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Behavior

सामान्य संज्ञाहरण का उपयोग प्रक्रियाओं के लिए चूहों में अच्छी तरह से किया जा रहा का व्यवस्थित मूल्यांकन

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57046
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2, 4, 2, 1
1Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 2Institute of Pharmacology and Toxicology, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 4Unit of Physiology, Pathophysiology and Experimental Endocrinology, Department of Biomedical Sciences, University of Veterinary Medicine

Summary

हम सामान्य संज्ञाहरण का उपयोग प्रक्रियाओं के दौरान चूहों में अच्छी तरह से किया जा रहा आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की. व्यवहार मानकों अच्छी तरह से किया जा रहा है के रूप में अच्छी तरह के रूप में glucocorticoid चयापचयों का स्तर का संकेत की एक श्रृंखला का विश्लेषण किया गया । प्रोटोकॉल एक सामांय सहायता के रूप में एक वैज्ञानिक, पशु केंद्रित तरीके में गंभीरता की डिग्री का अनुमान के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Abstract

रसेल और Burch द्वारा विकसित 3R सिद्धांत (प्रतिस्थापन, कमी, शोधन) के साथ ध्यान में रखते हुए, वैज्ञानिक अनुसंधान जब भी संभव पशु प्रयोग करने के लिए विकल्प का उपयोग करना चाहिए । जब पशु प्रयोग करने के लिए कोई विकल्प नहीं है, प्रयोगशाला इस्तेमाल किया जानवरों की कुल संख्या ंयूनतम मूल्यवान डेटा प्राप्त करने की आवश्यकता होनी चाहिए । इसके अलावा, उचित शोधन उपायों के लिए दर्द को कम करने के लिए लागू किया जाना चाहिए, दुख, और संकट प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ । दर्द, पीड़ा, और संकट की डिग्री को वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल श्रेणियों गैर वसूली, हल्के, उदारवादी, या गंभीर है (यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63) । जो श्रेणियां व्यक्तिगत मामलों में लागू निर्धारित करने के लिए, यह वैज्ञानिक रूप से ध्वनि उपकरणों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यहां प्रस्तुत अच्छी तरह से किया जा रहा मूल्यांकन प्रोटोकॉल सामान्य संज्ञाहरण प्रयोग किया जाता है, जिसके दौरान प्रक्रियाओं के लिए बनाया गया है । प्रोटोकॉल घर पिंजरे गतिविधि पर केंद्रित है, माउस मुंह बनाना पैमाने पर, और इस तरह के संकेतकों के रूप में burrowing और घोंसला निर्माण व्यवहार के रूप में लक्जरी व्यवहार अच्छी तरह से किया जा रहा है । यह भी विशेषता चिंता से संबंधित व्यवहार के लिए मुफ्त खोजपूर्ण प्रतिमान का उपयोग करता है । तीव्र तनाव के संकेतक के रूप में मल corticosterone चयापचयों 24-h पद संवेदनाहारी अवधि से अधिक मापा जाता है ।

प्रोटोकॉल सामांय संज्ञाहरण निंनलिखित चूहों की भलाई पर वैज्ञानिक रूप से ठोस जानकारी प्रदान करता है । अपनी सादगी के कारण, प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलित और एक योजनाबद्ध अध्ययन में एकीकृत किया जा सकता है । हालांकि यह एक पैमाने पर यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 के अनुसार श्रेणियों में संकट को वर्गीकृत करने के लिए प्रदान नहीं करता है, यह मदद कर सकते है शोधकर्ताओं वैज्ञानिक ध्वनि डेटा का उपयोग कर एक प्रक्रिया की गंभीरता की डिग्री का अनुमान । यह एक वैज्ञानिक, पशु केंद्रित तरीके से अच्छी तरह से किया जा रहा है के आकलन में सुधार करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है ।

Introduction

यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/631 पढ़ाए कि 3R सिद्धांत (प्रतिस्थापन, कमी, शोधन) रसेल और Burch द्वारा विकसित2 लागू किया जा करने के लिए जब भी पशु प्रयोग आवश्यक है । यूरोपीय संघ के निर्देश के अंतिम लक्ष्य के बाहर सभी पशु परीक्षण चरण है, लेकिन निर्देश स्वीकार करते है कि, कुछ समय के लिए, कुछ पशु प्रयोगों अभी भी अनुसंधान कि मानव और पशु स्वास्थ्य की रक्षा करेगा आचरण की जरूरत है । इस प्रकार, अगर एक जानवर प्रयोग किसी भी वैकल्पिक पद्धति से प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है, केवल प्रयोगशाला पशुओं की ंयूनतम संख्या के लिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । इसके अलावा, दर्द की मात्रा, दुख, और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के साथ संकट उचित शोधन उपायों का उपयोग कम से कम किया जाना चाहिए । यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 निर्धारित है कि एक प्रक्रिया की गंभीरता को भावी गैर के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए, वसूली, हल्के, मध्यम, या1गंभीर । गंभीरता वर्गीकरण के रूप में एक मामला दर मामला आधार पर फैसला किया है, यह वैज्ञानिक रूप से ध्वनि उपकरण के लिए एक दिया प्रक्रिया की गंभीरता का अनुमान है महत्वपूर्ण है ।

Morton और ग्रिफ़िथ द्वारा प्रस्तावित के रूप में स्कोर चादरें3 , अच्छी तरह से किया जा रहा पर नकारात्मक प्रभाव सहित सामान्य स्थिति से किसी भी विचलन का पता लगाने में एक अनिवार्य उपकरण हैं4. स्कोर शीट को पूर्वव्यापी रूप से दर्द, पीड़ा, और एक प्रयोग की वजह से और कष्ट निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है (जैसे, शरीर के वजन, फर, चाल) व्यक्ति जानवर की शारीरिक स्थिति में दिखाई परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित । हालांकि, यूरोपीय संघ के डायरेक्टर 2010/63 के अनुलग्नक आठवीं प्रत्येक गंभीरता श्रेणी के उदाहरण प्रदान करता है, शोधकर्ताओं ने अभी भी उपकरणों की कमी के लिए वैज्ञानिक आधारित डेटा का उपयोग कर दिया प्रक्रिया की गंभीरता की डिग्री का अनुमान है ।

अच्छी तरह से किया जा रहा नकारात्मक दिखा संकेतकों के अभाव पशु की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक ही रास्ता नहीं है; सकारात्मक भलाई की ओर इशारा करते हुए संकेतकों की उपस्थिति भी महत्वपूर्ण है5,6,7,8। उदाहरण के लिए, पशु burrowing और घोंसले के निर्माण व्यवहार की तरह लक्जरी व्यवहार प्रदर्शित केवल जब उनके सभी आवश्यक जरूरतों को पूरा कर रहे हैं । यदि अच्छी तरह से कम किया जा रहा है, लक्जरी व्यवहार पहले5,7गिरावट है । प्रोटोकॉल अच्छी तरह से आकलन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक विस्तृत और व्यापक तरीके से9में उनकी भलाई का मूल्यांकन करने के क्रम में भौतिक, शारीरिक/जैव रासायनिक, और पशुओं के मनोवैज्ञानिक राज्यों की ओर इशारा करते हुए संकेतक शामिल करना चाहिए ।

शोधन के संदर्भ के भीतर, एक प्रोटोकॉल इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए और एक अच्छी तरह से चूहों की जा रही पर सामान्य संज्ञाहरण को शामिल प्रक्रिया के प्रभाव का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था10. एक ही समय में, लक्ष्य के लिए किसी भी प्रयोग में प्रोटोकॉल के आसान एकीकरण सक्षम करने के लिए कोई अतिरिक्त तनाव को कम करने के लिए किया गया था । प्रोटोकॉल burrowing व्यवहार पर विचार, इस तरह के गतिविधि के रूप में घर पिंजरे व्यवहार, भोजन का सेवन, और घोंसले के समान, और चिंता से संबंधित व्यवहार लक्षण । इसके अलावा, यह माउस मुंह बनाना स्केल (MGS), और मल में corticosterone चयापचयों के गैर इनवेसिव विश्लेषण भी शामिल है । प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से एक वैज्ञानिक और पशु केंद्रित तरीके से और अच्छी तरह से किया जा रहा है कि गंभीरता की डिग्री के वर्गीकरण का समर्थन करता है पर जानकारी प्रदान करने के आकलन की सुविधा के लिए बनाया गया है । स्कोर शीट के अलावा, यह एक प्रक्रिया की गंभीरता वर्गीकरण के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं । के रूप में प्रोटोकॉल को बाहर ले जाने के लिए आसान है और व्यापक उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, यह एक अध्ययन के परिणामों को प्रभावित किए बिना एक चल रहे प्रयोग में एकीकृत किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पशु अनुसंधान: Vivo प्रयोगों में की रिपोर्टिंग (आने) दिशानिर्देश11 सभी पशु प्रयोगों को शामिल अध्ययन, डिजाइन, विश्लेषण, और रिपोर्टिंग में सुधार के लक्ष्य के साथ में मनाया जा रहा है ।

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Protocol

यह अध्ययन जर्मन पशु कल्याण अधिनियम द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और बर्लिन राज्य प्राधिकरण द्वारा अनुमोदित किया गया था ("Landesamt फर Gesundheit und Soziales", परमिट संख्या: G0053 15/

नोट: इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य glucocorticoid चयापचयों पर दोहराया संज्ञाहरण के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था । उपयोग किए जाने वाले पशुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक नमूना आकार परिकलन किया गया: n ≥ 2 × (s/µ1-µ2)2 × (zα + zβ)2. µ1-µ2 जनसंख्या का अर्थ है जिस पर शक्ति और नमूना आकार गणना कर रहे है के बीच अंतर है (α = 5%, β = 80%); zα = १.९६ और zβ = ०.८४ मानक सामान्य वितरण के quantiles हैं । आरेख 1 इस प्रोटोकॉल की समय रेखा दिखाता है । यदि प्रोटोकॉल का एक पैरामीटर नियंत्रण के स्तर के साथ एक अंतर दिखाता है, पशु बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए, और एक उपयुक्त अवधि के बाद पैरामीटर फिर से मापा जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि विशेषता चिंता से संबंधित व्यवहार बढ़ जाती है, इस व्यवहार का परीक्षण किया जाना चाहिए फिर से एक सप्ताह के बाद, में मदद करने के लिए अवधि का निर्धारण जब तक पूर्ण वसूली । समय अंक और इस प्रोटोकॉल में परिभाषित अवधि अंय प्रक्रियाओं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । समय बिंदुओं को परिवर्तित करने पर, आदी होना पीरियड प्रोटोकॉल में बताए अनुसार रखना चाहिए । आदेश में चूहों के व्यवहार को प्रभावित हो सकता है कि कारकों को कम करने के लिए, अधिक हेरफेर की आवश्यकता परीक्षण परीक्षण के बाद आयोजित किया जाना चाहिए कि चूहों के सामान्य व्यवहार को परेशान नहीं करते. आरेख 2 सारांश स्कोरिंग पत्रक का उपयोग करके प्रोटोकॉल के सभी परीक्षणों को सारांशित करता है । चित्रा 3 अच्छी तरह से किया जा रहा है, जो कैसे परीक्षण के परिणाम की व्याख्या करने के लिए एक सिंहावलोकन देने के ग्रेड के सरलीकृत तराजू प्रदान करता है ।

1. प्रयोगकर्ता द्वारा हैंडलिंग के लिए चूहों Habituating

  1. चूहों को पशुओं की सुविधा के लिए habituate करने के लिए अनुमति दें के बाद वे किसी अन्य सुविधा या विक्रेता से प्राप्त किया गया है कम से 2 सप्ताह.
  2. समूहों में घर चूहों और मानक शर्तों के तहत उन्हें बनाए रखने (कमरे के तापमान 22 ± 2 ° c; सापेक्ष आर्द्रता 55 ± 10%) एक प्रकाश पर: डार्क साइकिल 12:12 h.
  3. मानक संवर्धन के रूप में एक सुरंग और कपास nestlets के साथ सभी समूहों प्रदान करते हैं, और भोजन और पानी विज्ञापन libitumप्रदान करते हैं ।
  4. सुरंग और/या कप से निपटने के लिए सभी चूहों Habituate कम से एक सप्ताह के पहले परीक्षण के लिए12।
    नोट: पूंछ द्वारा चूहों उठा तनाव या चिंता है, जो बारी में अच्छी तरह से प्रभावित करता है और यह भी12प्रोटोकॉल के परिणामों पर एक प्रभाव है प्रेरित कर सकते हैं ।

2. व्यवहार परीक्षण कक्ष और उपकरण तैयार करना

नोट: परीक्षण के लिए एक अलग कमरे प्रदान करते हैं, आदर्श कमरे के पास जहां जानवरों रखा जाता है । अपने घर पिंजरों में चूहों के परीक्षण के कमरे के लिए प्रक्रिया आयोजित की जाती है से पहले कम से कम 60 मिनट के लिए परिवहन । यदि संभव हो, इस प्रोटोकॉल के सभी परीक्षण एक ही परीक्षण कक्ष में आचरण जहां प्रक्रिया से बाहर किया जाता है ।

  1. burrowing व्यवहार8 परीक्षण और MGS13 (चित्रा 4) में उपयोग के लिए तस्वीरें लेने के लिए एक अवलोकन पिंजरे तैयार करें ।
    1. लगभग 220 mm × 290 mm और 390 mm की ऊंचाई के एक मंजिल क्षेत्र के साथ एक गिलास बॉक्स का उपयोग करें ।
    2. कवर बिस्तर सामग्री के लगभग 0.5 सेमी के साथ इस बॉक्स के फर्श ।
    3. बिखराव नए बिस्तर सामग्री के शीर्ष पर घर पिंजरे से बिस्तर सामग्री का इस्तेमाल किया एक मुट्ठी भर नए वातावरण की वजह से संकट को कम करने के लिए ।
    4. भोजन प्रदान करते हैं, एक ही तरह है कि आम तौर पर आहार के रूप में आपूर्ति की है, और पानी ।
      नोट: यदि संभव हो तो, पानी की बोतलों का उपयोग करें, क्योंकि चूहे बिस्तर सामग्री के साथ पानी कटोरे भर सकता है ।
  2. एक पिंजरे (प्रकार III: 420 मिमी × 260 मिमी × 150 मिमी) 24-h अवलोकन अवधि के लिए तैयार है, जिसके लिए चूहों को व्यक्तिगत रूप से घर कर रहे हैं (चित्रा 5).
    नोट: व्यक्तिगत आवास की अवधि को कम करने के लिए, इस अवधि के दौरान घोंसला निर्माण व्यवहार, घर पिंजरे गतिविधि, भोजन का सेवन, और मल corticosterone चयापचयों () के लिए डेटा इकट्ठा ।
    1. पिंजरे में नए बिस्तर सामग्री प्लेस (लगभग 0.5 सेमी गहरी) और तितर बितर घर पिंजरे से मल के बिना इस्तेमाल किया सामग्री के एक मुट्ठी भर नई सामग्री के ऊपर, ताकि संकट को कम करने के लिए ।
    2. एक निर्धारित वजन के एक मानकीकृत वर्ग कपास nestlet प्रदान करें, पर्यावरण संवर्धन के रूप में ही ( सामग्री की तालिकादेखें)14।
      नोट: वाणिज्यिक nestlets वजन में अलग हो सकता है । इसलिए, हम Deacon द्वारा वर्णित nestlet के वजन को संशोधित और 2.7 जी14के बजाय 2.0 जी इस्तेमाल किया ।
    3. पिंजरे के शीर्ष पर अवरक्त संवेदक माउंट, जब एक अवरक्त सेंसर का उपयोग करने के लिए घर पिंजरे गतिविधि को मापने ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    4. भोजन प्रदान करते हैं, एक ही तरह है कि आम तौर पर आहार के रूप में आपूर्ति की है, और पानी विज्ञापन libitum।

3. माउस मुंह बनाना स्केल

नोट: MGS के लिए फोटो तीन समय अंक में अवलोकन पिंजरे में ले रहे हैं: (i) 2 दिन प्रक्रिया के लिए पहले आधारभूत MGS स्तर रिकॉर्ड करने के लिए, (ii) 30 प्रक्रिया के बाद मिनट, और (iii) 150 मिनट की प्रक्रिया के बाद । जब अच्छी तरह से किया जा रहा ख़राब है, MGS वृद्धि पर स्कोर । यदि वृद्धि हुई MGS स्कोर 150 मिनट के बाद भी मनाया जाता है, एक बाद में मंच पर अतिरिक्त तस्वीरें ले लो ।

  1. फोटोग्राफी के लिए एक उच्च परिभाषा कैमरे का उपयोग करें ।
  2. धीरे प्रेक्षण पिंजरे में माउस हस्तांतरण और माउस को अनुमति देने के लिए नए वातावरण के लिए कम से habituate 30 मिनट ।
  3. लगातार 1-2 मिनट के भीतर हर बार बिंदु के लिए के बारे में 30-40 तस्वीरें ले लो ।
  4. तेज ललाट या पार्श्व तस्वीरों का चयन और धुंधली तस्वीरें या तस्वीरें कि दिखाने के माउस को छोड़ कर सभी तस्वीरें क्रमबद्ध या पार्श्व दृश्य से अंय दृष्टिकोण से चेहरे ।
  5. बेतरतीब ढंग से प्रत्येक समय बिंदु से एक तस्वीर का चयन करें, (यानी 2 दिन प्रक्रिया से पहले, प्रक्रिया के बाद 30 मिनट, और 150 मिनट प्रक्रिया के बाद) प्रत्येक माउस के लिए ।
  6. तस्वीरों की फसल केवल माउस के सिर प्रदर्शित करने के लिए इतना है कि शरीर की स्थिति13दिखाई नहीं है ।
  7. प्रत्येक तस्वीर के लिए एक पत्रक के साथ एक स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाएं और प्रत्येक पत्रक के लिए MGS के पांच चेहरे की कार्रवाई इकाइयों सहित एक मेज जोड़ें ।
    नोट: फ़ाइल में आधारभूत फ़ोटोग्राफ़्स के साथ ही फ़ोटोग्राफ़ पोस्ट प्रक्रिया है ।
  8. शीट के आदेश यादृच्छिक ।
  9. तीन स्वतंत्र व्यक्तियों, जो पहले लैंगफोर्ड एट अल द्वारा विकसित MGS का उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था एक कंप्यूटर स्क्रीन पर फ़ाइल प्रस्तुत करते हैं. और उन्हें एक 3 सूत्री पैमाने का उपयोग कर चेहरे कार्रवाई इकाइयों स्कोर है (0 = मौजूद नहीं है, 1 = मामूली वर्तमान, 2 = जाहिर है उपस्थित) ।
    नोट: स्कोरिंग निम्नलिखित मानकों पर आधारित है13: कक्षीय कस ("कक्षीय क्षेत्र के संकुचन, एक कसकर बंद पलक या एक आँख निचोड़ के साथ"); नाक उभार ("नाक के पुल पर दिखाई त्वचा के गोल विस्तार"); गाल उभार ("गाल मांसपेशी की उत्तल उपस्थिति"); कान की स्थिति (कान "अलग खींच लिया और वापस अपनी आधारभूत स्थिति या ऊर्ध्वाधर लकीरें विशेषता है कि कान के सुझावों के कारण फार्म वापस खींचा जा रहा है"); मूंछ बदलें ("मूंछों की अपनी आधारभूत स्थिति से आंदोलन या तो पिछड़े, चेहरे या आगे के खिलाफ, के रूप में अगर अंत पर खड़े; मूंछें भी एक साथ झुरमुट हो सकता है ") ।
  10. विश्लेषण स्कोर, के रूप में निम्नानुसार (लैंगफोर्ड एट अल से अनुकूलित. 13).
    1. औसत सभी चेहरे की कार्रवाई इकाइयों प्रत्येक तस्वीर के लिए MGS स्कोर उत्पंन करने के लिए ।
      नोट: अगर एक चेहरे की कार्रवाई इकाइयों के रन नहीं किया जा सकता है, औसत शेष चेहरे की कार्रवाई इकाइयों ।
    2. प्रत्येक माउस के लिए एक MGS अंतर स्कोर प्राप्त करने के लिए फोटोग्राफ पोस्ट प्रक्रिया के लिए मतलब से आधारभूत तस्वीरों के लिए मतलब घटाना ।
    3. (संबंधित नमूनों के लिए nonparametric परीक्षण) व्यक्तियों के बीच MGS अंतर स्कोर में अंतर के लिए परीक्षण ।
      नोट: यदि कोई महत्वपूर्ण अंतर है (p < 0.05), तो निर्धारित करें कि क्या सभी फ़ोटोग्राफ़्स का स्कोर या कुछ फ़ोटोग्राफ़्स के केवल स्कोर व्यक्तियों के बीच अलग होते हैं. अगर बाद सच है, दोहराने इन तस्वीरों के स्कोरिंग । अंयथा, व्यक्तियों MGS प्रशिक्षण दोहराना चाहिए और फिर तस्वीरें स्कोर फिर से ।
    4. औसत MGS अंतर स्कोर प्रत्येक माउस के लिए अलग स्कोरर से प्राप्त की, यदि सभी व्यक्तियों के परिणाम काफी अलग नहीं है ।
    5. MGS अंतर अध्ययन समूहों के बीच औसत स्कोर की तुलना करने के लिए एक nonparametric सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करें ।

4. Burrowing यवहार8,15,16

  1. 140 ± 2 जी खाद्य छर्रों आम तौर पर एक मानक अपारदर्शी प्लास्टिक पानी की बोतल में आहार के रूप में आपूर्ति (250 मिलीलीटर, 150 मिमी लंबाई, 55 मिमी व्यास, 45 मिमी व्यास बोतल गर्दन)8रखकर बिल तैयार ।
    नोट: के रूप में चूहों व्यापक ट्यूबों पसंद करते हैं, 68 मिमी के व्यास के साथ बिल Deacon16द्वारा वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. घर पिंजरे में भोजन छर्रों से भरा चिपमंक जगह 5 दिन acclimatization के लिए प्रक्रिया से पहले ।
    नोट: पिंजरे में नियमित रूप से भोजन औषधालय इकाई खाली नहीं किया जाना चाहिए लेकिन यह भी भोजन छर्रों से भरा रहना चाहिए, के रूप में चूहों इस करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  3. परीक्षण को दो बार ले, प्रक्रिया से पहले 2 दिन (आधार रेखा); पिछले 30 मिनट के बाद प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से बाहर ले ।
    1. माउस habituate अवलोकन पिंजरे जहां MGS के लिए तस्वीरें ले जाया गया करने के लिए ंयूनतम 30 मिनट के लिए करते हैं ।
    2. प्लास्टिक के पानी की बोतल को निरीक्षण पिंजरे के पीछे की दीवार के समानांतर खाद्य छर्रों से भरा रखें ।
    3. गरिष्ठ भोजन छर्रों (छ) के बाद चिपमंक में शेष 2 ज.
  4. प्रारंभिक वजन के सापेक्ष चूहों द्वारा चिपमंक से निकाले गए भोजन छर्रों के वजन की गणना (%).

5.24-एच अवलोकन अवधि

नोट: चूहों व्यक्तिगत रूप से, 2.2 में वर्णित के रूप में स्थित हैं । (चित्रा 5), 24 ज की अवधि के लिए, के लिए भोजन का सेवन, घर पिंजरे गतिविधि, घोंसला निर्माण व्यवहार, और गृह व्यवस्था के स्तर को मापने के लिए । 24-एच अवलोकन दो बार जगह लेता है: (i) 2 दिन आधारभूत स्तर के लिए प्रक्रिया से पहले, (द्वितीय) प्रक्रिया के दिन पर ।

  1. भोजन का सेवन
    1. नियमित अंतराल पर चूहों वजन (संज्ञाहरण से पहले तुरंत संज्ञाहरण के बाद 2 दिन, बेहोशी से पहले 2 दिन, संज्ञाहरण और संज्ञाहरण के बाद साप्ताहिक), आदेश में शरीर के वजन में किसी भी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए (स्कोर शीट का हिस्सा) ।
      नोट: शरीर के वजन के प्रति ग्राम के अनुसार भोजन के सेवन की गणना करने के लिए आवश्यक है । 24 एच अवलोकन अवधि के दौरान पानी का सेवन भी मापा जा सकता है । यदि भोजन का सेवन कम हो जाए तो अच्छी तरह से बिगड़ सकता है ।
    2. पिंजरे की खाद्य इकाई (लगभग 100 ग्राम) में प्रदत्त मानक खाद्य आहार (ग्राम) का आरंभिक भार निर्धारित करें ।
    3. 24 एच अवलोकन अवधि के अंत में मानक खाद्य आहार का वजन निर्धारित करें ।
    4. खाद्य इकाई के नीचे पिंजरे की ओर ध्यान से खाद्य छलकने के लिए स्कैन करें और खाद्य इकाई में शेष भोजन छर्रों के वजन के लिए पाया गया कोई अतिरिक्त भोजन छर्रों जोड़ें ।
    5. इकाई शरीर के वजन के अनुसार भोजन के सेवन की गणना ।
  2. घर पिंजरे गतिविधि
    नोट: निंनलिखित निर्देश एक अवरक्त संवेदक के उपयोग को देखें ( सामग्री की तालिकादेखें), लेकिन घर पिंजरे गतिविधि भी वैकल्पिक कार्यक्रमों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । नियंत्रण के स्तर से घर पिंजरे गतिविधि का विचलन (जैसे hypoactivity, सक्रियता) बिगड़ा हुआ अच्छी तरह से किया जा रहा का एक संकेत हो सकता है ।
    1. प्रोग्राम प्रारंभ करें ।
    2. 1 मिनट और 24 घंटे के अधिग्रहण के समय के एक नमूना अंतराल चुनें, आवेगों 24 एच के लिए हर मिनट दर्ज कर रहे हैं जिसका अर्थ है कि.
      नोट: अगर प्रयोगकर्ता कई बार रिकॉर्डिंग शुरू करने के बाद कमरे में प्रवेश करता है, तो केवल पीरियड्स से डेटा का उपयोग करें, जब चूहों को परेशान न किया गया हो (यानी डार्क पीरियड के दौरान).
    3. 10-ंयूनतम अंतराल के आवेगों का योग ।
    4. समय वक्र के तहत क्षेत्र की गणना (आवेगों × मिनट).
  3. नेस्ट बिल्डिंग व्यवहार
    नोट: जटिल और उच्च घोंसले अच्छी तरह से किया जा रहा है की एक संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
    1. एक वर्ग कपास nestlet प्लेस ( सामग्री की मेज) एक परिभाषित वजन के साथ (देखें) पिंजरे के बीच में 2.0 जीउदा ।
    2. एक 5 अंक के पैमाने पर घोंसला स्कोर (नीचे देखें) के अनुसार Deacon14 निंनलिखित सुबह, लगभग 2 घंटे के बाद प्रकाश में बदल जाता है । किसी भी फटे nestlet टुकड़े कि प्रारंभिक nestlet वजन के कम से 5% है तौलना । घोंसले के रूप में स्कोर14 निंनानुसार
      1. अगर 90% nestlet बरकरार है तो "1" का स्कोर असाइन करें ।
      2. "2" का स्कोर असाइन करें यदि यह 50-90% बरकरार है ।
      3. nestlet के 50-90% कटा हुआ है, तो स्कोर "3" असाइन करें ।
      4. स्कोर "4" असाइन करें यदि अधिक से अधिक 90% कटा हुआ है, लेकिन घोंसला फ्लैट है, और इसकी परिधि के 50% से कम माउस शरीर की ऊंचाई से अधिक है जब कर्ल करवाने ।
      5. "5" स्कोर असाइन करें यदि अधिक से अधिक 90% nestlet कटा हुआ है और घोंसला उच्च है, और इसकी परिधि के 50% से अधिक एक कर्ल करवाने माउस के शरीर की ऊंचाई से अधिक है ।
  4. मल Corticosterone चयापचयों
    नोट: नियंत्रण स्तर से ऊपर के postanesthetic का बढ़ता 24-एच की अवधि में तीव्र तनाव के स्तर को प्रतिबिंबित करता है ।
    1. 24-h अवलोकन अवधि के अंत में संदंश का उपयोग करके पिंजरे से सभी सूखी मल छर्रों ले लीजिए और गीला छर्रों मूत्र के साथ दूषित को खत्म ।
    2. पाम एट अल के अनुसार बाहर निकालें 17, निम्नानुसार ।
      1. 60-70 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर सूखी मल के नमूने ।
      2. Homogenize एक मोर्टार का उपयोग कर मल नमूने ।
      3. एक बहु भंवर पर 30 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक ट्यूब में 80% मेथनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ 0.05 जी के एक aliquot शेक ।
      4. 15 मिनट के लिए 2500 x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
      5. पिपेट एक और केंद्रापसारक ट्यूब में supernatant के 0.5 मिलीलीटर ।
      6. -18 डिग्री सेल्सियस के एक ंयूनतम पर मल नमूनों (और अर्क) की दुकान ।
      7. विश्लेषण एक 5 α-pregnane-2 बी, 11b, 21-triol-20-एक एंजाइम immunoassay (ईआईए) 18, 19 या एक अंय पूरी तरह से मांय ईआईए का उपयोग कर ।
    3. आधार-रेखा के लिए संबंधित है के लिए है ।

6. नि: शुल्क खोजपूर्ण प्रतिमान

  1. घर पिंजरे रैक से बाहर ले लो और यह 24 एच अवलोकन अवधि के अंत में एक मेज की सतह पर जगह है ।
  2. पिंजरे में 45 डिग्री के एक कोण पर पिंजरे में एक gridded पिंजरे शीर्ष (भोजन या पानी की बोतल के बिना) प्लेस ।
    नोट: घोंसला है, जो माउस के लिए एक छिपने की जगह के रूप में कार्य करता है नष्ट नहीं है, लेकिन पिंजरे के ऊपर तिरछे घोंसला ऊपर जगह ।
  3. मॉनिटर या वीडियो-लगभग 1.5 मीटर की दूरी से 10 मिनट के लिए चूहों रिकॉर्ड.
    1. टाइमर प्रारंभ करें ।
    2. सभी बार ध्यान दें जब माउस पिंजरे के शीर्ष पर चढ़ाई (पिंजरे के ऊपर सभी चार पंजे के साथ) या पिंजरे के शीर्ष (पिंजरे फर्श पर एक या एक से अधिक पंजे के साथ) पत्ते ।
      नोट: कुछ चूहों पिंजरे के ऊपर चढ़ाई और यह क्रम में पिंजरे के किनारे के साथ चलने के लिए छोड़ सकते हैं । कुछ चूहे पिंजरे के ऊपर भी पीछे । इन मामलों की मानें तो जैसे चूहे अभी भी पिंजरे के ऊपर ही थे.
  4. बर्ट एट अल निंनलिखित मापदंडों का मूल्यांकन करें । 20.
    1. पहले अन्वेषण के लिए विलंबता का विश्लेषण (सेकंड में).
    2. अन्वेषणों की संख्या का विश्लेषण करें ।
    3. अन्वेषण की कुल अवधि (सेकंड) का विश्लेषण करें ।
      नोट: पहले अन्वेषण के लिए एक उच्च विलंबता, अन्वेषणों की एक कम संख्या है, और अन्वेषण की एक कम कुल अवधि उच्च लक्षण चिंता का स्तर का संकेत कर सकते हैं.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल मूलतः isoflurane संज्ञाहरण के एक एकल अनुभव (१ ४५-ंयूनतम संज्ञाहरण सत्र, n = 13 महिलाओं) या दोहराया isoflurane संज्ञाहरण के बाद अच्छी तरह से C57BL/6JRj चूहों की जा रही का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था (६ ४५-3-4 दिनों के साथ ंयूनतम संज्ञाहरण सत्र संज्ञाहरण सत्र के बीच, n = 13 महिलाओं) नियंत्रण चूहों की भलाई के साथ तुलना में (n = 6 महिलाओं)10, जो कोई संज्ञाहरण प्राप्त किया लेकिन एक ही उपाय के अनुसार परीक्षण किया गया । हम अनुपचारित नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में C57BL/6JRj चूहों की भलाई पर isoflurane संज्ञाहरण और दोहराया isoflurane संज्ञाहरण के एक एकल अनुभव के प्रभाव का आकलन किया । यहां, महिला C57BL/6JRj चूहों के प्रतिनिधि परिणाम, कुछ पहले Hohlbaum एट अल में प्रकाशित डेटा सहित. 10, और साथ ही पहले अप्रकाशित परिणाम दिखाए जाते हैं ।

सांख्यिकीय विश्लेषण

Explorative डेटा विश्लेषण और सामान्यता के लिए परीक्षण प्रत्येक पैरामीटर के लिए प्रदर्शन किया गया. अध्ययन समूहों के बीच अंतर (यानी नियंत्रण, एकल isoflurane संज्ञाहरण, दोहराया isoflurane संज्ञाहरण संबंधित परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, के रूप में चित्रा किंवदंतियों में कहा गया है । जब डेटा सामांय वितरण मांयताओं से मुलाकात की, 1 तरह ANOVA प्रदर्शन किया गया । गैर-सामान्य रूप से वितरित डेटा Kruskal-वालिस-परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । अंतर p < 0.05 पर महत्वपूर्ण माने गए थे ।

आधारभूत मान

आधारभूत मान, प्रक्रिया बाहर किए जाने से पहले संग्रहीत, उपचार समूह संबंधित पैरामीटर में अलग है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । के रूप में चित्रा 6में प्रदर्शन किया, चित्रा 7, चित्रा 8, चित्रा 9 और चित्रा 10, MGS स्कोर की आधारभूत स्तर (पी = ०.७६२, Kruskal-वालिस-टेस्ट), burrowing की तरह लक्जरी व्यवहार (पी = ०.८९६, Kruskal-वालिस-टेस्ट) और नेस्टिंग (पी = ०.७२३, Kruskal-वालिस-परीक्षण), भोजन का सेवन (पी = ०.३९८, 1-way ANOVA), और घर पिंजरे गतिविधि (p = ०.२०८, Kruskal-वालिस-परीक्षण) काफी समूहों के बीच अलग नहीं किया । इसके अलावा, आधारभूत के रूप में कोई महत्वपूर्ण नहीं है, interquartile में अंतर है (औसत, कोष्ठक में सीमा, [एनजी/50 मिलीग्राम]: नियंत्रण: 123.01 (८२.७०-१९३.४६); एकल संज्ञाहरण: ११८.३१ (१०१.७३-१५३.५४); दोहराया संज्ञाहरण: १२९.५५ (९२.५८-१३९.४८)) (पी = ०.९०४, Kruskal-वालिस-कसौटी) । आधारभूत स्तर में अंतर हो, तो डेल्टा मान परिकलित किया जा सकता है ।

माउस मुंह बनाना स्केल

जब मतलब MGS स्कोर की तुलना में कर रहे हैं, नियंत्रण बनाम महत्वपूर्ण उच्च स्कोर संज्ञाहरण के एकल अनुभव के बाद पाया गया (p = ०.००१) और पिछले दोहराया संज्ञाहरण सत्र (पी = ०.०२१) के बाद 30 मिनट में पिछले संज्ञाहरण के बाद (चित्रा 6A) की वजह से . पिछले संज्ञाहरण के बाद 150 मिनट में, वहां थे अब समूहों के बीच मतभेद (पी = ०.९१०) ।

इस तथ्य को ध्यान में रखना कि आधारभूत MGS स्कोर सभी मामलों में 0 के बराबर नहीं है, MGS अंतर स्कोर की गणना की गई, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है । दोनों संज्ञाहरण के एक एकल अनुभव (पी = ०.००२) और दोहराया संज्ञाहरण (पी = ०.००८) संज्ञाहरण के बाद 30 मिनट में नियंत्रण बनाम MGS अंतर स्कोर में वृद्धि हुई । पिछले संज्ञाहरण के बाद 150 मिनट में, सभी चूहों नियंत्रण के स्तर (पी = ०.६१७) (चित्रा घमण्ड)10करने के लिए वापस आ गया था ।

Burrowing व्यवहार

दोहराया संज्ञाहरण काफी खाद्य छर्रों चूहों के वजन का प्रतिशत कम नियंत्रण बनाम चिपमंक से हटा (पी = ०.०३६, Kruksal-वालिस-परीक्षण) (चित्रा 7)10.

नेस्ट बिल्डिंग व्यवहार

संज्ञाहरण, दोहराया संज्ञाहरण के एक एकल अनुभव के बीच घोंसला स्कोर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे, और नियंत्रण (पी = ०.२४०, Kruksal-वालिस-परीक्षण) (चित्र 8)10.

भोजन का सेवन

1 दिन में अंतिम संज्ञाहरण के बाद, चूहों कि दोहराया संज्ञाहरण आया था काफी कम भोजन सेवन चूहों कि एक संज्ञाहरण अनुभवी था के साथ तुलना में दिखाया (p = ०.०४७, 1-way ANOVA). इसके विपरीत, एक सप्ताह के बाद, चूहों कि दोहराया संज्ञाहरण मिला था नियंत्रण से काफी अधिक भोजन (पी = ०.०१२, 1 तरह ANOVA) या चूहों कि एक एकल संज्ञाहरण प्राप्त किया था (पी = ०.००१, 1 तरह ANOVA) (चित्रा 9)10का सेवन किया ।

घर पिंजरे गतिविधि

1 दिन में अंतिम संज्ञाहरण के बाद, अंधेरे अवधि के दौरान घर पिंजरे गतिविधि, गतिविधि वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा संकेत दिया, काफी चूहों है कि एक संज्ञाहरण, दोहराया संज्ञाहरण, या नियंत्रण उपचार प्राप्त किया था के बीच अलग नहीं था (पी = ०.४९८, Kruskal-वालिस-Test) (figure 10)10.

नि: शुल्क खोजपूर्ण प्रतिमान

सभी चूहों ने पिंजरे के ऊपर खोजबीन की, जब परीक्षण किया गया । हालांकि, 1 दिन के अंतिम संज्ञाहरण के बाद, चूहों कि दोहराया संज्ञाहरण प्राप्त किया था (औसत, कोष्ठक में interquartile रेंज [एस]: ७८.०० (अधधक-89.00)) पिंजरे शीर्ष का पता लगाया से काफी बाद में समय में था नियंत्रण (३१.०० (18.25-42.75); p = ०.००९, Kruskal-वालिस-कसौटी) और चूहों कि एक एकल संज्ञाहरण प्राप्त किया था (२७.०० (21.00-45.50); p = ०.००१, Kruskal-वालिस-परीक्षण), के रूप में पहले से10प्रकाशित । मापदंडों अन्वेषण की कुल अवधि (चित्रा 11A) और अन्वेषणों की संख्या (चित्रा 11B) पहले अन्वेषण करने के लिए विलंबता के अनुरूप हैं. दोहराया संज्ञाहरण काफी नियंत्रण बनाम अंवेषण की संख्या कम (पी = ०.०२३, Kruskal-वालिस-परीक्षण) और अंवेषण की कुल अवधि (पी = ०.०३२, Kruskal-वालिस-परीक्षण) बनाम एक एकल संज्ञाहरण के बाद पिछले संज्ञाहरण के बाद 1 दिन । 8 दिन में अंतिम संज्ञाहरण के बाद, सभी मापदंडों, यानी पहले अन्वेषण के लिए विलंबता (नियंत्रण: 27.50 (१३.५०-४७.२५); एकल संज्ञाहरण: 18.00 (9.50-३८.५०); दोहराया संज्ञाहरण: 20.00 (12.50-४२.००); p = ०.७२२, Kruskal-वालिस-परीक्षण), की संख्या अन्वेषण (पी = ०.०५७), और अन्वेषण की कुल अवधि (पी = ०.५७९), अब अध्ययन समूहों के बीच मतभेद (चित्र 11).

मल corticosterone चयापचयों

आधारभूत मान प्राप्त करने के लिए खाते में लेने के लिए, आधार रेखा के सापेक्ष प्रतिशत परिवर्तन परिकलित किया गया था और समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिले (p = ०.११९, Kruskal-वालिस-परीक्षण) (चित्र 12)10.

Figure 1
चित्र 1 : प्रोटोकॉल की समय रेखा. ग्रे और सफेद रंग का क्षेत्र एक दिन के अंधेरे और प्रकाश समय, क्रमशः का प्रतीक है । प्रक्रिया के आधार पर, इस प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है । "आदी होना टू द चिपमंक" का मतलब है कि चूहों को अपने घर के पिंजरे में चिपमंक के रूप में प्लास्टिक के पानी की बोतल का इस्तेमाल करने के लिए acclimatized होना होगा, इससे पहले कि burrowing टेस्ट आयोजित किया जा सके । B, आधारभूत मान; के. के., मल corticosterone चयापचयों । यह आंकड़ा Hohlbaum एट अल से संशोधित किया गया है । 10. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : स्कोरिंग पत्रक सारांश. इस पत्रक सभी परीक्षणों में शामिल है और प्रत्येक व्यक्ति माउस के लिए बाहर भरा जा सकता है । दिनांक और समय जोड़ा जाना चाहिए जब परीक्षण आयोजित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : अच्छी तरह से किया जा रहा है की ग्रेड के तराजू । तराजू से सीमा "अच्छी तरह से अछूता जा रहा है" (हरा) के लिए अच्छी तरह से किया जा रहा ख़राब "(लाल) और एक सरल तरीके से परीक्षण के परिणाम का अर्थ व्यक्त करते हैं । अच्छी तरह से किया जा रहा है के लिए संकेतकों पर ज्ञान के इस स्तर पर, हम अच्छी तरह से प्रत्येक परीक्षा के लिए जा रहा है, केवल एक सामांय बयान के ग्रेड पर एक निश्चित बयान नहीं कर सकते । MGS, माउस मुंह बनाना केल. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रेक्षण पिंजरे । इस पिंजरे burrowing व्यवहार के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया और तस्वीरें लेने के लिए माउस मुंह बनाना स्केल (MGS) के अनुसार विश्लेषण किया जाता है । पिंजरे के सामने स्पष्ट है और, चूहों के फर रंग पर निर्भर करता है, अन्य तीन दीवारों या तो काले या सफेद चूहों के साथ इसके विपरीत करने के लिए रंग का होना चाहिए. कांच बॉक्स के फर्श के साथ कवर बिस्तर सामग्री के लगभग 0.5 सेमी घर पिंजरे से बिस्तर सामग्री का इस्तेमाल किया सहित है । मानक के हिसाब से भोजन व पानी उपलब्ध कराया जाए । यदि संभव हो, पानी की बोतलें बजाय कटोरे इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि चूहों बिस्तर सामग्री के साथ कटोरे भर सकता है । न्यूनतम 30 मिनट की एक आदी होना अवधि के बाद, चिपमंक जोड़ा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : 24-h अवलोकन अवधि. घोंसला निर्माण व्यवहार, घर पिंजरे गतिविधि, और भोजन के सेवन का आकलन करने के लिए और मल नमूने जिसमें से मल corticosterone चयापचयों (के. के.) मापने के लिए इकट्ठा करने के लिए, चूहों व्यक्तिगत रूप से 24 ज के लिए रखे जाते हैं (पिंजरे प्रकार III: 420 मिमी × 260 मिमी × 150 मिमी; बिस्तर सामग्री लगभग 0.5 सेमी शीर्ष पर बिखरे हुए घर पिंजरे से बिस्तर सामग्री इस्तेमाल के साथ गहरी, एक कपास nestlet, पानी और मानक खाद्य आहार विज्ञापन libitumनल) । एक अवरक्त संवेदक पिंजरे के शीर्ष पर मुहिम शुरू की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : माउस मुंह बनाना स्केल (MGS) . बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । डॉट्स 1.5-3.0 × IQR के बीच मूल्यों के साथ outliers हैं । रंगीन तारांकन 3.0 × IQR से अधिक मानों के साथ outliers होते हैं । (क) मतलब MGS स्कोर. (B) माध्य MGS अंतर स्कोर । p मान Kruskal-वालिस-परीक्षण: * p < 0.05 का उपयोग करके परिकलित किए गए थे; * * p < 0.01. एक तकनीकी खराबी (कैमरा, स्केल) के कारण, एकल संज्ञाहरण समूह में चार चूहों को आँकड़ों से बहिष्कृत कर दिया जाना था. यह आंकड़ा Hohlbaum एट अल से संशोधित किया गया है । 10. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : Burrowing व्यवहार. बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । रंगीन तारांकन 3.0 × IQR से अधिक मानों के साथ outliers होते हैं । p मान Kruskal-वालिस-परीक्षण: * p < 0.05 का उपयोग करके परिकलित किए गए थे । एक तकनीकी खराबी (कैमरा, स्केल) के कारण, एकल संज्ञाहरण समूह में चार चूहों को सांख्यिकीय विश्लेषण से बाहर रखा जाना था । यह आंकड़ा Hohlbaum एट अल से संशोधित किया गया है । 10. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8 : नेस्ट बिल्डिंग व्यवहार. बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । डॉट्स 1.5-3.0 × IQR के बीच मूल्यों के साथ outliers हैं । p मान Kruskal-वालिस-परीक्षण का उपयोग करके परिकलित किए गए थे; d, day. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : भोजन का सेवन । डेटा ± मानक विचलन मतलब है । p मान 1-तरफ़ा ANOVA (पोस्ट-हॉक Tukey-एचएसडी) का उपयोग कर परिकलित किए गए थे: * p < 0.05; * * p < 0.01. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : घर पिंजरे गतिविधि । बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । डॉट्स 1.5-3.0 × IQR के बीच मूल्यों के साथ outliers हैं । p मान Kruskal-वालिस-परीक्षण का उपयोग करके परिकलित किए गए थे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11 : मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान । बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । डॉट्स 1.5-3.0 × IQR के बीच मूल्यों के साथ outliers हैं । रंगीन तारांकन 3.0 × IQR से अधिक मानों के साथ outliers होते हैं । (क) अन्वेषण की कुल अवधि. (ख) अन्वेषणों की संख्या. p मान Kruskal-वालिस-परीक्षण: * p < 0.05 का उपयोग करके परिकलित किए गए थे । यह आंकड़ा Hohlbaum एट अल से संशोधित किया गया है । 10. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्र 12 : मल corticosterone चयापचयों () के. बॉक्स interquartile रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स किनारों 25गु और 75गु चतुर्थक हैं । मूंछ मूल्यों जो कोई 1.5 × IQR से अधिक कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं । रंगीन तारांकन 3.0 × IQR से अधिक मानों के साथ outliers होते हैं । और 1 दिन के बाद की प्रक्रिया से पहले के स्तर पर 2 दिन की । संबंधित आधारभूत मान की तुलना में उनके द्वारा किए गए या अधिक के लिए [%] का प्रतिशत परिवर्तन । डेटा Kruskal-वालिस-परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल मूलतः C57BL/6JRj चूहों कि या तो एक भी संज्ञाहरण या दोहराया isoflurane संज्ञाहरण प्राप्त की भलाई का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था । परिणाम की पुष्टि है कि लक्जरी व्यवहार के परीक्षण, साथ ही साथ अंय उपायों (उदा मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान, MGS, burrowing भोजन का सेवन) अच्छी तरह से आकलन करने के लिए संवेदनशील तरीके थे । दोहराया isoflurane संज्ञाहरण की वजह से चिंता से संबंधित व्यवहार पर अल्पकालिक प्रभाव, MGS, और burrowing व्यवहार । इसके अलावा, दोहराया isoflurane संज्ञाहरण के लिए खाद्य सेवन10प्रभावित दिखाई दिया ।

मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान खोजपूर्ण व्यवहार कम संकेत दिया और, नतीजतन, चूहों में उच्च लक्षण चिंता का स्तर है कि बार anesthetized थे चूहों के साथ तुलना में केवल एक बार anesthetized, और नियंत्रण । हालांकि, सभी समूहों के चूहों gridded पिंजरे शीर्ष10,20का पता लगाया । जब चिंता से संबंधित व्यवहार की जांच, यह विशेषता और राज्य की चिंता21,22के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक अपरिचित वातावरण में माउस रखकर राज्य चिंता लाती है । इसके विपरीत, मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान जानवरों को अपने घर पिंजरों में रहने के लिए अनुमति देता है और, इस प्रकार, विशेषता चिंता की जांच ।

दोहराया संज्ञाहरण के बाद चूहों के बीच खोजपूर्ण व्यवहार में कमी मोटर गतिविधि में कमी से नहीं समझाया जा सकता है । घर अंधेरे अवधि के दौरान पिंजरे गतिविधि काफी अध्ययन समूहों के बीच अलग नहीं किया । यह इंगित करता है कि चूहों पहले से ही शारीरिक रूप से संज्ञाहरण से बरामद जब मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान परीक्षण किया गया था ।

MGS वास्तव में दर्द का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन इस बात का सबूत है कि चेहरे के भाव भी तनाव और सकारात्मक भावनाओं13,23से बदल रहे हैं । माउस की तस्वीरें संकेत दिया है कि दोनों एकल और दोहराया isoflurane संज्ञाहरण पर MGS पर स्कोर कम अवधि के तत्काल बाद में संवेदनाहारी अवधि में वृद्धि हुई है । के रूप में MGS अंतर स्कोर 1 से नीचे रह गया, तनाव के स्तर को हल्के10दिखाई दिया । परिणाम मिलर एट अल की हालिया टिप्पणियों से सहमत हैं । 24 , 25 और पता चला है कि चूहों नियंत्रण स्तर 150 मिनट के बाद संज्ञाहरण10को लौट आए ।

burrowing और घोंसला निर्माण व्यवहार की तरह लक्जरी व्यवहार प्रजातियों विशेष कर रहे हैं और अच्छी तरह से किया जा रहा7 और चूहों में अच्छा सामान्य स्वास्थ्य के लिए संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं26. चूहे तभी विलासिता का व्यवहार दिखाते हैं, जब उनकी सभी आवश्यक जरूरतें पूरी होती हैं. यदि अच्छी तरह से कम किया जा रहा है, लक्जरी व्यवहार पहले5,7बिगड़ा हुआ है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि burrowing और घोंसले के निर्माण दोनों दर्द और संकट से ख़राब हो सकता है6,8, लेकिन यह भी सबूत है कि हिप्पोकैम्पस घावों इन दो व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं15,27 , 28 , 29 , 30 , 31.

लक्जरी व्यवहार प्रारंभिक पोस्ट में जांच की गई संवेदनाहारी अवधि (burrowing व्यवहार) और अगले दिन की सुबह से (घोंसले के निर्माण के व्यवहार) । burrowing व्यवहार के लिए परीक्षण Deacon एट अल द्वारा विकसित और Jirkof एट अल द्वारा अपनाया गया था. acclimatization के संबंध में संशोधित किया गया था (व्यक्तिगत आवास के बजाय समूह आवास) और व्यवहार मापन की अवधि (केवल 2 घंटे के बजाय 24 ज) 8 , 15 , 16.

यह उल्लेखनीय है कि दोहराया संज्ञाहरण burrowing व्यवहार कम, सुझाव है कि वहां अच्छी तरह से किया जा रहा है तुरंत संज्ञाहरण10है, जो भी Jirkof एट अल द्वारा सूचित किया गया था के बाद एक हानि थी । 8. लेकिन अगले दिन की सुबह, जब चूहों को संज्ञाहरण से उबरने के लिए अधिक समय था, उच्च और जटिल घोंसले वे बनाया था संकेत दिया है कि वे अच्छी तरह से किया जा रहा10का सामना कर रहे थे । ये निष्कर्ष पिछली रिपोर्ट्स से अलग हैं, जो एक पूर्व समय32पर नेस्टर बनाए गए थे । इसलिए, यह प्रोटोकॉल और स्कोर घोंसले पहले समय में अनुकूलित करने के लिए उपयोगी हो सकता है । हालांकि, घोंसले के निर्माण के व्यवहार के circadian लय अभी भी विचार किया जाना चाहिए, के रूप में चूहों अंधेरे चरण के अंत में अपने घोंसले तैयार करने के लिए करते हैं32.

भोजन का सेवन मामूली दोहराया संज्ञाहरण के बाद 1 दिन में कमी आई थी, लेकिन यह एक सप्ताह बाद में वृद्धि हुई थी । चूहों के रूप में शरीर के वजन को खोना नहीं था (Hohlbaum एट अल देखें । 10) किसी तरह का मुआवजा तंत्र हो सकता है, और भोजन के सेवन के संबंध में अच्छी तरह से हानि होने के हल्के10के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए । भोजन के सेवन पश्चात कष्ट, अच्छी तरह से किया जा रहा है और चूहों में भूख में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो पश्चात मतली26 और पश्चात तनाव27से ख़राब किया जा सकता है ।

साथ ही33,34,35चूहों में मज़बूती से तनाव का संकेत है । चोटी के....... आमतौर पर एक तनाव के बाद 8-10 घंटे होते हैं, लेकिन आंत्र पारगमन समय18पर निर्भर करते हैं । इसलिए, यह भी घर पिंजरे गतिविधि की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इस प्रोटोकॉल में शामिल थे । उत्सर्जित18पर circadian ताल प्रभाव के कारण, यह 24 एच. के. के एक अवधि में मल नमूने इकट्ठा करने के लिए सलाह दी जाती है.... के रूप में के रूप में एक व्यक्ति के लिए स्वतंत्र रूप से अलग है, आधार रेखा के सापेक्ष है । वर्तमान में जांच के ही लिए गए है कि एक भी संज्ञाहरण का अनुभव और न ही दोहराया संज्ञाहरण काफी वृद्धि हुई हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-अधिवृक्क (HPA) अक्ष गतिविधि10

सब सब में, निष्कर्ष है कि दोहराया isoflurane संज्ञाहरण से पता चला कि अल्पकालिक हल्के संकट और बिगड़ा अच्छी तरह से जल्दी postanesthetic अवधि में जा रहा है थोड़ा और अधिक isoflurane संज्ञाहरण10के एक एकल अनुभव किया ।

एक प्रोटोकॉल का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से किया जा रहा पशुओं पर अतिरिक्त संकट नहीं थोपना चाहिए । वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि यह 24 एच अवलोकन अवधि, जो प्लाज्मा corticosterone स्तर को बढ़ाने के लिए जाना जाता है के दौरान व्यक्तिगत आवास शामिल है36। हालांकि, व्यक्तिगत आवास घर पिंजरे गतिविधि, भोजन का सेवन, घोंसले के निर्माण के व्यवहार के संबंध में व्यक्तियों के लिए वैध डेटा इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है, और के स्तर पर । एक ही समय में उन चार मापदंडों की जांच करके (अर्थात 24 एच अवलोकन अवधि के दौरान) व्यक्तिगत आवास की अवधि को कम किया गया । व्यक्तिगत आवास, नियंत्रण चूहों से पक्षपातपूर्ण होने से परिणामों को रोकने के लिए एक ही परीक्षण किया गया और उनके परिणाम को ध्यान में रखा गया । यदि विधियां एक समूह-आवास वातावरण में उन मापदंडों को मापने के लिए उपलब्ध हैं, वे इस्तेमाल किया जाना चाहिए (उदाघर पिंजरे गतिविधि37 और भोजन के सेवन के लिए एक स्वचालित घर पिंजरे विश्लेषण प्रणाली के लिए) । हालांकि, स्वचालित घर पिंजरे विश्लेषण प्रणालियों अतिरिक्त उपकरण है, जो उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता है । व्यक्तियों के बजाय पशुओं के समूहों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन में, घर पिंजरे गतिविधि, भोजन का सेवन, घोंसले के निर्माण के व्यवहार, और खाद्य पदार्थ के स्तर पर भी चूहों के एक समूह के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । एक ही मुक्त खोजपूर्ण प्रतिमान पर लागू होता है, जो केवल चूहों को स्पष्ट रूप से चिह्नित किया जाना चाहिए ताकि वे प्रतिष्ठित किया जा सकता है । यदि अच्छी तरह से एक समूह में कम किया जा रहा है, समूह में सभी चूहों ध्यान से जाँच की जानी चाहिए (स्कोर शीट और नैदानिक परीक्षा का उपयोग) माउस या चूहों की पहचान करने के लिए चिंतित. समूह के स्तर पर और अवलोकन समूह मानों की संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं ।

शोधन के संबंध में, इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और चल रहे अध्ययनों में एकीकृत करने के लिए अच्छी तरह से चूहों की जा रही पर एक विशेष प्रक्रिया के प्रभाव का आकलन । विशेष प्रक्रिया और अध्ययन डिजाइन पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल से सबसे उपयुक्त परीक्षण चुना जाना चाहिए । यहां, burrowing और घोंसला निर्माण परीक्षण, MGS, मुफ्त खोजपूर्ण प्रतिमान और भोजन के सेवन की माप विशेष रूप से लाभप्रद दिखाई दिया । चूहों के व्यवहार के रूप में circadian लय38इस प्रकार है, यह एक निर्धारित समय बिंदु पर सभी समूहों के चूहों में व्यवहार परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है. चूहे सुबह के मुकाबले दोपहर में38से ज्यादा एक्टिव रहते हैं । हालांकि, अगर अध्ययन डिजाइन सुबह में परीक्षण के लिए अनुमति नहीं है, परीक्षण एक और समय पर किया जा सकता है । यह भी सुनिश्चित करें कि प्रत्येक एकल परीक्षण सभी समूहों के लिए एक ही समय बिंदुओं पर आयोजित किया जाता है महत्वपूर्ण है । अंयथा, पैरामीटर्स के circadian लय के प्रभाव में अंतर या समूह भेद हो सकते हैं । इसके अलावा, नियंत्रण चूहों अध्ययन में शामिल किया जाना चाहिए, ताकि इलाज चूहों और नियंत्रण चूहों से परिणाम की तुलना में किया जा सकता है. चूहों को नियंत्रित एक ही समय बिंदु पर इलाज चूहों के रूप में परीक्षण किया जाना चाहिए । यदि प्रोटोकॉल दिखाता है कि अच्छी तरह से किया जा रहा ख़राब है, प्रक्रिया परिष्कृत किया जाना चाहिए, और प्रोटोकॉल दोहराया । इस दृष्टिकोण दिखा सकते है कि प्रक्रिया को परिष्कृत करने के लिए प्रयास प्रभावी थे ।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक सामांय सहायता के रूप में सेवा के लिए एक प्रक्रिया की वजह से गंभीरता की डिग्री का अनुमान कर सकते हैं । इसलिए, यह एक वैज्ञानिक पर एक प्रक्रिया की गंभीरता को वर्गीकृत करने में मदद करता है-और पशु केंद्रित स्तर । हालांकि, प्रोटोकॉल हल्के, मध्यम, या गंभीर के रूप में एक प्रक्रिया वर्गीकृत करने के लिए एक स्केल प्रदान नहीं करता है । एक प्रक्रिया की गंभीरता को वर्गीकृत करने के लिए, यह यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 के अनुलग्नक आठवीं में उदाहरण के लिए संदर्भित करने के लिए आवश्यक है ।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल एक व्यवस्थित आकलन का समर्थन करता है चूहों में एक वैज्ञानिक, पशु केंद्रित तरीके से प्रक्रियाओं के बाद जो सामान्य संज्ञाहरण प्रयोग किया जाता है के बाद में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

नमूना संग्रह के साथ सहायता करने के लिए सबीन याकूब के लिए धंयवाद, एडिथ Klobetz-Rassam के विश्लेषण के लिए, पीडी डॉ. मेड. पशु चिकित्सक । हबील. सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ सहायता के लिए Roswitha Merle, और पांडुलिपि की अशुद्धि जांच के लिए Wiebke Gentner । अध्ययन बर्लिन-ब्रांडेनबर्ग रिसर्च प्लेटफॉर्म BB3R (www.bb3r.de) का हिस्सा है और जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (अनुदान संख्या: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluran CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH 1214
InfraMot - Sensore Units TSE Systems 302015-SENS
InfraMot - Control Units TSE Systems 302015-C/16
InfraMot - Software TSE Systems 302015-S
Nestlet N Ancare - Plexx NES3600
Camera EOS 350D Canon

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References

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Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia. J. Vis. Exp. (133), e57046, doi:10.3791/57046 (2018).

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