Summary
Мы разработали протокол для оценки благосостояния в мышей во время процедур с использованием общей анестезии. Серия поведенческие параметры, указывающие такого уровня благосостояния, а также были проанализированы глюкокортикоидных метаболитов. Протокол может служить общей помощи для оценки степени тяжести на основе научных, ориентированный на животных.
Abstract
В соответствии с 3R принцип (замена, сокращения, уточнения) разработан Рассел и Берч научные исследования следует использовать альтернативные экспериментов на животных всякий раз, когда это возможно. Когда нет альтернативы экспериментов на животных, общее количество лабораторных животных, используемых должно быть минимум, который необходим для получения ценных данных. Кроме того соответствующие уточнения меры должны применяться к минимуму боль, страдания и бедствия, сопровождающих экспериментальной процедуры. Категории используются для классификации степени боль, страдания и бедствия являются не восстановления, легкой, умеренной или тяжелой (директива ЕС 2010/63). Чтобы определить, какие категории применяются в отдельных случаях, крайне важно использовать научно обоснованных инструменты.
Протокол хорошо быть оценки, представленные здесь предназначен для процедуры, в ходе которых используется общая анестезия. Протокол посвящен дома Кейдж активность, мыши гримаса масштаба и роскошь поведения, например роющих и гнездо строительство поведение как показатели благосостояния. Он также использует бесплатный исследовательские парадигмы для поведения связанных с тревоги черта. Фекальный кортикостерона метаболиты как показатели острого стресса измеряются в течение 24-h после анестезии.
Протокол обеспечивает научно достоверной информации на благосостояние мышей после общей анестезии. Благодаря своей простоте протокол могут быть легко адаптированы и интегрированы в рамках планируемого исследования. Хотя он не обеспечивает шкалу для классификации бедствия в категории согласно директиве ЕС 2010/63, это может помочь исследователям оценить степень тяжести процедуры с использованием научно обоснованных данных. Она предоставляет способ для улучшения оценки благополучия на основе научных, ориентированный на животных.
Introduction
ЕС Директива 2010/631 предусматривается, что принцип 3R (замена, сокращения, уточнения), разработанный Рассел и Берч2 применяться всякий раз, когда необходим экспериментов на животных. Конечная цель директивы ЕС прекратить все испытания на животных, но Директива признает, что в настоящее время, некоторые эксперименты на животных по-прежнему необходимы для проведения исследований, которые будут защищать здоровье человека и животных. Таким образом если эксперимент животных не может быть заменен любым альтернативным методом, только минимальное количество лабораторных животных должен использоваться для получения надежных результатов. Кроме того количество боли, страдания и бедствия, сопровождающих экспериментальной процедуры следует минимизировать с помощью мер соответствующие уточнения. ЕС Директива 2010/63 предусматривается, что тяжесть процедура должна проспективно классифицируются как без рекуперации, легкой, умеренной или тяжелой1. Как серьезности классификации решается на основе case-by-case, важно иметь научно обоснованных инструменты для оценки серьезности данной процедуры.
Оценка листы, предложенный Мортон и Гриффит3 являются важным инструментом для выявления любых отклонений от нормального состояния, включая негативное воздействие на благополучие4. Оценка листы используются для определения ретроспективно боль, страдания, и страдания, вызванные эксперимент и сосредоточиться на видимых изменений в физическое состояние отдельных животных (например, массы тела, мех, походка). Хотя приложение VIII директивы ЕС 2010/63 приводятся примеры по каждой категории тяжести, исследователи до сих пор отсутствие инструментов для оценки степени тяжести данной процедуры с использованием научно базе данных.
Отсутствие показателей, показаны негативные благосостояния не является единственным способом для определения состояния животного; наличие показателей, указывающих позитивные благополучия является также важным5,6,,78. Например животные отображения поведения роскоши, как роющих и гнездятся здание поведение только тогда, когда их основных потребностей. Если снижается благосостояние, роскошь поведения являются первыми снижаться5,7. Протоколы для использования в оценке благосостояния должно включать показатели, указывая на физической, физиологической/биохимических и психологической государствам животных с целью оценить их благополучие в подробной и всеобъемлющей основе9.
В контексте изысканности протокол был разработан для удовлетворения этих требований и оценить последствия процедуры, связанные с общей анестезии на благосостояние мышей10. В то же время цель заключалась в том, чтобы свести к минимуму любой дополнительной нагрузки возможность легкой интеграции протокола в данный эксперимент. Протокол считает, роющих поведение, поведение дома Кейдж как активность, прием пищи и вложенности и поведение связанных с тревоги черта. Кроме того она включает в себя мыши шкала гримаса (MGS) и неинвазивного анализа метаболитов кортикостерона в фекалиях. Протокол предназначен для облегчения оценки благосостояния на основе научного и ориентированного на животных и предоставлять информацию о благосостояния, который поддерживает классификации степени тяжести. В дополнение к Оценка листы он может дать полезную информацию для классификации тяжести процедуры. Поскольку протокол легко осуществить и не требует обширных оборудования, его можно интегрировать в текущего эксперимента без влияния на результаты исследования. Следует отметить, что исследования животных: отчетность о в Vivo экспериментов (прибытие) Руководящий принцип11 является соблюдаться во всех исследованиях, касающихся экспериментов на животных, с целью улучшения проектирования, анализа и отчетности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось согласно руководящим принципам, сформулированным законом немецкого животного благосостояния и был одобрен государственной власти Берлина («Шведским für Gesundheit und сферы», номер: G0053/15).
Примечание: Основная цель этого протокола был исследовать влияние повторных анестезии на глюкокортикоидных метаболитов. Пример расчета размера была проведена, чтобы определить количество животных, которые будут использоваться: n ≥ 2 × (s/мкг1-2мкг)2 × (zα +βz)2. 1мкг - мкг2 является разница между средств населения, мощности и выборки производятся расчеты размера (α = 5%, β = 80%); zα =β 1,96 и z = 0,84 являются квантилей стандартного нормального распределения. Рисунок 1 иллюстрирует линии времени настоящего Протокола. Если параметр протокола показывает разницу с уровнем управления, следует тщательно контролировать животное, и параметр должна быть измерена снова после подходящий период. Например если поведение связанных с тревогой черта увеличивается, это поведение должны испытываться снова неделю спустя, с тем чтобы помочь определить период до полного восстановления. Моменты времени и периодов, определенное в этом протоколе могут быть адаптированы для использования с другими процедурами. При изменении времени точек, привыкания периодов должны храниться, как описано в протоколе. Чтобы уменьшить факторы, которые могут повлиять на поведение мышей, тестов, требующих более манипуляции должны проводиться после тестов, которые не нарушают нормальное поведение мышей. Рисунок 2 обобщает все тесты протокола с использованием скоринга лист сводки. Рисунок 3 обеспечивает упрощенный шкал уровня благосостояния, которые дают общее представление о том, как интерпретировать результаты теста.
1. habituating мышей для обработки, экспериментатор
- Разрешить мышей, чтобы приучать животное фонду для по крайней мере 2 недель после того, как они были получены из другого объекта или поставщика.
- Дом мышей в группах и поддерживать их в стандартных условиях (комнатной температуре 22 ± 2 ° C, относительная влажность 55 ± 10%), на свет: темные цикл 12:12 ч.
- Предоставлять все группы с туннель и хлопок nestlets как стандартные обогащения и предоставления продовольствия и воды ad libitum.
- Приучать всех мышей в туннель и/или обработки по крайней мере за неделю до тестирования12Кубка.
Примечание: Собирание мышей за хвост может вызвать стресса или тревоги, который в свою очередь влияет на благосостояние и также влияет на результаты этого протокола12.
2. Подготовка поведенческого тестирования номер и аппараты
Примечание: Предоставляют отдельную комнату для тестирования, в идеале около комнаты, где содержатся животные. Перед процедурой проводится транспорт мышей в их дома клетки для тестирования номер по крайней мере 60 мин. Если это возможно проведите все испытания этого протокола в той же комнате тестирования, где осуществляется процедура.
- Подготовка каркаса наблюдения для проверки они самые поведение8 и принимать фотографии для использования в MGS13 (рис. 4).
- Используйте стеклянный ящик с площадью около 220 мм х 290 мм и высотой 390 мм.
- Покрыть пол это поле с примерно 0,5 см залегания материала.
- Точечная диаграмма горсть материала используется постельные принадлежности из дома клетки на вершине новый материал постельных принадлежностей для уменьшения страданий, вызванных новой среды.
- Дают пищу, такую же, который обычно поставляется как диетические и вода.
Примечание: если возможно, используйте бутылки воды, потому что мышей может заполнить водой чаши с постельных материалов.
- Подготовка клетки (тип III: 420 × 260 мм × 150 мм) за период 24-h наблюдений, для которого мышей размещаются отдельно (Рисунок 5).
Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму продолжительность индивидуального жилья, сбор данных для гнезда, здание поведение и дома Кейдж активность, потребление пищи, фекальные кортикостерона метаболитов (FCM) в этот период.- Место новыми постельными принадлежностями материал в клетке (примерно 0,5 см в глубину) и разброс горсть используется на кроватях материала без фекалии из дома клетки над новым материалом, с тем чтобы уменьшить страдания.
- Обеспечивают стандартизированные квадратных хлопок nestlet определенного веса, как экологическая обогащению, только (см. таблицу материалов)14.
Примечание: Коммерческие nestlets могут отличаться в весе. Таким образом мы вес nestlet, характеризуется диакон и используется 2.0 g вместо 2.7 g14. - Маунт инфракрасный датчик на верхней части клетки, при использовании инфракрасного датчика для измерения активности дома клетки (см. таблицу материалов).
- Дают пищу, такую же, который обычно поставляется как диеты, и вода ad libitum.
3. мыши гримаса шкала
Примечание: Фотографии для MGS принимаются в клетке наблюдения в трех точках времени: (i) 2 дня до процедуры записи исходных уровней MGS, (ii) 30 мин после процедуры и (iii) 150 мин после процедуры. Когда благосостояния людей с дефектами зрения, увеличение баллов на MGS. Если после 150 мин по-прежнему наблюдаются увеличение MGS оценки, принять дополнительные фотографии на более позднем этапе.
- Используйте камеру высокой четкости для фотографии.
- Аккуратно передача мышь в клетку наблюдения и позволяет мыши, чтобы приучать к новой среды для по крайней мере 30 минут.
- Непрерывно займет около 30-40 фотографий для каждой точки в течение 1-2 мин.
- Сортировать все фотографии, выбрав резкий фотографии фронтальной или боковой и отбрасывая размытые фотографии или фотографии, которые показывают мыши лица с других точек зрения, чем фронтальной или боковой вид.
- Случайным образом выберите одну фотографию из каждый момент, (т.е. за 2 дня до процедуры, 30 мин после процедуры и 150 мин после процедуры) для каждой мыши.
- Обрезка фотографии для отображения только глава мыши, так что положение тела не видно13.
- Создайте файл электронной таблицы с один лист для каждой фотографии и добавьте таблицу, включая пять единиц лица действий MGS для каждого листа.
Примечание: Файл содержит базовые фотографии, а также фотографии процедуры post. - Случайный порядок листов.
- Представляет файл на экране компьютера для трех независимых лиц, которые ранее были обучены использовать MGS, разработанная Лангфорд et al. и их оценка лица действий подразделений, с использованием 3-балльной шкале (0 = нет, 1 = умеренно настоящее, 2 = очевидно настоящее время).
Примечание: Скоринг основывается на следующие параметры13: Орбиталь, затянув («сужение области орбиты, с плотно закрытой веко или сжать глаз»); носа горб («закругленный расширение кожи виден на переносице»); щека выступ («выпуклый внешний вид мышцы щек»); положение уха («уши вытащил друг от друга и обратно от их базового положения или показывая вертикальных гряд этой формы благодаря Советы ушей изображаемого обратно»); столбик изменения («движения усов от их базовых позиции либо назад, против лица или вперед, как будто стоял на конце; усы могут также собираться вместе»). - Анализировать результаты, следующим образом (адаптировано из Лангфорд et al. 13).
- Среднее всех единиц лица действий для каждой фотографии для создания Оценка MGS.
Примечание: Если не быть забил один из лицевого действий подразделений, среднее оставшиеся единицы лица действий. - Вычтите среднее для исходных фотографий от среднего для процедуры post фотографии получить MGS разница баллов для каждой мыши.
- Тест на различия в MGS баллы разница между лицами (непараметрический тест для соответствующих образцов).
Примечание: Если существует значительная разница (p < 0,05), определите, отличаются ли десятки все фотографии или только десятки нескольких фотографий между людьми. Если верно, повторите, забив этих фотографий. В противном случае лица должны повторять MGS обучения и затем снова Оценка фотографии. - Средняя разница баллов MGS полученные от различных бомбардиров для каждой мыши, если результаты всех лиц существенно не отличаются.
- Используйте непараметрические статистические испытания для сравнения MGS разница баллов в среднем между группами исследования.
- Среднее всех единиц лица действий для каждой фотографии для создания Оценка MGS.
4. роющих поведение8,,1516
- Подготовьте норы, поместив 140 ± 2 g питания окатыши обычно поставляются как диета в стандартные непрозрачные пластиковые бутылки воды (250 мл, длина 150 мм, диаметр 55 мм, 45 мм диаметр горлышка бутылки)8.
Примечание: Как мыши предпочитают большой трубы, норы с диаметром 68 мм может использоваться как описано диакон16. - Место нору заполнены с гранул пищи дома клетке за 5 дней до процедуры для акклиматизации.
Примечание: Регулярные подразделения для подачи пищи в клетке не должен быть пустым, но также должны оставаться наполнен питания окатыши, как мыши используются для этого. - Проводить испытания дважды, за 2 дня до процедуры (базовый уровень); выполнения последней процедуры post 30 мин также.
- Пусть мыши приучать для по крайней мере 30 минут, чтобы клетка наблюдения, где были сделаны фотографии для MGS.
- Поместите пластиковую бутылку воды, наполнен питания окатыши параллельно к задней стенке клетки наблюдения.
- Весят питания окатыши (g) оставшиеся в нору после 2 ч.
- Рассчитайте вес пищи окатышей, удалены из норы мышами относительно первоначального веса (%).
5. 24-h период наблюдений
Примечание: Мышей размещаются отдельно, как описано в 2.2. (Рис. 5), в течение 24 ч, для того чтобы измерить пищи потребление, деятельность дома Кейдж, гнездятся здание поведение и ТСМ уровнях. 24-h наблюдение проводится дважды: (i) на 2 дня до процедуры для базовых уровней, (ii) в день процедуры.
-
Потребление пищи
- Весят мышей на регулярной основе (например 2 дней до анестезии, непосредственно перед наркозом, через 2 дня после анестезии и неделю после анестезии), с тем чтобы оценить любые изменения веса тела (часть листа, оценка).
Примечание: Вес тела требуется рассчитать потребление пищи на грамм веса тела. Потребление воды также может быть измерена в период 24-h наблюдения. Если снижается потребление пищи, благополучия может быть нарушением. - Определите начальный вес стандартных пищевой рацион (грамм) в группе продовольствия клетки (около 100 г).
- Определите вес стандартных питание в конце периода наблюдения 24-h.
- Сканировать в клетке сторону под блоком питания тщательно для разлива пищевой и добавить любое дополнительное питание окатышей, нашли веса гранул пищи, оставшиеся в блоке питания.
- Рассчитайте потребление пищи на единицу массы тела.
- Весят мышей на регулярной основе (например 2 дней до анестезии, непосредственно перед наркозом, через 2 дня после анестезии и неделю после анестезии), с тем чтобы оценить любые изменения веса тела (часть листа, оценка).
-
Главная клетка активность
Примечание: Приведенные ниже инструкции относятся к использования инфракрасного датчика (см. таблицу материалов), но дома Кейдж активности может также оцениваться с альтернативными программами. Отклонение дома Кейдж деятельности от уровней управления (например гипоактивность, гиперактивность) может быть признаком благополучия с дефектами зрения.- Запустите программу.
- Выберите интервал выборки 1 мин и приобретение время 24 часа, что означает, что импульсы записываются каждую минуту в течение 24 ч.
Примечание: Если экспериментатор входит в комнату несколько раз после начала записи, использовать только данные за периоды, когда мышей не было нарушено (т.е. в темный период). - Сумма до 10 мин интервалов импульсов.
- Вычислите площадь под кривой времени (импульсы × мин).
-
Гнездо здание поведение
Примечание: Комплекс и высокой гнезда может служить показателем благосостояния.- Место nestlet квадратный хлопка (см. Таблицу материалы) с определенным весом (например 2.0 g) в середине клетке.
- Оценка гнездо по 5-балльной шкале (см. ниже) согласно диакон14 следующим утром, примерно в 2 ч после того, как загорится. Взвесьте любой части untorn nestlet, которые по крайней мере 5% от веса первоначального nestlet. Оценка гнезда следующим14
- Назначьте Оценка «1», если 90% nestlet нетронутыми.
- Назначьте Оценка «2», если это 50-90% нетронутыми.
- Назначить Оценка «3», если измельченные 50-90% nestlet.
- Назначить Оценка «4», если более чем 90% измельченных, но гнездо плоский, и менее 50% его окружности выше, чем высота тела мыши при свернувшись калачиком.
- Назначить Оценка «5», если больше чем 90% nestlet измельчается и гнездо высок, и более чем 50% его окружности выше, чем высота тела свернувшись калачиком мыши.
-
Фекальный кортикостерона метаболитов
Примечание: Увеличение ТСМ выше уровня управления отражают уровни острого стресса в течение длительной 24-h.- Собрать все сухие фекальные пеллеты из клетки, используя пинцет в конце периода наблюдения 24-h и ликвидировать влажных гранул, загрязненных с мочой.
- Извлечения ТСМ согласно Palme и др. 17, как показано ниже.
- Сухих фекальных проб при температуре 60-70 ° C.
- Однородный фекальных образцы с использованием минометов.
- Встряхните Алиготе 0,05 г с 1 мл раствора 80% метанола в пластиковых пробирок для 30 мин на Мульти-вортекс.
- Центрифугуйте образцы на 2500 g x 15 мин.
- Пипетка 0,5 мл супернатант в другую трубу центрифуги.
- Хранить образцы фекалий (и экстрактов) как минимум до-18 ° C.
- Анализируйте ТСМ с помощью иммуноферментного анализа (ОВОС)18,5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one фермента19 или другой полностью проверенных ОВОС.
- Вычислите процентное изменение концентраций ТСМ относительно концентрации исходных ТСМ.
6. свободные исследовательские парадигмы
- Возьмите домой клетку из стойки и поместите его на поверхность стола в конце периода наблюдения 24-h.
- Место по квадратам сетки клетке сверху (без пищи и воды бутылки) в клетке под углом 45° к больше стороне клетки.
Примечание: Не уничтожить гнездо, который служит укрытием для мыши, но место верхней клетку по диагонали выше гнезда. - Монитор или видео записи мышей за 10 мин на расстоянии около 1,5 м.
- Запустите таймер.
- Обратите внимание на все времена, когда мышь поднимается на вершину Кейдж (с все четыре лапы на верхней части клетки) или покидает клетку верхней (с одной или нескольких лапы на дне клетки).
Примечание: Некоторые мышей может подняться на вершину клетке и оставить его для того, чтобы ходить вдоль края клетки. Некоторые мыши также сзади на верхней части клетки. Рассматривать эти случаи, как будто еще на верхней части клетки мышей.
- Оценки параметров после Берт и др. 20.
- Анализируйте задержки первого исследования (в секундах).
- Анализируйте количество исследования.
- Анализируйте общая продолжительность (в секундах) разведки.
Примечание: Высокую задержку первого исследования, лишь небольшое число исследований и низкая общая продолжительность исследования можно указать более высокий уровень тревоги черта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был разработан для оценки благосостояния мышей C57BL/6JRj после одного опыта изофлюрановая анестезии (одна сессия 45-мин анестезии, n = 13 женщин) или повторных изофлюрановая анестезии (шесть 45-мин анестезии сессий с 3-4 дня между сессиями анестезии, n = 13 женщин) по сравнению с благополучием управления мышей (n = 6 сук)10, который получил без анестезии, но были протестированы в соответствии с теми же мерами. Мы оценивали влияние одного опыта изофлюрановая анестезии и неоднократно изофлюрановая анестезии на благосостояние мышей C57BL/6JRj, по сравнению с необработанными управления мышей. Здесь представителя результаты самок мышей C57BL/6JRj, включая некоторые данные ранее опубликована в Hohlbaum и др. 10, а также ранее неопубликованные результаты показываются.
Статистический анализ
Для каждого параметра выполнялись исследовательский данных анализа и испытаний для нормальной жизни. Различия между группами исследования (то есть контроль, один изофлюрановая анестезии, повторил изофлюрановая анестезии были проанализированы с использованием соответствующих испытаний, как указано в рисунке легенды. При данных предположений нормальности, было проведено 1-способ ANOVA. Non нормально распределенных данных были проанализированы с использованием Крускала-Уоллиса-Test. различия были значительными на p < 0,05.
Базовые значения
Базовые значения, собранные перед тем, как осуществляется процедура, необходимо определить, отличаются ли лечение групп в соответствующих параметров. Как показано на рисунке 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9 и 10, оценка базовых уровнях МГС (p = 0.762, Крускала-Уоллиса), роскошные поведение как роющих (p = 0.896, Крускала-Уоллиса) и вложенности (p = 0,723, Крускала-Уоллиса), приема пищи (p = 0.398, 1-полосная ANOVA) и дома Кейдж активность (p = 0.208, Крускала-Уоллиса) значительно не отличались между группами. Кроме того, никаких существенных различий в базовых ТСМ концентрации были обнаружены (медиана, межквартильный диапазон в скобках [нг/50 мг]: управления: 123.01 (82.70-193.46); один анестезии: 118.31 (101.73-153.54); неоднократные анестезии: 129.55 (92.58-139.48)) (p = 0.904, Крускала Уоллиса). Если наблюдаются различия в базовых уровнях, дельта значения можно вычислить.
Мыши гримаса шкала
При сравнении средних баллов MGS, значительное более высокие оценки по сравнению с элемента управления были найдены после одного опыта анестезии (p = 0,001) и после последнего повторного наркоза сессии (p = 0,021) вызвало в 30 мин после последнего анестезии (рис. 6A) . В 150 мин после последнего анестезии, больше не было различия между группами (p = 0.910).
Принять во внимание тот факт, что базовый MGS баллы не равны 0 во всех случаях, оценка MGS разница была рассчитана, как описано в протоколе. Оба сингла опыт анестезии (p = 0,002) и неоднократные анестезии (p = 0,008) увеличилась разница баллов MGS против управления на 30 мин после анестезии. На 150 мин после последнего анестезии, всех мышей вернулись к уровням управления (p = 0,617) (Рисунок 6B)10.
Роющих поведение
Повторил анестезии значительно сократить процент от веса пищи гранулы мышей, удалены из норы против управления (p = 0,036, Kruksal-Уоллиса) (рис. 7)10.
Гнездо здание поведение
Без значимых различий в гнездо счеты между один опыт анестезии, неоднократные анестезии и контроля (p = 0.240, Kruksal-Уоллиса) (рис. 8)10.
Потребление пищи
На 1 день после последнего анестезии, мышей, которые претерпели неоднократные анестезии, показали значительно сократить потребление пищи, по сравнению с мышами, которые пережили один анестезии (p = 0.047, 1-полосная ANOVA). В отличие от этого, неделю спустя, мышей, которые получили повторил анестезии потребляются значительно больше пищи, чем элементы управления (p = 0,012, 1-полосная ANOVA) или мышей, которые получил один анестезии (p = 0,001, 1-полосная ANOVA) (рис. 9)10.
Главная клетка активность
На 1 день после последнего анестезии, деятельность дома Кейдж в темный период, указывается площадь под кривой активности, не отличаются значительно среди мышей, которые получил один анестезии, неоднократные анестезии или контроль лечения (p = 0.498, Kruskal-Wallis-Test) (рис. 10)10.
Бесплатные исследовательские парадигмы
Все мышей изучена верхней клетке, когда тест был проведен. Однако, 1 день после последнего анестезии, мышей, которые получили повторил анестезии (медиана, межквартильный диапазон в скобках [s]: 78.00 (55.00-89.00)) исследовал верхней клетке значительно позже, чем элементы управления (31.00 (18.25-42,75); p = 0,009, Kruskal-Wallis-Test) и мышей, которые получил один анестезии (27.00 (21.00-45.50); p = 0,001, Крускала-Уоллиса), как ранее опубликована10. Общая продолжительность исследования (рис. 11А) и количество исследования (рис. 11B) параметры аналогичны задержку первого исследования. Повторил анестезии значительно сократили количество исследования по сравнению с контролем (p = 0,023, Крускала-Уоллиса) и общая продолжительность исследования (p = 0,032, Крускала-Уоллиса) против одного анестезии на 1 день после последнего анестезии. На 8 дней после последнего анестезии, все параметры, то есть задержка первого исследования (управления: 27.50 (13,50-47.25); один анестезии: 18.00 (9.50-38,50); неоднократные анестезии: 20.00 (12.50-42.00); p = 0.722, Крускала-Уоллиса), количество исследования (p = 0,057), и общая продолжительность исследования (p = 0.579), больше не отличались между группами исследования (рис. 11).
Фекальный кортикостерона метаболитов
Для того, чтобы учитывать базовые значения получены, относительно изменения процент рассчитывался базовых и статистически значимых различий между группами были найдены (p = 0.119, Крускала-Уоллиса) (Рисунок 12)10.
Рисунок 1 : Время линия протокола. Серый и белый цветные поля символизируют темно и свет периодов дня, соответственно. В зависимости от процедуры этот протокол может быть адаптированы. «Привыкания к норе» означает, что мышей должны быть акклиматизированы в используя пластиковую бутылку воды в качестве норе в клетке, их дома, прежде чем они самые испытание может проводиться. B, базовое значение; FCM, фекальные кортикостерона метаболитов. Этот показатель был изменен с Hohlbaum и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Лист сводки скоринга. Этот лист включает в себя все тесты и может быть заполнена для каждого индивидуального мыши. Дата и время должны быть добавлены когда испытания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Весы степени благополучия. Весы диапазоне от «благополучие unimpaired» (зеленый цвет) до «благополучие нарушениями» (красный) и выразить смысл результатов тестирования в упрощенном виде. На данном этапе знаний о показателях благосостояния мы не может сделать определенное заявление на уровень благосостояния для каждого теста, только общее заявление. MGS, мыши гримаса шкала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Наблюдения Кейдж. Эта клетка используется для испытания роющих поведение и принимать фотографии для анализа согласно шкале гримаса мыши (MGS). Ясно передней части клетки, и, в зависимости от цвета шерсти мышей, другие три стены должны быть цветными, черный или белый контраст с мышей. Пол стеклянный ящик покрыт примерно 0,5 см на кроватях материала, включая материал используется постельные принадлежности из дома клетки. Гостям предоставляются стандартные пищи и воды. Если возможно бутылки с водой, вместо того, чтобы шары должны использоваться, потому что мышей может заполнить чаши с постельных материалов. После периода привыкания по крайней мере 30 минут добавляется норы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : период наблюдения 24-ч. Для оценки гнездо строительство поведение, дома Кейдж активности и потребления пищи и для сбора фекальных пробах для определения фекальных кортикостерона метаболитов (FCM), мышей размещаются отдельно для 24 h (клетки типа III: 420 × 260 мм × 150 мм; постельных материалов примерно 0,5 см в глубину с используемым постельных материалов из дома клетки рассеяны на вершине, хлопок nestlet, водопроводной воды и стандартное питание диета ad libitum). Инфракрасный датчик устанавливается на верхней части клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Мышь гримаса масштаба (MGS). Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Точки являются выбросы с значениями между × 1,5-3,0 икр. Разноцветные звездочки, останцы со значениями больше 3.0 × икр. (A) означает MGS оценка. (B) означает MGS разница оценка. p значения были рассчитаны с использованием Крускала-Уоллиса: * p < 0,05; ** p < 0.01. Из-за технической неисправности (камеры, масштаб) четыре мыши в группе одного анестезии пришлось исключить из статистики. Этот показатель был изменен с Hohlbaum и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Роющих поведение. Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Разноцветные звездочки, останцы со значениями больше 3.0 × икр. p значения были рассчитаны с использованием Крускала-Уоллиса: * p < 0,05. Из-за технической неисправности (камеры, масштаб) четыре мыши в группе одного анестезии пришлось исключить из статистического анализа. Этот показатель был изменен с Hohlbaum и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Гнездо, здание поведение. Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Точки являются выбросы с значениями между × 1,5-3,0 икр. p значения были рассчитаны с использованием Крускала-Уоллиса; d, день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Потребление пищи. Данные являются среднее ± стандартное отклонение. p значения были рассчитаны с использованием 1-полосная ANOVA (пост hoc Тьюки-HSD): * p < 0,05; ** p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10 : Главная деятельность Кейдж. Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Точки являются выбросы с значениями между × 1,5-3,0 икр. p значения были рассчитаны с использованием Крускала-Уоллиса-Test. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11 : Бесплатные исследовательские парадигмы. Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Точки являются выбросы с значениями между × 1,5-3,0 икр. Разноцветные звездочки, останцы со значениями больше 3.0 × икр. (A) общая продолжительность исследования. (B) количество исследования. p значения были рассчитаны с использованием Крускала-Уоллиса: * p < 0,05. Этот показатель был изменен с Hohlbaum и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12 : Фекальные кортикостерона метаболитов (FCM). Поле представляет межквартильный диапазон (ИКР), края коробки 25-й и 75-й квартиль. Усы представляют значения, которые являются не более чем 1,5 × икр. Разноцветные звездочки, останцы со значениями больше 3.0 × икр. FCM уровни были измерены 2 дней до и 1 день пост процедуры. Изменения в процентах [%] ТСМ концентрации по отношению к значению соответствующих базовых были рассчитаны. Данные были проанализированы с помощью Крускала-Уоллиса-Test. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол был разработан для оценки благосостояния мышей C57BL/6JRj, которые получили либо один анестезия или повторных изофлюрановая. Результаты подтверждают, что испытания поведения класса люкс, а также другие меры (например бесплатный исследовательские парадигмы, MGS, они самые пищи) были чувствительных методов для оценки благосостояния. Неоднократно изофлюрановая анестезия причиной краткосрочное воздействие на черта тревоги, связанные с поведением, MGS и они самые поведение. Кроме того неоднократно изофлюрановая анестезии, как представляется, влияют на потребление продуктов питания10.
Бесплатные исследовательские парадигмы указано снижение произвольного поведения, и, следовательно, более высокий уровень тревожности черта в мышей, которые были неоднократно под наркозом по сравнению с мышей, под наркозом только один раз и элементы управления. Однако мыши всех групп изучить сетчатая Кейдж Топ10,20. При расследовании связанных с тревоги поведение, важно проводить различие между черта и состояние тревожности21,22. Поместив указатель мыши в незнакомой среде вызывает состояние тревоги. В противоположность этому бесплатно исследовательские парадигмы позволяет животных, чтобы остаться в их дома клеток и, таким образом, расследует тревоги черта.
Сокращение произвольного поведения среди мышей после неоднократных анестезии нельзя объяснить снижение двигательной активности. Главная клетка активности в темный период существенно не отличается между группами исследования. Это означает, что мышей физически уже оправился от анестезии, когда испытание свободный исследовательские парадигмы.
MGS фактически была разработана для оценки боли, но есть доказательства того, что выражения лица также изменяются от стресса и положительные эмоции13,23. Фотографии лица мыши указал, что оба одноместные и неоднократно изофлюрановая анестезии возросли оценки на MGS краткосрочных в период сразу после анестезии. Как оценка MGS разница остается ниже 1, уровень стресса, как представляется, мягкий10. Результаты согласуются с последних наблюдений Миллер и др. 24 , 25 и показал, что мышь вернулась для контроля уровня 150 мин после анестезии10.
Роскошные поведения как роющих и гнездо строительство поведение вегетационных и могут служить индикаторами для благополучия7 и хорошее общее состояние здоровья в26мышей. Мышей только показывают роскошь поведения, когда их основных потребностей. Если снижается благосостояние, роскошь поведения являются первыми, чтобы быть ослабленным5,7. Предыдущие исследования показали, что роющих и Здание гнездя может быть снижена в результате боль и страдания6,8, но есть также свидетельства того, что гиппокампа поражений может повлиять на эти два поведения15,27 , 28 , 29 , 30 , 31.
Роскошные поведения были исследованы в ранний период после анестезии (роющих поведение) и к утру следующего дня (гнездо строительство поведение). Тест для роющих поведение разработанный диакон et al. и принятые Jirkof et al. был изменен в отношении акклиматизации (группа жилье вместо индивидуального жилищного строительства) и длительность поведенческие измерения (только 2 ч вместо 24 ч) 8 , 15 , 16.
Примечательно, что повторные анестезии уменьшена они самые поведение, предполагая, что там было ухудшение благосостояния немедленно опубликовать анестезии10, который также сообщил Jirkof et al. 8. но утром следующего дня, когда мышь имели больше времени, чтобы оправиться от наркоза, высокие и сложные гнезда, они построили указали, что они испытывают благополучия10. Эти результаты отличаются от предыдущих докладов, которые забил гнезда в ранее время32. Таким образом это может быть полезным для адаптации протокол и оценка гнезда ранее в времени. Однако суточный ритм гнездо строительство поведение должны по-прежнему считаться, мышей, как правило, готовят свои гнезда в конце темного этап32.
Прием пищи был незначительно снизилась 1 день после неоднократных анестезии, но она была увеличена на одну неделю спустя. Как мышь не потерять вес тела (см. Hohlbaum и др. 10) может происходить какие-то механизма возмещения, и ухудшение благосостояния в отношении приема пищи должны быть классифицированы как мягкий10. Потребление пищи обеспечивает проницательность в послеоперационном дистресс, благополучия и аппетит у мышей, которые может быть снижена в результате послеоперационной тошноты26 и27послеоперационной стресс.
FCM надежно указывают стресс в мышей33,34,35. Пик концентрации ТСМ обычно происходят 8-10 ч после stressor но зависят от кишечного транзита время18. Таким образом важно также контролировать деятельность дома Кейдж, как включенные в этот протокол. Благодаря эффекту Циркадный ритм экскретируется ТСМ18желательно для сбора фекальных проб в течение 24 ч. ТСМ концентрации отраженного острого стресса в течение 24-h после анестезии. Как ТСМ уровни варьируется от индивидуума к индивидууму, был рассчитан процентное изменение уровней ТСМ относительно базовой линии. FCM результаты настоящего исследования указали, что ни один опыт анестезии ни неоднократные анестезии значительно увеличить гипоталамо гипофизарно надпочечниковой (HPA) оси деятельности10.
В общем результаты показали, что неоднократное изофлюрановая анестезии вызвало краткосрочных мягкая бедствия и благополучия в период раннего длительной чуть больше, чем один опыт изофлюрановая анестезии10.
Протокол для оценки благосостояния не должны налагать дополнительные бедствия на животных. Ограничение настоящего Протокола является, что она включает в себя индивидуальное жилье в период 24-h наблюдения, который известен для увеличения плазмы кортикостерона уровни36. Однако индивидуального жилья необходимо собрать достоверные данные для отдельных лиц в отношении дома Кейдж активность, прием пищи, гнездо здание поведение и ТСМ уровнях. Исследуя эти четыре параметра в то же время (т.е. в период 24-h наблюдения) был свернут продолжительность индивидуального жилья. Чтобы предотвратить результаты от предвзятости индивидуального жилищного строительства, управления мышей претерпел те же тесты и их результаты были приняты во внимание. Если методы доступны для измерения этих параметров в среде группы жилье, они должны быть используется (напримерсистемы автоматизированного анализа дома клетка для дома Кейдж деятельность37 и для приема пищи). Однако автоматизированные дома клетки анализа систем требуют дополнительного оборудования, которые не могут быть доступны. В исследования, посвященные группам животных вместо лиц, дома Кейдж активность, прием пищи, гнездятся здание поведение, и уровни ТСМ также может быть вычислен для группы мышей. То же самое относится к свободный исследовательские парадигмы, которая требует только мышей, чтобы заметно наноситься таким образом, чтобы они могут отличаться. Если благосостояние уменьшается в группе, все мыши в группе должны быть тщательно проверены (используя Оценка лист и диспансеризация) для идентификации мыши или мышей заинтересованных. Для определения чувствительности группы значений необходимы дальнейшие наблюдения на уровне группы.
Что касается уточнения этот протокол могут быть адаптированы к и интегрированы в текущих исследований для оценки влияния определенной процедуры на благосостояние мышей. В зависимости от конкретной процедуры и исследования дизайн должен быть выбран наиболее подходящий тесты из настоящего Протокола. Здесь роющих и гнездо, тест, MGS, бесплатные исследовательские парадигмы и измерение потребляемой пищи, как представляется, является особенно полезным. Следующим циркадные ритмы38, поведение мышей желательно выполнять поведенческие тесты в мышах всех групп в определенный момент. Мышей более активны в утром, чем во второй половине дня38. Однако если дизайн исследования не позволяют для тестирования в утром, тест может быть сделано в другое время. Важно также обеспечить, что каждый один тест проводится на тех же точках времени для всех групп. В противном случае влияние Циркадный ритм параметров может привести к внутри - или межгрупповые различия. Кроме того мышь управления должны включаться в исследовании, так, что можно сравнить результаты от обработанных мышей и управления мышей. Мышь управления должен быть испытан в той же точке времени как обработанных мышей. Если протокол показывает, что нарушается, что благополучие, процедура должна быть изысканным, и протокол повторяется. Этот подход может показать, является ли усилия по совершенствованию процедуры были эффективными.
Настоящий Протокол может служить в качестве общей помощи для оценки степени тяжести, вызванной процедуры. Таким образом это позволяет классифицировать тяжести процедуры на уровне научно - и животных-по центру. Однако протокол не предусматривает шкалу классификации процедуры как легкой, умеренной или тяжелой. Для классификации тяжести процедуры, необходимо сослаться на примеры в приложении VIII директивы ЕС 2010/63.
В заключение настоящий протокол поддерживает систематической оценки благосостояния мышей в духе научных, ориентированный на животных, после процедуры, в ходе которых используется общая анестезия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Благодаря Sabine Джейкобс для оказания помощи с проб, Эдит Klobetz-Rassam для анализа ТСМ ветеринар PD д.м.н. Хабила. Мерле Roswitha для оказания помощи с статистического анализа и Wiebke Гентнер для корректуры рукопись. Это исследование является частью платформы исследования Берлин-Бранденбург BB3R (www.bb3r.de) и финансировался немецкого федерального министерства образования и научных исследований (номер гранта: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluran | CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH | 1214 | |
| InfraMot - Sensore Units | TSE Systems | 302015-SENS | |
| InfraMot - Control Units | TSE Systems | 302015-C/16 | |
| InfraMot - Software | TSE Systems | 302015-S | |
| Nestlet N | Ancare - Plexx | NES3600 | |
| Camera EOS 350D | Canon |
References
- 2010 EU. Directive 2010/63/EU. Official Journal of the European Union. , L276/33-L276/29 (2010).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , London: Methuen. (1959).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Bugnon, P., Heimann, M., Thallmair, M. What the literature tells us about score sheet design. Lab Anim. 50 (6), 414-417 (2016).
- Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiol Behav. 92 (3), 375-397 (2007).
- Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC Vet Res. 3, 16 (2007).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. J Neurosci Methods. 234, 139-146 (2014).
- Jirkof, P., et al. Burrowing behavior as an indicator of post-laparotomy pain in mice. Front Behav Neurosci. 4, 165 (2010).
- Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 45 (1), 1-13 (2011).
- Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in C57BL/6JRj mice-Assessing the degree of distress. PLoS ONE. 12 (6), e0179588 (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412 (2010).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 1 (3), 1117-1119 (2006).
- Deacon, R. M., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12 (9), 2053-2057 (2001).
- Deacon, R. M. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat Protoc. 1 (1), 118-121 (2006).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M. F., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Wien Tierarz Monats. 100 (9-10), 238-246 (2013).
- Touma, C., Palme, R., Sachser, N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Horm Behav. 45 (1), 10-22 (2004).
- Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol. 130 (3), 267-278 (2003).
- Bert, B., Schmidt, N., Voigt, J. P., Fink, H., Rex, A. Evaluation of cage leaving behaviour in rats as a free choice paradigm. J Pharmacol Toxicol Methods. 68 (2), 240-249 (2013).
- Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol Ther. 46 (3), 321-340 (1990).
- Belzung, C., Berton, F. Further pharmacological validation of the BALB/c neophobia in the free exploratory paradigm as an animal model of trait anxiety. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 541-548 (1997).
- Finlayson, K., Lampe, J. F., Hintze, S., Wurbel, H., Melotti, L. Facial indicators of positive emotions in rats. PLoS ONE. 11 (11), e0166446 (2016).
- Miller, A., Kitson, G., Skalkoyannis, B., Leach, M. The effect of isoflurane anaesthesia and buprenorphine on the mouse grimace scale and behaviour in CBA and DBA/2 mice. Appl Anim Behav Sci. 172, 58-62 (2015).
- Miller, A. L., Golledge, H. D., Leach, M. C. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS ONE. 11 (11), e0166652 (2016).
- Deacon, R. Assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice. J Vis Exp. (59), e2607 (2012).
- Felton, L. M., Cunningham, C., Rankine, E. L., Waters, S., Boche, D., Perry, V. H. MCP-1 and murine prion disease: separation of early behavioural dysfunction from overt clinical disease. Neurobiol Dis. 20 (2), 283-295 (2005).
- Deacon, R. M., Croucher, A., Rawlins, J. N. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behav Brain Res. 132 (2), 203-213 (2002).
- Filali, M., Lalonde, R., Rivest, S. Subchronic memantine administration on spatial learning, exploratory activity, and nest-building in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Neuropharmacology. 60 (6), 930-936 (2011).
- Guenther, K., Deacon, R. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur J Neurosci. 14 (2), 401-409 (2001).
- Deacon, R. M., Reisel, D., Perry, V. H., Nicholas, J., Rawlins, P. Hippocampal scrapie infection impairs operant DRL performance in mice. Behav Brain Res. 157 (1), 99-105 (2005).
- Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
- Atanasov, N. A., Sargent, J. L., Parmigiani, J. P., Palme, R., Diggs, H. E. Characterization of train-induced vibration and its effect on fecal corticosterone metabolites in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 737-744 (2015).
- Voigt, C. C., et al. Hormonal stress response of laboratory mice to conventional and minimally invasive bleeding techniques. Anim Welf. 22 (4), 449-455 (2013).
- Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
- Miyashita, T., et al. Social stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine. Biochem Biophys Res Commun. 349 (2), 775-780 (2006).
- Bains, R. S., et al. Analysis of individual mouse activity in group housed animals of different inbred strains using a novel automated home cage analysis system. Front Behav Neurosci. 10 (106), (2016).
- Saibaba, P., Sales, G. D., Stodulski, G., Hau, J. Behaviour of rats in their home cages: daytime variations and effects of routine husbandry procedures analysed by time sampling techniques. Lab Anim. 30 (1), 13-21 (1996).
