare med värden större än 3,0 × IQR. FCM nivåerna mättes 2 dagar före och 1 dag posta förfarande. Den procentuella förändringen [%] av FCM koncentrationer i förhållande till respektive utgångsvärde beräknades. Data analyserades med Kruskal-Wallis-Test. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet utvecklades ursprungligen för att bedöma välbefinnande C57BL/6JRj möss som fick antingen en enda anestesi eller upprepade isofluran anestesi. Resultaten bekräftar att tester av lyx beteenden, liksom andra åtgärder (t.ex. gratis förberedande paradigmen, MGS, hålhäckande födointag) var känsliga metoder för bedömning av välbefinnande. Upprepade isofluran anestesi orsakade kortsiktiga effekter på drag ångest-relaterade beteenden, MGS och hålhäckande beteende. Dessutom föreföll upprepade isofluran anestesi påverka mat intag10.
Gratis förberedande paradigm anges reducerad undersökande beteende och följaktligen högre drag ångest nivåer hos möss som upprepade gånger var sövda jämfört med möss sövda endast en gång, och kontrollerna. Men utforskade möss av alla grupper inrutade bur top10,20. När du undersöker ångest-relaterade beteenden, är det viktigt att skilja mellan drag och staten ångest21,22. Placera musen i en obekant miljö inducerar staten ångest. Däremot gratis förberedande paradigm tillåter djuren bo i deras hem burar och, således, undersöker drag ångest.
Minskningen av undersökande beteende bland möss efter upprepade anestesi inte kan förklaras av minskad motorisk aktivitet. Buren aktivitet under den mörka perioden skilde sig inte signifikant mellan studiegrupperna. Detta indikerar att möss hade redan fysiskt återhämtat sig från anestesi när gratis förberedande paradigm testet utfördes.
MGS utvecklades faktiskt för att bedöma smärta, men det finns bevis att ansiktsuttryck också ändras med stress och positiva känslor13,23. Fotografier av mus ansikten anges att både enstaka och upprepad isofluran anestesi ökat betyg på MGS över på kort sikt under perioden direkt efter narkos. Som MGS skillnaden poängen var under 1, tycktes stressnivån vara mild10. Resultaten håller med senaste observationer av Miller et al. 24 , 25 och visade att möss som återvände till styra nivå 150 min efter anestesi10.
Lyxiga beteenden som grävande och bygger beteende boet är artspecifika och kan tjäna som indikatorer för välbefinnande7 och god allmän hälsa i möss26. Möss visar endast lyx beteenden när alla deras grundläggande behov är uppfyllda. Om välbefinnande minskas, är lyx beteenden först att vara nedsatt5,7. Tidigare studier har visat att både grävande och bobygget kan försämras av smärta och ångest6,8, men det finns också bevis för att Hippocampus lesioner kan påverka dessa två beteenden15,27 , 28 , 29 , 30 , 31.
Lyxiga beteenden undersöktes under perioden tidigt efter narkos (grävande beteendet) och på morgonen följande dag (nest bygga beteende). Testet för grävande beteende utvecklat av Deacon et al. och antogs av Jirkof et al. ändrades när det gäller acklimatisering (gruppboende i stället för enskilda bostäder) och varaktighet av beteendemässiga mätning (endast 2 timmar istället för 24 h) 8 , 15 , 16.
Det är anmärkningsvärt att upprepade anestesi minskas hålhäckande beteende, vilket tyder på att det fanns en nedskrivning av välbefinnande omedelbart bokföra anestesi10, som rapporterades av Jirkof et al. 8. men på morgonen följande dag, när möss hade haft mer tid att återhämta sig från anestesi, hög och komplexa Bon de hade byggt anges att de upplever välbefinnande10. Dessa resultat skiljer sig från tidigare rapporter som gjorde Bon på en tidigare tid32. Därför kan det vara bra att anpassa protokollet och Poäng Bon tidigare i tid. Dock måste dygnsrytmen av bygger beteende boet fortfarande betraktas, som möss tenderar att förbereda sina bon i slutet av den mörka fas32.
Födointag minskade marginellt 1 dag efter upprepade anestesi var, men det en vecka senare. Eftersom möss inte förlora kroppsvikt (se Hohlbaum m.fl. 10) någon typ av ersättning mekanism kan ha inträffat och nedsatt välbefinnande när det gäller matintag bör klassificeras som mild10. Matintag ger inblick i postoperativ nöd, välbefinnande och aptit i möss, som kan vara nedsatt av postoperativt illamående26 och postoperativ stress27.
FCM visar tillförlitligt stress i möss33,34,35. Topp FCM koncentrationerna vanligtvis inträffar 8-10 h efter en stressfaktor men bero på intestinal transitering tiden18. Därför är det avgörande att också övervaka buren aktivitet, som ingår i detta protokoll. På grund av dygnsrytmen effekten på utsöndrade FCM18är det lämpligt att samla fecal prov under en period på 24 h. FCM koncentrationer reflekterade akut stress under perioden 24-h efter narkos. Som FCM varierar från individ till individ, beräknades den procentuella förändringen av FCM nivåer i förhållande till utgångsvärdet. FCM resultaten av undersökningen visade att varken en erfarenhet av anestesi eller upprepade anestesi ökat betydligt hypotalamus-hypofys-binjure (HPA)-axeln aktivitet10.
Sammantaget visade resultaten att upprepade isofluran anestesi orsakade kortsiktiga mild ångest och nedsatt välbefinnande i tidig postanesthetic tid något mer än gjorde en enda erfarenhet av isofluran anestesi10.
Ett protokoll för att bedöma välbefinnande bör inte införa ytterligare nöd på djuren. En begränsning av detta protokoll är att det innehåller enskilda bostäder under observationsperioden 24-h, som är känt för att öka plasma-kortikosteron nivåer36. Enskilda bostäder är dock nödvändigt att samla in giltiga data för enskilda personer med avseende på buren aktivitet, födointag, boet byggnad beteende och FCM nivåer. Varaktigheten av enskilda bostäder var minimeras genom att undersöka de fyra parametrarna samtidigt (dvs. under observationsperioden 24-h). För att förhindra resultaten från att vara påverkade av enskilda bostäder, kontroll möss genomgick samma tester och resultaten beaktades. Om det finns metoder för att mäta dessa parametrar i ett gruppboende miljö, bör de vara används (t.ex.en automatiserad hem-bur analyssystem för buren aktivitet37 och födointag). Automatiserad buren analyssystem kräver dock ytterligare utrustning, vilket inte kanske är tillgängliga. I studier med inriktning på grupper av djur istället för individer, buren aktivitet, födointag, häckar byggnad beteende, och FCM nivåer kan också utvärderas för en grupp av möss. Detsamma gäller gratis förberedande paradigm, som endast kräver mössen att märkas synligt så att de kan särskiljas. Om välbefinnande minskas i en grupp, alla möss i gruppen bör kontrolleras noggrant (med hjälp av poängark och klinisk undersökning) att identifiera musen eller möss berörda. Ytterligare observationer på gruppnivå behövs för att fastställa känsligheten för gruppvärden.
När det gäller förfining, kan detta protokoll anpassas och integreras i pågående studier för att bedöma effekterna av en viss procedur på wellen-being av möss. Beroende på den särskilda proceduren och studie designen, bör de mest lämpliga testerna från detta protokoll väljas. Här, föreföll den grävande och bygger boet test, MGS, gratis förberedande paradigm och mätning av födointag vara särskilt fördelaktigt. Eftersom beteendet hos möss följer dygnsrytmen38, är det lämpligt att utföra beteendemässiga tester på möss för alla grupper en definierad tidpunkt. Möss är mer aktiva på morgonen än på eftermiddagen38. Dock om studiedesign inte tillåter för att testa på morgonen, kan testet göras vid en annan tidpunkt. Det är också viktigt att säkerställa att varje enskild test utförs vid samma tidpunkter för alla grupper. Annars, effekterna av dygnsrytmen av parametrarna kan resultera i intra- eller tvärpolitiska skillnader. Kontroll möss bör dessutom ingå i studien, så att resultaten från behandlade möss och kontroll möss kan jämföras. Kontroll möss måste provas vid samma tidpunkt som behandlade möss. Om protokollet visar att välbefinnande är nedsatt, förfarandet bör vara raffinerat och protokollet upprepas. Detta tillvägagångssätt kan visa om ansträngningarna att förfina förfarandet var effektiva.
Detta protokoll kan fungera som ett allmänt stöd för att uppskatta graden av svårighetsgrad som orsakas av ett förfarande. Därför hjälper det för att klassificera svårighetsgraden av ett förfarande på vetenskapliga - och djur-centrerad nivå. Protokollet ger dock inte en skala för att klassificera ett förfarande som mild, måttlig eller svår. För att klassificera svårighetsgraden av ett förfarande, är det nödvändigt att hänvisa till exemplen i bilaga VIII i EU: S direktiv 2010/63.
Sammanfattningsvis stöder detta protokoll en systematisk utvärdering av välbefinnande i möss på ett vetenskapligt, djur-centrerad sätt efter förfaranden under vilken narkos används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Tack vare Sabine Jacobs bistå med provsamlingen, Edith Klobetz-Rassam för analys av FCM, PD Dr. med. vet. Hollander. Roswitha Merle bistå med statistisk analys och Wiebke Gentner för korrekturläsning manuskriptet. Studien är en del av den Berlin-Brandenburg forskningsplattformen BB3R (www.bb3r.de) och finansierades av den tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (bevilja nummer: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluran | CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH | 1214 | |
| InfraMot - Sensore Units | TSE Systems | 302015-SENS | |
| InfraMot - Control Units | TSE Systems | 302015-C/16 | |
| InfraMot - Software | TSE Systems | 302015-S | |
| Nestlet N | Ancare - Plexx | NES3600 | |
| Camera EOS 350D | Canon |
References
- 2010 EU. Directive 2010/63/EU. Official Journal of the European Union. , L276/33-L276/29 (2010).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , London: Methuen. (1959).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Bugnon, P., Heimann, M., Thallmair, M. What the literature tells us about score sheet design. Lab Anim. 50 (6), 414-417 (2016).
- Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiol Behav. 92 (3), 375-397 (2007).
- Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC Vet Res. 3, 16 (2007).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. J Neurosci Methods. 234, 139-146 (2014).
- Jirkof, P., et al. Burrowing behavior as an indicator of post-laparotomy pain in mice. Front Behav Neurosci. 4, 165 (2010).
- Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 45 (1), 1-13 (2011).
- Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in C57BL/6JRj mice-Assessing the degree of distress. PLoS ONE. 12 (6), e0179588 (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412 (2010).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 1 (3), 1117-1119 (2006).
- Deacon, R. M., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12 (9), 2053-2057 (2001).
- Deacon, R. M. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat Protoc. 1 (1), 118-121 (2006).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M. F., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Wien Tierarz Monats. 100 (9-10), 238-246 (2013).
- Touma, C., Palme, R., Sachser, N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Horm Behav. 45 (1), 10-22 (2004).
- Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol. 130 (3), 267-278 (2003).
- Bert, B., Schmidt, N., Voigt, J. P., Fink, H., Rex, A. Evaluation of cage leaving behaviour in rats as a free choice paradigm. J Pharmacol Toxicol Methods. 68 (2), 240-249 (2013).
- Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol Ther. 46 (3), 321-340 (1990).
- Belzung, C., Berton, F. Further pharmacological validation of the BALB/c neophobia in the free exploratory paradigm as an animal model of trait anxiety. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 541-548 (1997).
- Finlayson, K., Lampe, J. F., Hintze, S., Wurbel, H., Melotti, L. Facial indicators of positive emotions in rats. PLoS ONE. 11 (11), e0166446 (2016).
- Miller, A., Kitson, G., Skalkoyannis, B., Leach, M. The effect of isoflurane anaesthesia and buprenorphine on the mouse grimace scale and behaviour in CBA and DBA/2 mice. Appl Anim Behav Sci. 172, 58-62 (2015).
- Miller, A. L., Golledge, H. D., Leach, M. C. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS ONE. 11 (11), e0166652 (2016).
- Deacon, R. Assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice. J Vis Exp. (59), e2607 (2012).
- Felton, L. M., Cunningham, C., Rankine, E. L., Waters, S., Boche, D., Perry, V. H. MCP-1 and murine prion disease: separation of early behavioural dysfunction from overt clinical disease. Neurobiol Dis. 20 (2), 283-295 (2005).
- Deacon, R. M., Croucher, A., Rawlins, J. N. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behav Brain Res. 132 (2), 203-213 (2002).
- Filali, M., Lalonde, R., Rivest, S. Subchronic memantine administration on spatial learning, exploratory activity, and nest-building in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Neuropharmacology. 60 (6), 930-936 (2011).
- Guenther, K., Deacon, R. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur J Neurosci. 14 (2), 401-409 (2001).
- Deacon, R. M., Reisel, D., Perry, V. H., Nicholas, J., Rawlins, P. Hippocampal scrapie infection impairs operant DRL performance in mice. Behav Brain Res. 157 (1), 99-105 (2005).
- Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
- Atanasov, N. A., Sargent, J. L., Parmigiani, J. P., Palme, R., Diggs, H. E. Characterization of train-induced vibration and its effect on fecal corticosterone metabolites in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 737-744 (2015).
- Voigt, C. C., et al. Hormonal stress response of laboratory mice to conventional and minimally invasive bleeding techniques. Anim Welf. 22 (4), 449-455 (2013).
- Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
- Miyashita, T., et al. Social stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine. Biochem Biophys Res Commun. 349 (2), 775-780 (2006).
- Bains, R. S., et al. Analysis of individual mouse activity in group housed animals of different inbred strains using a novel automated home cage analysis system. Front Behav Neurosci. 10 (106), (2016).
- Saibaba, P., Sales, G. D., Stodulski, G., Hau, J. Behaviour of rats in their home cages: daytime variations and effects of routine husbandry procedures analysed by time sampling techniques. Lab Anim. 30 (1), 13-21 (1996).
