Summary
우리는 전신 마 취를 사용 하 여 프로시저 동안 쥐에 복지를 평가 하기 위해 프로토콜을 개발. 복지의 수준 뿐만 아니라 glucocorticoid 대사 산물 분석 했다 나타내는 행동 매개 변수의 시리즈. 프로토콜은 과학, 동물 중심 방식에서 심각도의 정도 추정 하는 일반적인 보조로 사용할 수 있습니다.
Abstract
3R 원칙 (대체, 감소, 구체화) 개발 Russel과 뉴욕 생명에 의해, 따라 과학 연구 가능한 동물 실험에 대 한 대안을 사용 해야 합니다. 동물 실험에 대안이 있을 때, 사용 하는 실험실 동물의 총 수는 귀중 한 데이터를 얻는 데 필요한 최소 이어야 한다. 또한, 고통, 고통, 및 실험 절차를 동반 하는 고통을 최소화 하기 위해 적절 한 수정 조치를 적용 합니다. 고통, 고통, 및 조 난의 정도 분류 하는 데 사용 하는 카테고리는 비-복구, 가벼운, 중간, 또는 심한 (EU 지침 2010/63). 확인 하려면 개별 경우에는 카테고리 적용, 과학적으로 소리 도구를 사용 하 여 결정적 이다.
여기 잘이 평가 프로토콜 절차는 전신 마 취는 설계 되었습니다. 프로토콜 내과 복지의 지표로 동작을 구축 하는 둥지 같은 집 케이지 활동, 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모와 럭셔리 동작에 초점을 맞추고. 그것은 또한 불안 관련 행동 특성에 대 한 무료 탐구 패러다임을 사용합니다. 급성 스트레스의 지표로 지저분한 corticosterone metabolites 24 h 후 마 취 기간 동안 측정 된다.
프로토콜은 마우스 따라 전신 마 취의 과학적으로 단단한 정보를 제공 합니다. 그것의 단순 프로토콜 수 있습니다 쉽게 적응 되며 계획 된 연구에서 통합. EU 지침 2010/63에 따라 카테고리에서 조 난을 분류 하는 규모를 제공 하지는 않습니다, 그것은 과학적으로 사운드 데이터를 사용 하 여 프로시저의 심각의 정도 추정 하는 연구를 도울 수 있다. 과학, 동물을 중심으로 복지의 평가 개선할 수 있는 방법을 제공 합니다.
Introduction
EU 지침 2010/631 규정 Russel과 Burch2 를 개발한 3R 원칙 (대체, 감소, 구체화) 동물 실험은 필요 때마다 적용 하는 것입니다. EU 지침의 궁극적인 목표는 모든 동물 실험, 밖으로 위상 하지만 지시문 인정, 시간이 되 고, 일부 동물 실험은 여전히 필요 인간과 동물 건강을 보호 하는 연구를 수행. 따라서, 동물 실험은 어떤 다른 방법으로 바꿀 수 없습니다, 경우는 최소한 실험실 동물의 신뢰할 수 있는 결과 얻을 하는 데 사용 될 것 이다. 또한, 고통, 고통, 및 실험 절차를 동반 하는 조 난의 양은 적절 한 수정 조치를 사용 하 여 최소화 합니다. EU 지침 2010/63 규정 한 절차의 심각도 prospectively 비 복구, 가벼운, 중간, 또는 심한1으로 분류 되어야 합니다. 심각도 분류에 사건-의해-사건을 기준으로 결정이 주어진된 절차의 심각도 평가를 과학적으로 소리 도구를가지고 중요 합니다.
모 튼과 그리피스3 에 의해 제안 된로 점수 시트 웰빙4에 부정적인 영향을 포함 하 여 정상 상태에서 어떤 편차를 감지에 필수적인 도구입니다. 점수 시트를 사용 하 회 결정 고통, 고통, 그리고 실험으로 인 한 조 난 및 개별 동물 (예를 들어, 몸 무게, 모피, 걸음 걸이)의 물리적 상태에 보이는 변화에 초점. 별관 8 세의 EU 지침 2010/63 각 심각도 카테고리의 예를 제공 합니다, 하지만 과학적으로 사용 하 여 주어진된 프로시저의 심각의 정도 추정 하 연구원은 아직도 부족 도구 데이터를 기반으로 합니다.
부정적인 복지를 보여주는 지표의 부재; 동물의 상태를 확인 하는 유일한 방법은 아니다. 긍정적인 복지를 가리키는 지표의 존재 또한 중요 한5,6,,78이다. 예를 들어 동물 내 같은 고급 동작을 표시 하 고 그들의 모든 필수 요구 충족 하는 경우에 건물 동작을 중첩. 고급 동작을 복지 감소 있다면5,7감소 처음. 복지를 평가에 사용 되는 프로토콜 상세 하 고 포괄적인 방식으로9에 웰빙을 평가 하기 위해 물리, 생리/생화학, 및 동물의 심리 상태를 가리키는 지표를 포함 해야 합니다.
세련미의 컨텍스트 내에서 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족 하 고 쥐10의에 전신 마 취와 관련 된 절차의 효과 평가 하기 위해 개발 되었다. 동시에 목표에 주어진된 실험 프로토콜의 쉽게 통합할 수 있도록 추가적인 스트레스를 최소화 했다. 프로토콜 내 행동, 활동, 음식 섭취, 중첩 등 홈 케이지 동작 및 특성 불안 관련 행동을 고려 합니다. 또한, 그것은 포함 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모 (MGS), 및 비-침략 적 분석 corticosterone 대사 산물의 배설물. 과학 고 동물을 중심으로 복지의 평가 촉진 하 고 심각성의 정도의 분류를 지 원하는 복지에 정보를 제공 하는 프로토콜은 설계 되었습니다. 점수 시트, 뿐만 아니라 그것은 절차의 심각도 분류에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 프로토콜 수행 하기 쉬운 하 고 광범위 한 장비를 필요로 하지 않습니다, 연구의 결과 영향을 주지 않고 지속적인 실험으로 통합 될 수 있습니다. 주목 해야 한다 그 동물 연구: 보고의 Vivo 실험 (도착) 지침11 동물 실험, 설계, 분석, 개선 및 보고의 목표와 관련 된 모든 연구에서 관찰 될 것 이다.
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Protocol
학문과 독일 동물 복지 행위에 의해 규정 하는 지침에 따라 수행 했다 베를린 국가 기관에 의해 승인 되었다 ("Landesamt 위한 Gesundheit und Soziales", 허가 번호: G0053/15).
참고:이 프로토콜의 주요 목적은 glucocorticoid metabolites에 반복 된 마 취의 효과 조사 했다. 샘플 크기를 계산 하는 사용 되는 동물의 수를 결정 하기 위해 수행 되었다: n ≥ 2 × (s/μ1-μ2)2 × (zα +βz)2. μ1-μ2 는 전력 및 샘플 크기 계산 만들어집니다 모집단 평균 차이 (α = 5%, β = 80%); zα = 1.96 및 zβ = 0.84는 표준 정규 분포의 quantiles. 그림 1 에서는이 프로토콜의 타임 라인을 보여 줍니다. 매개 변수는 프로토콜의 제어 수준 차이 보여줍니다, 동물을 밀접 하 게 모니터링 해야 하 고 적당 한 기간 후에 다시 매개 변수를 측정 한다. 예를 들어 특성 불안 관련 행동을 증가 하는 경우이 동작이 테스트 해야 다시 1 주일 후, 전체 복구까지 기간을 결정할 수 있도록. 시간 포인트 및이 프로토콜에 정의 된 다른 프로시저와 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 시간 포인트를 변경할 때 프로토콜에 설명 된 대로 habituation 기간 유지 되어야 한다. 마우스의 동작에 영향을 줄 수 있는 요소를 줄이기 위해 마우스의 정상적인 동작을 방해 하지 않는 테스트 후 더 조작 해야 하는 테스트를 실시 한다. 그림 2 에 요약 점수 시트를 사용 하 여 프로토콜의 모든 테스트 요약 되어 있습니다. 그림 3 테스트 결과 해석 하는 방법에 대 한 개요를 주는 웰빙, 등급의 단순화 된 스케일을 제공 합니다.
1. 실험에 의해 처리를 마우스 habituating
- 그들은 다른 시설 또는 공급 업체에서 받은 후 적어도 2 주 동안 동물 시설에 길 들을 마우스를 허용 합니다.
- 그룹에는 마우스를 집 고 12:12 h의 빛: 다크 사이클에 표준 조건 (실내 온도 22 ± 2 ° C, 상대습도 55 ± 10%)에서 그들을 유지 합니다.
- 표준 농축으로 터널 및 면 nestlets와 모든 그룹을 제공 하 고 음식을 제공 광고 libitum물.
- 터널 / 컵12테스트 전에 일주일 이상 처리 모든 쥐를 길 들.
참고: 스트레스 또는 불안, 차례로 웰빙에 영향을 미치는 또한이 프로토콜12의 결과에 영향을가지고 유도 수 쥐 꼬리 따기.
2. 행동 시험장 및 기구 준비
참고: 테스트를 위해, 이상적으로 동물 지켜진다 룸 근처 별도 룸을 제공 합니다. 절차를 수행 하기 전에 테스트 룸 적어도 60 분에 자신의 홈 새에 쥐를 전송 합니다. 만약에 가능 하다 면, 절차를 실시 하는 동일한 테스트 룸에서이 프로토콜의 모든 테스트를 수행 합니다.
- 내 행동8 을 테스트 하 고 MGS13 (그림 4)에 사용 하기 위해 사진을 찍고 관찰 케이지를 준비 합니다.
- 유리 상자를 사용 하 여 약 220 m m × 290 m m의 390 m m의 높이.
- 침구 물자의 대략 0.5 cm이 상자의 바닥을 커버.
- 새로운 환경으로 인 한 고통을 줄이기 위해 새로운 침구 소재 위에 홈 장에서 사용된 침구 물자의 피해 라.
- 음식, 다이어트, 그리고 물으로 일반적으로 제공 되는 동일한 종류를 제공 합니다.
참고: 경우, 사용 물 병, 쥐 소재 침구와 물 그릇을 채울 수 있습니다.
- 감 금 소 준비 (III 입력: 420 mm × 260 × 150 m m)는 마우스는 개별적으로 보관 24 시간 관찰 기간에 대 한 (그림 5).
참고: 개별 주택 기간을 최소화 하기 위해이 기간 동안 동작, 홈 케이지 활동, 음식 섭취 및 배설물 corticosterone 대사 산물 (FCM)를 구축 하는 둥지에 대 한 데이터를 수집 합니다.- 장소는 고통을 줄이기 위해 케이지 (약 0.5 c m 깊이) 및 분산형 새로운 소재, 위에 홈 장에서 대변 없이 사용된 침구 물자의 자료를 새로운 침구.
- 환경 농축 유일한 (참조 자료의 테이블)14으로 정의 된 무게의 표준화 된 평방 면 nestlet을 제공 합니다.
참고: 상업 nestlets 무게가 달라질 수 있습니다. 따라서, 우리는 집사에 의해 설명 하는 nestlet의 무게를 수정 하 고 2.7 g14대신 2.0 g를 사용. - 홈 케이지 활동을 측정 하는 적외선 센서를 사용 하는 경우는 케이지 상단 적외선 센서를 탑재 ( 재료의 표참조).
- 음식, 다이어트로 일반적으로 제공 되는 동일한 종류를 제공 하 고 광고 libitum물.
3. 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모
참고:는 MGS 3 시간 지점에서 관측 장에 촬영에 대 한 사진: (i) 2 일전 기록 기준선 MGS 수준, 후 절차, (ii) 30 분 및 (iii) 150 분 후에 절차에 절차. 웰빙은 장애인, 점수는 MGS에 증가 합니다. 증가 MGS 점수는 아직도 150 분 후, 관찰 하는 경우 나중 단계에서 추가 사진 걸릴.
- 높은-정의 카메라를 사용 하 여 사진에 대 한.
- 부드럽게 관측으로 마우스를 이동 하 고 마우스를 적어도 30 분 동안 새로운 환경에 길 들을 허용 합니다.
- 지속적으로 대 한 걸릴 각 시간에 대 한 30-40 사진 포인트 1-2 분 이내.
- 날카로운 정면 또는 측면 사진 선택 하 고 흐릿한 사진이 나 정면 또는 측면 보기 보다 다른 관점에서 마우스 얼굴을 보여 주는 사진 삭제 모든 사진을 정렬 합니다.
- 임의로 각 시간 지점에서 (즉, 프로시저, 프로시저, 후 30 분 및 절차 후 150 분 2 일전) 각 마우스에 대 한 하나의 사진을 선택 합니다.
- 시체 위치 표시13이 아닌 마우스의 머리만 표시 하 사진 자르기.
- 각 사진에 대 한 하나의 시트 스프레드시트 파일을 만들고 각 시트를 MGS의 5 명의 얼굴 작업 단위를 포함 하는 테이블을 추가 합니다.
참고: 기준선 사진 뿐만 아니라 사진 post 프로시저 파일 포함 되어 있습니다. - 시트의 순서를 무작위.
- 3 명의 독립적인 사람, 이전 MGS 랭 포드 외 에 의해 개발 된를 사용 하 고 그들이 점수 3 점 척도 사용 하 여 얼굴 작업 단위를 훈련 했다 컴퓨터 화면에 파일을 제시 (0 = 미제공, 1 = 알맞게 제시, 2 = 분명히 현재).
참고: 다음 매개 변수13기반 점수: 궤도 강화 ("축소의 궤도, 단단히 닫힌된 눈 꺼 풀 또는 눈 짜기"); 코 돌출 ("둥근 코의 다리에서 보이는 피부의 확장"); 뺨 볼록한 ("볼록 모양 뺨 근육의"); 귀 위치 ("귀 떨어져 뽑아 다시 그들의 초기 위치에서 또는 수직 능선 귀 다시 그려지기의 팁 때문에 그 형태를 갖춘"); 수염 변경 ("그들의 기준선에서 수염의 움직임 중 하나 위치 뒤로, 얼굴 또는 앞으로, 마치 끝;에 서 서 수염 수 있습니다 또한 덩어리 같이 "). - (랭 포드 외. 에서 적응 하는 다음과 같이 점수를 분석 13)입니다.
- MGS 점수를 생성 하기 위해 각 사진에 대 한 모든 얼굴 작업 단위 평균.
참고: 경우 얼굴 행동 단위 중 하나 득점 하지 수, 나머지 얼굴 작업 단위 평균. - 초기 사진 MGS 차이 점수 각 마우스에 대 한 사진 게시 절차에 대 한 평균에서 평균을 뺍니다.
- 명 (비패라메트릭 테스트 관련된 샘플에 대 한) MGS 차이 점수 차이 대 한 테스트.
참고: 경우에 중요 한 차이 (p < 0.05), 모든 사진의 점수 또는 점수 몇 사진 사람 사이 다른 지 여부를 결정 합니다. 후 자가 사실이 라면,이 사진의 점수를 반복 합니다. 그렇지 않으면, 사람 MGS 훈련을 반복 하 고 다시 사진 점수 한다. - 평균 MGS 차이 점수에서에서 얻은 각 마우스에 대 한 다른 득점 경우 모든 사람의 결과 크게 차이가 없습니다.
- MGS 차이 점수 연구 그룹 간의 평균을 비교 하는 비패라메트릭 통계 테스트를 사용 합니다.
- MGS 점수를 생성 하기 위해 각 사진에 대 한 모든 얼굴 작업 단위 평균.
4. 내 행동8,,1516
- 일반적으로 표준 불투명 플라스틱 물 병 (250 mL, 150 m m 길이, 55mm 직경, 병 목의 45 m m 직경)8에서 다이어트로 제공 140 ± 2g 음식 펠 릿을 배치 하 여 버 로우를 준비 합니다.
참고: 마우스 선호 넓은 튜브, 버 로우 68 m m의 직경을 가진 사용할 수 있습니다 디 콘16에 의해 설명 된 대로. - 장소 뚫으 집 안의 음식 펠 릿 순응에 대 한 일 절차 전에 가득합니다.
참고: 장에 일반 음식 분배 단위 비운 하지 해야 하지만 또한 있어야 음식 펠 릿으로 채워진 마우스 사용이. - 두 번, 프로시저 (기준선); 2 일전 테스트 수행 또한 마지막 30 분 게시물 절차를 실시 합니다.
- 30 분 이상 관찰 케이지는 MGS에 대 한 사진을 찍은 길 들 마우스를 하자.
- 장소는 플라스틱 물 병 음식 펠 릿 관찰 감 금 소의 뒤 벽에 평행으로 가득합니다.
- 음식 펠 릿 (g)가 2 시간 후는 굴에 남아 있는 무게.
- 초기 중량 (%)를 기준으로 마우스에 의해 뚫 으에서 제거 하는 음식 펠 릿의 무게를 계산 합니다.
5. 24 시간 관찰 기간
참고: 마우스 2.2에 설명 된 대로 개별적으로 보관 됩니다. (그림 5), 24 h 동안 식품을 측정 하기 위해 섭취, 홈 케이지 활동, 둥지 건물 행동과 FCM 수준. 24 시간 관찰 두번 일어난다: (i) 2 일전 절차 초기 레벨, (ii) 절차의 날에.
-
음식 섭취 량
- 몸 무게 (점수 시트의 일부)에 어떤 변화를 평가 하기 위해 정기적으로 (예: 마 취, 마 취, 마 취 후에 2 일 및 마 취 후 주간 직전 2 일), 쥐를 무게.
참고: 체중 체중의 그램 당 음식 섭취 량을 계산 해야 합니다. 물 섭취 량 또한 24 h 관찰 기간 동안 측정할 수 있습니다. 음식 섭취 량이 감소 하는 경우 복지 장애가 있을 수 있습니다. - 케이지 (약 100 g)의 음식 단위에 제공 된 표준 음식 다이어트 (그램)의 초기 무게를 결정 합니다.
- 24 시간 관찰 기간의 끝에 표준 음식 다이어트의 무게를 결정 합니다.
- 신중 하 게 음식 흘림에 대 한 식품 단위 아래 케이지 측면을 검사 하 고 식품 단위에 남아 있는 음식 펠 릿의 무게에 발견 어떤 여분의 음식 펠 릿을 추가.
- 단위 체중 당 음식 섭취 량을 계산 합니다.
- 몸 무게 (점수 시트의 일부)에 어떤 변화를 평가 하기 위해 정기적으로 (예: 마 취, 마 취, 마 취 후에 2 일 및 마 취 후 주간 직전 2 일), 쥐를 무게.
-
홈 케이지 활동
참고: 적외선 센서를 사용 하 여 다음 지침 참조 ( 재료의 표참조), 하지만 홈 케이지 활동 또한 대체 프로그램으로 평가 될 수 있다. 제어 수준 (예: hypoactivity, 과다)에서 홈 케이지 활동의 편차 장애인된 복지의 징조 수 있습니다.- 프로그램을 시작 합니다.
- 1 분의 샘플 간격 및 충 동 24 h에 대 한 매 순간 기록 됩니다 의미 24 h의 수집 시간을 선택 합니다.
참고: 경우는 실험 후 녹화 시작 여러 번 방을 입력만에서 데이터를 사용할 때 마우스 방해 되지 않은 기간 (즉, 어두운 기간 동안). - 자극의 10 분 간격으로 정리해.
- 시간 곡선 (전류 × 분) 아래 영역을 계산 합니다.
-
둥지 빌딩 동작
참고: 복잡 하 고 높은 둥지 복지의 지표로 사용할 수 있습니다.- 배치 평방 면 nestlet ( 재료의 표참조) 무게로 정의 (예: 2.0 g) 감 금 소의 한가운데에.
- 다음 아침, 약 2 시간 후에 표시등이 켜 디 콘14 에 따라 5-포인트 규모 (아래 참조)에 둥지를 점수. Nestlet 초기 체중의 5% 이상 하는 untorn nestlet 조각 무게. 둥지14 다음과 같이 점수
- 그대로 nestlet의 90% 경우에 "1"의 점수를 할당 합니다.
- 그것은 50-90% 그대로 하는 경우 "2"의 점수를 할당 합니다.
- 할당 점수 "3"는 nestlet의 50-90% 났습니다.
- 할당 "4" 90% 이상이 났습니다, 둥지는 평평 하 고, 그리고 그것의 둘레의 50% 미만 웅크리고 마우스 몸 높이 보다 더 높은 점수.
- 할당 "5" 이상 90 %nestlet 났습니다 둥지 높은, 그리고 그것의 둘레의 50% 이상은 위로 컬된 마우스의 몸 높이 보다 더 높은 점수.
-
지저분한 Corticosterone 대사 산물
참고: 컨트롤 수준 이상의 FCM의 증가 24 h postanesthetic 기간 동안 급성 스트레스 수준을 반영합니다.- 24 시간 관찰 기간의 끝에 집게를 사용 하 여 케이지에서 모든 건조 분 변 알갱이 수집 하 고 젖은 펠 릿 소변으로 오염 제거.
- 황금 외 에 FCM를 추출 17, 다음과 같이입니다.
- 60-70 ° C의 온도에서 건조 분 변 샘플
- 박격포를 사용 하 여 배설물 샘플 균질
- 멀티 소용돌이에 30 분 동안 원심 분리기 튜브에서 80% 메탄올의 1 mL와 0.05 g의 약 수를 흔들어.
- 샘플 15 분 동안 2500 x g에서 원심
- 다른 분리기 관으로 상쾌한의 0.5 mL를 플라스틱.
- -18 ° C의 최소한 배설물 샘플 (및 추출 물)을 저장
- FCM19 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one 효소 immunoassay (EIA)18,또는 다른 완전히 유효한 EIA를 사용 하 여 분석 합니다.
- 기준선 FCM 농도 기준으로 FCM 농도의 백분율 변화를 계산 합니다.
6. 무료 탐구 패러다임
- 랙에서 홈 케이지 하 고 24 시간 관찰 기간의 끝에 테이블 표면에 놓습니다.
- 감 금 소의 더 긴 쪽으로 45 °의 각도에서 장에 gridded 케이지 상단 (없이 음식 또는 물 병)를 배치 합니다.
참고: 마우스에 대 한 은신처 역할 둥지를 파괴 하지 않습니다 하지만 둥지 위에 케이지 상단 대각선 배치. - 모니터 또는 비디오 기록 약 1.5 m의 거리에서 10 분 동안 쥐.
- 타이머를 시작 합니다.
- 항상 때 마우스 (케이지 상단에 모든 4 개의 발)와 케이지 위에 올라 또는 케이지 상단 (케이지 바닥에 하나 이상의 발)와 note
참고: 일부 마우스 케이지 상단을 등반 하 고 떠나 감 금 소의 가장자리를 따라 주문 수 있습니다. 일부 마우스는 또한 케이지 상단에 후면. 쥐 감 금 소 위에 아직도 마치 이러한 경우를 처리 합니다.
- 버트 외. 다음 매개 변수를 평가 20.
- 대기 시간 (초)에 첫번째 탐험을 분석 합니다.
- 탐험의 수를 분석 합니다.
- 탐험의 총 기간 (초)을 분석 합니다.
참고: 첫 번째 탐험, 탐험, 낮은 수 및 탐사의 낮은 총 기간에 높은 대기 시간이 높은 특성 불안 수준을 나타낼 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 원래 C57BL/6JRj 마우스 isoflurane 마 취에의 한 경험을 다음의 평가를 개발 (일 분 마 취 세션, n = 13 여성) 또는 반복된 isoflurane 마 취 (6 45 분 마 취 세션 3-4 일 마 취 세션, n = 13 여성) 컨트롤 마우스의 비교 (n = 6 여성)10, 아니 마 취를 받은 하지만 같은 조치에 따라 시험. 우리는 isoflurane 마 취와 반복된 isoflurane 마 취의 치료 되지 않는 통제 쥐에 비해 C57BL/6JRj 마우스에의 한 경험의 영향을 평가. 여기, 여성 C57BL/6JRj 마우스의 대표적인 결과, 일부 데이터를 포함 하 여 이전 출판 Hohlbaum 외. 10, 뿐만 아니라 이전 되지 않은 결과 표시 됩니다.
통계 분석
탐험 데이터 분석 및 정상에 대 한 테스트는 각 매개 변수에 대해 수행 했다. (즉, 제어, 단일 isoflurane 마 취, 반복 isoflurane 마 취 그림 전설에 명시 된 대로 해당 테스트를 사용 하 여 분석 되었다 연구 그룹 간의 차이점. 데이터를 만났을 때 정규 분포 가정, 1 방향 배치법 수행 되었다. 비-일반적으로 분산 된 데이터 Kruskal-월리스-테스트 차이 사용 하 여 분석 되었다 p < 0.05에서 중요 한 고려 되었다.
초기 계획 값
수집 절차를 실시 하기 전에 초기 계획 값이 치료 그룹 각각 매개 변수에서 다른 지 여부를 확인 하려면 중요 합니다. 그림 6, 그림 7, 그림 8, 그림 9 및 그림 10에 표시 된 대로 MGS의 기준선 수준 점수 (p = 0.762, Kruskal-월리스-테스트), 내 같은 고급 동작 (p = 0.896, Kruskal-월리스-테스트)와 중첩 (p = 0.723, Kruskal-월리스-테스트), 음식 섭취 량 (p = 0.398, 1 방향 ANOVA), 홈 케이지 활동 (p = 0.208, Kruskal-월리스-테스트) 그룹 사이 크게 차이가 없. 또한, 초기 FCM 농도에 중요 한 차이가 발견 되었다 (대괄호 [ng/50 밀리 그램] 평균, interquartile 범위: 제어: 123.01 (82.70-193.46), 단일 마 취: 118.31 (101.73-153.54), 반복 된 마 취: 129.55 (92.58-139.48)) (p 0.904, Kruskal-월리스-테스트 =). 기준선 수준에 차이가 발생 하는 경우 델타 값을 계산할 수 있습니다.
마우스 얼굴을 찡 그리기 규모
컨트롤 대 상당한 높은 점수 마 취의 단일 경험 후 발견 된 평균 MGS 점수를 비교 하면 (p = 0.001) 마지막 마 취 세션 반복 후 (p = 0.021) 마지막 마 취 (그림 6A) 후 30 분에 발생 . 마지막 마 취 후 150 분 이상 그룹 간의 차이가 있었다 (p = 0.910).
프로토콜에 설명 된 대로 기준선 MGS 점수는 모든 경우에 0 크거나 사실 고려, MGS 차이 점수 계산 했다. 두 단일 마 취 경험 (p = 0.002) 및 반복 된 마 취 (p = 0.008) 마 취 후 30 분에 컨트롤 대 MGS 차이 점수를 증가. 마지막 마 취 후 150 분, 모든 마우스 제어 수준으로 돌아왔다 (p = 0.617) (그림 6B)10.
내는 행동
마 취는 크게 식품의 무게의 비율을 감소 반복 컨트롤 대 굴에서 제거 하는 쥐를 쥐 똥 (p = 0.036, Kruksal-월리스-테스트) (그림 7)10.
둥지 빌딩 동작
마 취, 반복 된 마 취, 그리고 컨트롤의 단일 경험 사이 둥지 점수에 중요 한 차이가 있었다 (p = 0.240, Kruksal-월리스-테스트) (그림 8)10.
음식 섭취 량
마지막 마 취 후 1 일에서 크게 보였다 반복 된 마 취를 받은 했다 쥐 단일 마 취 경험 했다 쥐와 비교 하는 음식 섭취 량 감소 (p = 0.047, 1 방향 ANOVA). 대조적으로, 1 주일 후, 받은 마우스 반복 마 취 컨트롤 보다 훨씬 더 많은 음식 소비 (p = 0.012, 1 방향 ANOVA) 또는 단일 마 취 받은 쥐 (p = 0.001, 1 방향 ANOVA) (그림 9)10.
홈 케이지 활동
마지막 마 취 후 1 일에서 활동 곡선 아래의 영역에 표시 된 어두운 기간 동안 홈 케이지 활동 크게 차이가 없 단일 마 취, 반복 된 마 취, 또는 제어 치료 받은 쥐 들 (p = 0.498, Kruskal-Wallis-Test) (그림 10)10.
무료 답사 패러다임
모든 마우스 탐험 케이지 상단 때 테스트를 실시 했다. 그러나, 마지막 마 취 후 1 일 받은 마우스 반복 마 취 (대괄호 [s] 평균, interquartile 범위: 78.00 (55.00 89.00)) 컨트롤 보다 훨씬 나중에 시간 케이지 상단을 탐험 (31.00 (18.25 42.75); p = 0.009, Kruskal-Wallis-Test)와 단일 마 취 받은 쥐 (27.00 (21.00-45.50); p = 0.001, Kruskal-월리스-테스트), 이전10출판. 매개 변수 총 기간 탐사 (그림 11A) 및 탐험 (그림 11B)의 수는 첫 번째 탐험에 대기 시간에 유사한. 마 취는 크게 제어 대 탐험의 수를 감소 반복 (p = 0.023, Kruskal-월리스-테스트) 및 탐사의 총 기간 (p = 0.032, Kruskal-월리스-테스트) 마지막 마 취 후 1 일에 단일 마 취 대. 8 일 마지막 마 취, 모든 매개 변수, 즉, 첫 번째 탐험에 대기 시간 후에 (제어: 27.50 (13.50-47.25); 단일 마 취: 18.00 (9.50-38.50), 반복 된 마 취: 20.00 (12.50-42.00); p = 0.722, Kruskal-월리스-테스트), 수 탐험 (p = 0.057), 탐험의 기간 총 고 (p = 0.579), 연구 그룹 (그림 11) 사이 더 이상 달랐다.
지저분한 corticosterone 대사 산물
초기 계획 값 획득, 비율 변경 비례를 고려 하기 위해 초기 계산 및 그룹 간의 중요 한 차이가 나타났다 (p = 0.119, Kruskal-월리스-테스트) (그림 12)10.
그림 1 : 프로토콜의 라인 시간. 회색 및 흰색 색된 필드 어둠을 상징 하 고 각각의 하루, 기간 빛. 절차에 따라이 프로토콜 적용할 수 있습니다. "뚫 으에 habituation" 쥐 내 테스트를 실시 수 있습니다 전에 새 장에 그들의 가정, 뚫으로 플라스틱 물병을 사용 하 여 acclimatized 해야 의미 합니다. B, 기준 값; FCM, 지저분한 corticosterone 대사 산물 이 그림 Hohlbaum 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 요약 점수 시트. 이 시트는 모든 테스트를 포함 하 고 각 개별 마우스에 대 한 밖으로 채워질 수 있다. 테스트를 실시 하는 경우 날짜 및 시간 추가 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 복지의 등급 비늘. 비늘 에서부터 "복지 손상 되지 않는" (녹색) "손상" (레드) 증진과 익스프레스 단순화 된 방법으로 테스트 결과의 의미. 복지에 대 한 지표에 대 한 지식의이 단계에서 우리 각 테스트, 일반적인 계산 서에 대 한 복지의 등급에 명확한 계산 서를 만들 수 없습니다. MGS, 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 관찰 케이지. 이 케이지는 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모 (MGS)에 따라 분석 사진을 내는 동작의 테스트에 사용 됩니다. 장의 앞은 분명 고, 쥐의 털 색에 따라 다른 3 개의 벽 한다 색깔 검은색 또는 흰색 생쥐와 대조. 유리 상자의 바닥 홈 장에서 사용된 침구 물자를 포함 하 여 침구 물자의 약 0.5 c m으로 덮여 있다. 표준 음식과 물을 제공 됩니다. 만약에 가능 하다 면, 그릇 보다는 물병 사용 되어야 한다, 때문에 쥐 소재 침구와 그릇을 채울 수 있습니다. 적어도 30 분의 습관 들 임 기간 후 뚫으 추가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 24 h 관찰 기간. 마우스는 24 h에 대 한 개별적으로 보관 되어 둥지 건물 동작, 홈 케이지 활동, 및 음식 섭취 량을 평가 하 고 지저분한 corticosterone 대사 산물 (FCM)를 측정 하는 분 변 샘플을 수집 하 (유형 III 케이지: 420 mm × 260 × 150 mm; 소재 침구 약 0.5 c m 사용 깊은 위에 흩어져 홈 장에서 소재 침구, 목화 nestlet, 수도 물 및 표준 음식 다이어트 광고 libitum). 적외선 센서는 감 금 소의 정상에 거치 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 마우스 얼굴을 찡 그리기 규모 (MGS). 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 점들은 outliers 1.5-3.0 × IQR 사이의 값을 가진입니다. 컬러 별표는 outliers 3.0 × IQR 보다 큰 값으로. (A) 의미 MGS 점수. (B) 의미 MGS 점수 차이가. p 값 Kruskal-월리스-테스트를 사용 하 여 계산 된: * p < 0.05; * * p < 0.01입니다. 때문에 기술적인 고장 (카메라, 규모), 단일 마 취 그룹에 4 쥐 통계에서 제외 했다. 이 그림 Hohlbaum 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 내는 동작. 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 컬러 별표는 outliers 3.0 × IQR 보다 큰 값으로. p 값 Kruskal-월리스-테스트를 사용 하 여 계산 된: * p < 0.05. 때문에 기술적인 고장 (카메라, 규모), 단일 마 취 그룹에 4 쥐 통계 분석에서 제외 했다. 이 그림 Hohlbaum 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 둥지 빌딩 동작. 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 점들은 outliers 1.5-3.0 × IQR 사이의 값을 가진입니다. p 값 Kruskal-월리스-테스트;를 사용 하 여 계산 된 d, 하루입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 음식 섭취 량. 데이터는 평균 ± 표준 편차. p 값 1 방향 배치법 (post hoc Tukey HSD)를 사용 하 여 계산 된: * p < 0.05; * * p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 : 케이지 활동 홈. 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 점들은 outliers 1.5-3.0 × IQR 사이의 값을 가진입니다. p 값 Kruskal-월리스-테스트를 사용 하 여 계산 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 : 무료 탐구 패러다임. 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 점들은 outliers 1.5-3.0 × IQR 사이의 값을 가진입니다. 컬러 별표는 outliers 3.0 × IQR 보다 큰 값으로. (탐험의 A) 총 기간입니다. (B) 탐험의 수입니다. p 값 Kruskal-월리스-테스트를 사용 하 여 계산 된: * p < 0.05. 이 그림 Hohlbaum 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12 : 지저분한 corticosterone 대사 산물 (FCM). 상자 모서리는 25일 , 75일 사분 위 수, 상자 interquartile 범위 (IQR)를 나타냅니다. 수염 1.5 × IQR 보다 더 큰 값을 나타냅니다. 컬러 별표는 outliers 3.0 × IQR 보다 큰 값으로. 이전에 2 일 및 1 일 절차를 게시 FCM 수준은 측정 했다. 해당 초기 값을 기준으로 FCM 농도의 백분율 변화 [%] 계산 했다. Kruskal-월리스-테스트를 사용 하 여 데이터를 분석 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜은 단일 마 취 또는 반복된 isoflurane 마 취를 받은 C57BL/6JRj 쥐의 평가에 원래 개발 되었다. 결과 확인 고급 동작을 테스트 뿐만 아니라 다른 조치 (예: 자유 탐구 패러다임, MGS, 내 음식 섭취 량) 복지를 평가 하기 위한 중요 한 방법 이었다. 반복된 isoflurane 마 취 특성 불안 관련 행동, MGS, 내 행동에 단기 효과 발생합니다. 또한, 반복된 isoflurane 마 취 영향 음식 섭취10등장.
무료 답사 패러다임 표시 된 감소 된 예비 동작 하 고, 결과적으로, 특성 불안 상부 취 반복 했다 쥐에서와 비교 된 마우스 한 번만 취 컨트롤. 그러나, 모든 그룹의 쥐 gridded 케이지 톱10,20탐험. 불안 관련 문제를 조사할 때 그것은 특성 및 상태 불안21,22사이 구별 하는 것이 중요. 낯선 환경에서 마우스를 배치 상태 불안을 유도 합니다. 대조적으로, 자유 탐구 패러다임 자신의 집 새에 동물 있으며, 따라서, 특성 불안을 조사.
마우스 후 반복 된 마 취 감소 모터 활동에 의해 설명 될 수 없는 가운데 예비 동작에 감소. 어두운 기간 동안 홈 케이지 활동 연구 그룹 간에 크게 다 하지 않았다. 이 마우스 무료 탐구 패러다임 테스트를 수행 하는 경우 마 취에서 회복 이미 물리적으로 했다 나타냅니다.
MGS는 실제로 통증을 평가 하기 위해 개발 되었다 그러나 얼굴 표정 또한 스트레스와 긍정적인 감정을13,23으로 변경 되는 증거가 있다. 마우스 얼굴의 사진 표시 모두 단일 및 반복 isoflurane 마 취 즉시 마 취 후 기간에 단기에 점수는 MGS에 증가 했다. MGS 차이 점수 1 남아, 스트레스 수준의 가벼운10것으로 나타났다. 밀러 그 외 여러분 의 최근 관측 동의 결과 24 , 25 레벨 150 분을 제어를 반환 하는 마우스 마 취10게시물을 보여주었다.
내과 둥지 빌딩 동작 같은 고급 동작 종의 고 복지7 과 쥐26에 좋은 일반적인 건강에 대 한 지표로 사용할 수 있습니다. 그들의 모든 필수 요구 충족 하는 경우 마우스 럭셔리 동작 표시 합니다. 고급 동작을 복지 감소 있다면 먼저 장애인된5,7. 이전 연구 내와 둥지 건물 통증과 고통을6,8, 장애인 수 있습니다 하지만 또한 증거가 hippocampal 병 변 이러한 두 가지 동작이15,27 영향을 미칠 수 있다 , 28 , 29 , 30 , 31.
고급 동작 (동작 내) 초기 후 마 취 기간에서 하 고 다음 날 (둥지 빌딩 동작)의 아침에 의해 조사 되었다. 내는 행동 집사 외. 에서 개발 하 고 Jirkof 그 외 여러분 에 의해 채택에 대 한 테스트 순응 (개별 주택 대신 그룹 주택) 및 행동 측정 (24 h 대신만 2 시간)의 기간 수정 8 , 15 , 16.
그것은 주목할 만한 마 취 감소 내 행동을 반복 하는 웰빙의 장애 즉시 마 취10, Jirkof 그 외 여러분 에 의해 알려졌다 또한이 게시 했습니다 제안 8. 하지만 때 마우스 마 취에서 회복 하기 위해 더 많은 시간을 했다, 다음 날 아침에 그들은 건축 했다 높고 복잡 한 둥지 복지10을 경험 했다. 이러한 결과는 이전 시간32둥지 득점 이전 보고서에서 다. 따라서, 그것은 프로토콜을 이전 시간에에서 둥지를 점수 유용할 수 있습니다. 그러나, 둥지 빌딩 동작의 circadian 리듬 여전히 고려 되어야 한다, 쥐 어두운 단계32의 끝에 그들의 둥지를 준비 하는 경향이.
음식 섭취 량 소폭 반복 된 마 취 후 1 일 감소 했다 하지만 그것은 1 주일 후 증가 했다. 으로 마우스 몸 무게를 잃지 않 았 어 (Hohlbaum 외. 참조 10) 보상 메커니즘의 일종 발생 될 수 있습니다, 하 고 음식 섭취와 관련 하 여 복지의 손상 가벼운10으로 분류 한다. 음식 섭취는 수술 후 고통, 복지 및 수술 후 구역 질26 , 수술 후 스트레스27에 의해 손상 될 수 있습니다 쥐의 식욕에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
FCM는 안정적으로 쥐33,,3435에 스트레스를 나타냅니다. 피크 FCM 농도 일반적으로 8-10 h는 스트레스 후에 발생 하지만18장 통과 시간 따라 달라 집니다. 따라서,이 프로토콜에 포함 되어 홈 케이지 활동 모니터링 결정적 이다. Circadian 리듬 효과 배설된 FCM18에 그것은 24 h. FCM 농도 반사 급성 스트레스를 24 h 후 마 취 기간 동안의 기간 동안 분 변 샘플을 수집 하는 것이 좋습니다. FCM 레벨 개인에 따라 다릅니다, 기준선을 기준으로 FCM 레벨의 백분율 변화 계산 했다. 현재 수 사의 FCM 결과 마 취에의 한 경험 없으며 반복 된 마 취 크게 hypothalamic-뇌 하 수 체-부 신 (HPA) 축 활동10증가 표시.
모두 모두, 결과 반복 isoflurane 마 취 단기 가벼운 조 난 발생과 복지 isoflurane 마 취10의 단일 경험 했던 것 보다 약간 더 이른 postanesthetic 기간에서 밝혔다.
복지를 평가 하기 위해 프로토콜 추가 조 난 동물에 부과 하지 해야 합니다. 현재의 프로토콜의 한계는 플라즈마 corticosterone 레벨36증가 알려져 24 시간 관찰 기간 동안 개별 주택 포함 이다. 그러나, 개별 주택 홈 케이지 활동, 음식 섭취, 둥지 빌딩 동작 및 FCM 레벨 개인에 대 한 유효한 데이터를 수집할 필요가 있다. 개별 주택 기간 그 4 개의 매개 변수 (즉, 24 h 관찰 기간) 동시에 조사 함으로써 최소화 했다. 결과 개별 주택에 의해 좌우 되지 않도록 하려면 컨트롤 마우스 같은 테스트를 받았다 하 고 그들의 결과 고려 했다. 메서드 그룹 주거 환경에 이러한 매개 변수를 측정할 수 있다면, 그들은 사용 (예:홈 케이지 활동37 와 음식 섭취 량에 대 한 자동된 홈 케이지 분석 시스템) 이어야 한다. 그러나, 자동화 된 홈 케이지 분석 시스템 추가 장비를 사용할 수 없습니다 필요 합니다. 연구 개인 대신 동물의 그룹에 초점을 맞추고, 홈 케이지 활동, 음식 섭취, 둥지 빌딩 동작, 그리고 FCM 수준 또한 쥐의 그룹에 대 한 평가 될 수 있습니다. 그들은 구별 될 수 있도록 눈에 띄게 표시 하 쥐만 필요 무료 탐구 패러다임 마찬가지 다. 그룹에 복지를 감소 하는 경우 그룹에 있는 모든 쥐를 신중 하 게 확인 한다 (를 사용 하 여 점수 시트 및 임상 시험) 마우스 또는 마우스 식별 하 우려. 그룹 수준에서 더 관측 그룹 값의 감도 결정 하기 위해 필요 합니다.
구체화, 관련이 프로토콜에 맞게 고 쥐의 복지에 특정 절차의 영향을 평가 하기 위해 지속적인 연구에 통합 될 수 있습니다. 특정 절차 및 연구 설계에 따라이 프로토콜에서 가장 적합 한 테스트를 선택 합니다. 여기, 내과 둥지 건물 테스트, MGS, 무료 탐구 패러다임 및 음식 섭취 량의 측정 특히 도움이 될 것 처럼 보였다. 마우스의 동작 circadian 리듬38다음과 같이, 그것은 정의 시간 지점에서 모든 그룹의 쥐에 행동 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다. 마우스는38오후에서 보다 아침에 더 활동적이 다. 그러나, 연구 설계는 아침에 테스트를 위해 허용 하지 않는 경우 다른 시간에 테스트 할 수 있습니다. 그것은 또한 모든 그룹에 대 한 동일한 시간 포인트에 각 단일 테스트를 수행 하는 하는 것이 중요입니다. 그렇지 않으면, 매개 변수의 circadian 리듬의 영향 내부-또는 intergroup 차이가 발생할 수 있습니다. 또한, 컨트롤 마우스 치료 쥐 및 제어 마우스에서 결과 비교할 수 있도록 연구에 포함 되어야 합니다. 컨트롤 마우스 치료 쥐 같은 시간 지점에서 테스트 되어야 한다. 프로토콜 보여주는 그 복지 장애인, 경우 절차 세련 된, 그리고 프로토콜 반복 합니다. 이 이렇게 절차를 수정 하기 위해 노력 했다 효과적인 여부를 표시할 수 있습니다.
현재 프로토콜 심각도 프로시저에 의해 발생의 정도 추정 하는 일반적인 보조 될 수 있습니다. 따라서, 과학 및 동물-중심 수준에 절차의 엄격을 분류 도움이 됩니다. 그러나, 프로토콜 가벼운, 중간, 또는 심각한 절차를 분류 하기 위한 규모를 제공 하지 않습니다. 프로시저의 심각도 분류, 그것은 예제에 부속 서 VIII의 EU 지침 2010/63을 참조 하는 데 필요한.
결론적으로, 현재 프로토콜 쥐에 과학, 동물 중심의 방식으로 절차는 전신 마 취는 웰빙의 체계적인 평가 지원 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
샘플 컬렉션,에 디스 Klobetz-Rassam FCM의 분석에 대 한 지원에 대 한 Sabine 제이콥스 감사 PD 박사 중견 기업 수 의사. habil입니다. 통계 분석을 위한 Roswitha Merle 그리고 Wiebke Gentner 원고를 교정에 대 한. 연구의 일부인 베를린-브란덴부르크 연구 플랫폼 BB3R (www.bb3r.de)와 독일 연방 교육부의 연구에 의해 투자 되었다 (허가 번호: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluran | CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH | 1214 | |
| InfraMot - Sensore Units | TSE Systems | 302015-SENS | |
| InfraMot - Control Units | TSE Systems | 302015-C/16 | |
| InfraMot - Software | TSE Systems | 302015-S | |
| Nestlet N | Ancare - Plexx | NES3600 | |
| Camera EOS 350D | Canon |
References
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