Summary
RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.
Abstract
정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.
수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.
다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 위한 새로운 가능성을 제공 합니다. 주된 단백질 축적으로 불용 성 집계 PD에서 α-synuclein 이며 α-synuclein 유전자의 유전자 곱셈 발생 가족 PD5α-synuclein의 수준, 질병에 직접 연결 합니다. 또한, α-synuclein 농도 의존 방식으로 집계합니다. Α-synuclein mRNA 수준의 Downregulation 그러므로 성공적으로 달성 하고있다 RNA 간섭 PD 설치류 모델6,7에 신경 세포 손실 감소를 사용 하 여 흥미로운 치료 전략 이다.
그것은 질병 또는 치료 내정간섭에 기인 하는 RNA 생산의 변화를 측정할 수 있을 해야 합니다. 첨단 방법 등 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량), 뒤 반전 녹음 방송 RNA의 측정 정상 상태 수준은 구별 또는 transcriptional 규칙에 의해 발생 하는 변경의 수 변경 RNA 안정성입니다. RNA 감소율의 조사를 위해 널리 사용 되는 방법은 transcriptional 기계 화합물 α-amanitin 악티노마이신 D 뒤에 부패 RNAs의 측정 등을 사용 하 여 차단 합니다. 그러나, 세포 apoptosis8,9의 유도 등에서 전사의 전반적인 방해와 관련 된 몇 가지 문제가 있다. 세포 독성 효과 옆에 transcriptional 억제제는 또한 느린 세포질 통풍 관에 α-amanitin 악티노마이신 D (참조10검토)의 특이성의 부족 등 여러 가지 기술적인 문제를 제시.
전사의 전반적인 막힘을 피하기 위해, 뉴클레오티드 아날로그 사용 되었습니다, 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), 부 순 등. 이들은 쉽게 포유류 세포에 의해 채택 고 새로 합성된 RNA, RNA의 특정 시간 프레임 내에서 펄스 라벨 사용에 통합. BrU 5-EU와 4-부 엉, 보다 적은 독성 그것은 선택11,12의 기본 아날로그.
BrU IP RNA 합성 속도, 안정성 모두를 조사 하 고 따라서 총 RNA에 변화의 근본 원인 사이 구별을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 RNA 합성의 측정에 초점을 것입니다 고2 RNA 안정성의 조사에 대 한 자세한 내용은 참조를 참조. RNA 합성을 조사, 세포는 BrU 예 1 h BrU-IP1 (그림 1C) 다음으로 이라는 짧게. 이 시간 내에 짧은 라벨 합성 하는 RNA의 측정을 가능 하 게 하 고 관찰 된 변화 보다 RNA 합성에 실시간 정량 하 여 총 RNA에 변화를 측정 하 여 규정의 더 나은 견적을 줄 것 이다. 그러나 그것은,, 그 라벨에, 예를 들어 1 h만 하더라도 저하 아직도 있을 수 있다 관찰 RNA 수준에 영향을 미치는 언급 한다.
BrU IP 실험에서 RNA는 실시간 정량1 또는 다음 세대 시퀀싱2,13다운스트림 분석에 적합 합니다. 다른 표준 RNA 검출 방법, 북부에 게 더 럽 히기 등 ribonuclease 보호 분석 결과, 특정 RNAs에 적용할 수도 있습니다.
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Protocol
참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석
1입니다. RNA 샘플의 준비
- 자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.
- 시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 세포는 BrU의 응용 프로그램에 따라 신선한 미디어 사용을 하지 않습니다.
- BrU와 치료 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 5 mL 행 크의 버퍼에 셀을 세척 하 고 2 mL 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize. 8 mL 성장 미디어 반응을 중지, 15 mL 튜브에 세포를 전송 1000 x g 2 분에 대 한 셀 아래로 회전을 추가 합니다.
- 제거는 상쾌한 고 RNA 격리를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 총 RNA 추출 키트 ( 재료의 표참조) 또는 다른 메서드를 선호 하 고 진행 준비까지-80 ° C에서 RNA RNase 무료 H2o. 저장소에에서 elute.
2입니다. 준비 구슬의 IP에 대 한
- 조사를 더하기 하나 pipetting 동안 손실에 대 한 계정 및 혼합 소용돌이 추가 샘플 수에 대 한 배치에 비즈를 준비 합니다. 회전 혼합 하 여 철저 하 게 반대로 마우스 IgG 자석 구슬 resuspend 고 RNase 무료 1.5 mL 튜브에 샘플 당 20 µ L 구슬 꺼내. 장소는 마그네틱 스탠드에는 구슬을 두고 약 20 s 1.5 mL 튜브에 수집.
- 제거는 상쾌한, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내와 pipetting으로 400 µ L 1 x BrU IP 버퍼에서 resuspend. 아주 짧게 2에 대 한 튜브를 회전 탁상 원심 분리기에 s 마그네틱 스탠드에 다시 배치 하 고는 상쾌한 제거. 한 번 세척 단계를 반복 합니다.
- 헤 파 린을 사용 하 여 구슬 블록 난다 바인딩입니다. 1 ml 1 구슬 resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL 헤 파 린 버퍼, 그리고 회전 30 분 세척을 위한 구슬, 단계 2.2에서 두고.
참고: 헤 파 린은 RNAs 바인딩을 위해 경쟁할 것 이다 마이너스로 충전 된 중합체 이다. tRNA 또는 다른 관련이 없는 RNAs 또한 사용할 수 있습니다 경우 다운스트림 응용 프로그램 시퀀싱 하지. - BrU IP 버퍼 x 1 ml 1 구슬 resuspend 고 추가 1.25 µ g/샘플 안티-α-Bromodeoxyuridine 항 체, BrU 인식 합니다. 1 시간에 대 한 구슬 회전 하는 동안 품 어 또는 실 온에서 하룻밤.
- 세척 단계 2.2에서 세 번 비즈. 1mm BrU와 떠나 난다 바인딩 IP 중의 위험을 구슬 하 고 이로써 항 체의 감도 낮추는 30 분 회전 보충 50 µ L/샘플 1 x BrU IP 버퍼에 구슬 resuspend.
- 3 번 단계 2.2에서 구슬 세척 하 고 50 µ L/샘플 1xBrU-IP 버퍼에서 resuspend.
3. 구슬에 RNA BrU 표시 바인딩
- 1.3 단계에서 RNA 추출에서 RNA 농도 측정 자외선 보이는 분 광 광도 법, 사용 하 고 40 µ g RNA 각 샘플에서 RNase 무료 H2O 200 µ L의 총 볼륨을 희석.
- 열 변성 RNA와 짧게 탁상 원심 분리기에서에서 회전에 80 ° C에서 2 분 동안 RNA 샘플. BrU-IP + BSA/RNAse 억제제 x 200 µ L 2를 추가 합니다.
- 50 µ L resuspended과 구슬 단계 2.6에서에서 각 샘플을 준비 하 고 회전 1 h. 세척 4 번 단계 2.2에서 구슬을 두고 추가 합니다.
4. 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출에 의해 RNA의 정화
-
RNA을 elute 및 페 놀 추출
- RNA, elute 200 µ L 차입 버퍼에 구슬 resuspend 그리고 그 후 신속 하 게 추가 200 µ L 페 놀, pH 6.6 (주의: 독성, 참조 단계 4.1.2 아래) 샘플에서 어떤 비 RNA 분자를 제거 하.
- 회전 혼합 샘플, 그리고 스핀 탁상 원심 분리기에 25000 x g에서 3 분.
참고: 페 놀 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 약 산 성 pH RNA 및 DNA 하지 추출 됩니다 보장 합니다. RNA의 친수성 특성상 위 수성 단계에서 유지 됩니다. 단백질의 소수 성 코어 페 놀을 바인딩할 하 고 낮은 유기 페 놀-단계로 이동 합니다.
-
페 놀-클로 프롬 추출
- (처리에 경험에 따라 200 µ L의 약 190 µ L) 가능한 만큼 위 단계를 발음 하 고 200 µ L 페 놀/클로 프롬, pH 6.6 튜브로 이동 (주의: 독성, 참고). 샘플에 걸쳐 동일한 금액을 발음 해야 합니다.
- 소용돌이 샘플 스핀 25000 x g에서 3 분에 대 한 믹스.
참고: 클로 프롬 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 클로 프롬 반전 녹음 방송14 및 중 합 효소 연쇄 반응을15를 억제 하 여 RNA의 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 페 놀 제거에 추가 됩니다.
- (지금 약 180 µ L), 앞으로 수성 위 단계 발음 하 여 클로 프롬 적 출을 수행 하 고 200 µ L 클로 프롬을 포함 하는 관에 전송. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 스핀 25000 x g에서 3 분.
- (지금 약 170 µ L) 앞으로 수성 위 단계를 발음 하 고 17 µ L (1/10 볼륨) 3 M 채널3COONa, pH 6.0 포함 된 튜브에 그것을 전송. 중화 하 고 수성 해결책에서 RNA를 침전, RNA와 함께 침전 하 고 RNA 펠 릿을 더 보이는 게 2 µ L glycogen (20 mg/mL)을 추가 합니다.
- 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA와 혼합 소금 이온 사이의 바인딩을 증가 500 µ L 96% 에탄올을 추가 합니다. 드라이 아이스에 하룻밤-20 ° C에서 15 분 튜브를 둡니다.
- 25000 x g, 4 ° C는 펠 렛을 방해 하지 않고 30 분 삭제 상쾌한에 샘플을 회전 하 고 모든 잔여 소금 제거 하려면 185 µ L 75% 에탄올에 펠 릿을 세척. 25000 x g, 5 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다.
- 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한을 완전히 삭제 하 고 열린 뚜껑으로 5 ~ 10 분 건조 펠 릿을 둡니다. RNase 무료 H2O 튜브의 측면에 적용 되는 펠 렛을 방해 하지 않으려면 10 µ L resuspend.
5입니다. RNA의 분석
- CDNA cDNA 반전 녹음 방송을 사용 하 여 준비 ( 재료의 표참조) 장비 또는 선호 하는 다른 방법을 사용 하 여 2 µ L RNA 샘플 및 1 µ g 효 모 총 RNA RNA 매체로 cDNA 합성 반응 (사용 되지 않음 cDNA 다음 세대 시퀀싱에 사용 하는 경우)에 대 한. 효 모 RNA 없이 1 µ g RNA를 사용 하 여 해당 입력의 cDNA 준비에 대 한.
- 희석 cDNA 1시 25분와 혼합 희석 9 µ L cDNA 10 µ L 정량으로 마스터 믹스와 1 µ L fluorogenic 프로브, 두 재료의 테이블에에서 지정 된.
참고: cDNA 희석 cDNA 준비 및 사용 되는 정량 Pcr 방법에 따라 달라 집니다. - (예를 들어, 7500 빠른 실시간 PCR 시스템 또는 동등한) 다음 정량 프로그램 실행: 50 ° C, 20에서 2 분 95 ° C, 3의 40 주기에서 s s 95 ° C와 30에서 60 ° c.에 s
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Representative Results
BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.
BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같은 키 2에 α-synuclein mRNA의 정상 상태 수준에서 억제 mRNA 합성1에 변화에 의해 발생 했다. 1 h 라벨 시간이 배경 (그림 2)에 비해 충분 한 라벨을 제공 하 고 또한 영향을가지고 처리 시간을 허용 하기 때문에 선택 되었다. 2mm BrU 치료 1 시간 또는 더 긴 4 h 치료 (그림 3A)에 대 한 HEK293T 셀 형태 론 적 변화를 유도 하지 않았다.
Α-Synuclein 페 HEK293T 셀 갓 합성된 RNA를 BrU 존재 DMSO와 특정 PLK-2 억제제 (PLK-2i) 1 시간 치료 했다. 셀이 수확 했다 고 총 RNA 추출 했다. 1 시간 치료 내 생산 BrU 셔 서 RNA RNA ( 그림 3B"입력")의 총 수영장에서 BrU-IP ("BrU-IP" 그림 3B에서)를 사용 하 여 수집 되었다. RNA의 양을 얻은 BrU IP 40에서 µ g 시작 물자 다른 셀 라인, 사이 변화 하 고 우리는 일반적으로 약 500를 얻을 HEK293T 세포에서 ng 하지만 HeLa 세포에서 10-50 ng. PLK 2 억제 RNA RNA의 종합에 있는 증가 의해 발생 하는 안정 된 상태에서 증가 제안 입력 BrU-IP (그림 3B)에서 α-synuclein mRNA에 증가 발생 합니다. PLK 2i 발생 하지 않습니다 단지 전반적인 증가 RNA 생산에, 3 추가 내 생 유전자 (ACTB, HMBS, 그리고 NADH) 했다 보장 하기 위해 측정 (그림 4). 이 유전자의 PLK 2i 치료 시 입력 (그림 4A)와 BrU-IP (그림 4B)에 증가 되었다.
BrU IP의 특이성을 확인 하기 위해 치료 비-BrU 셀 컨트롤 포함 되었다. 잡혀 BrU-IP BrU 치료 및 치료 세포에서 18sRNA의 수준 비교 되었다 (그림 5). 이 명확 하 게 BrU IP 매우 구체적인 이며 비 셔 서 RNA (그림 5)의 매우 작은 일부분만 캡처를 보여 줍니다.
BrU 셔 서 RNA는 1 시간 이내만 생산 된다, 때문에 때문에 신뢰할 수 너무 낮은 농도에서 일반적으로 적합 한 일부 유전자 표현 적절 한 레퍼런스 유전자를 선택 하는 것 중요 하다. 18sRNA는 그것의 높은 풍부 때문에 그림 4 와 그림 3B 에 제시 하는 데이터에 대 한 참조 유전자로 선정 되었다. 그러나 여러 참조 유전자,, 테스트, 그리고 일부 높은 임계값 사이클 (> 30) (그림 6). 이 데이터는 입력에 IP'ed RNA BrU 표시 및 총 RNA의 차이 약 5 보여 줍니다 Ct, 그리고 일부 RNAs 셀에서 낮은 금액에서 표현 수 있습니다 따라서 제대로 감지 되지 BrU IP 따라.
그림 1: BrU-ip RNA 합성의 조사에 대 한 설명. (A) RNA는 RNA polymerases에 의해 DNA에서 셀에 복사할. (B) 미디어 뿐만 아니라, 따라 BrU 세포에 의해 채택 및 새로 베 껴 진된 RNA에 통합. (C) RNA 합성 속도 측정: (1) 새로 합성된 RNA BrU와 1 시간에 대 한 분류, 라벨 직후 세포에서 추출 (2) RNA, RNA (3) 부 순 이라는 안티 BrU 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated (4) 부 순 분류 ( 입력에 해당) RNA는 실시간 정량 또는 시퀀싱에 의해 분석 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시간 라벨의 평가. BrU 라벨 시간의 초기 평가의 예입니다. 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 성장 AsPC-1 세포 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 50 U/mL/50 µ g/mL 페니실린/스 0, 1, 2, 2 밀리미터 및 RNA 추출 및 분석 전에 4.5 h의 최종 농도에 BrU로 치료 했다 RT-정량입니다. 데이터 2-코네티컷로 계량 및 기술 triplicates ± 표준 편차, n의 의미로 제시 = 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: DMSO를 PLK 2i 입력과 BrU IP RNA를 보여주는 대표적인 결과 치료 셀. (A) 1 h 4 h 2 mM BrU 치료 HEK293T 셀 표시 형태 론 적 변화를 유도 하지 않았다. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 적응 숫자 참조1. 3,500,000 HEK293T 셀 10 cm 접시 당 시드 되었고 시드 후 α-synuclein 24 h를 표현 하는 플라스 미드와 페. 24 h 게시물 transfection 셀 DMSO 또는 PLK-2i, RNA 추출 및 BrU IP 있을 때 부 순으로 1 시간에 대 한 인 큐베이 팅 했다. RNA의 분석 실시간 정량 Pcr에 의해 수행 됐다 인간 SNCA (α-synuclein) 및 18sRNA에 대하여 지시 하는 프로브 세트를 사용 하 여. BrU IP 및 입력 SNCA BrU IP 기준으로 계량 했다 및 2-ΔΔCT 메서드를 사용 하 여 각각 18sRNA를 입력 합니다. 결과 DMSO 치료 샘플을 정상화 했다. 데이터는으로 평균 ± 표준 편차를 제공 됩니다. 통계 비교 학생의 짝이 없는 t-검정를 사용 하 여 수행한 * p < 0.001, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: PLK 2i에 의해 변경 되지 다른 유전자의 측정. PLK 2i 아니 총도 합성 RNA의 ACTB, HMBS, 그리고 NADH를 변경합니다. (A) ACTB, HMBS, 입력에서 NADH RNA 측정 한 실험에서 3 중에서 그리고 2-ΔΔCT 메서드를 사용 하 여 입력에 18sRNA 기준으로 계량. 값은 DMSO 처리 샘플 정규화 및 바 대표 triplicates ± 표준 편차, n의 평균 = 1. (B) ACTB, HMBS, 그리고 NADH 또한 BrU IP'ed RNA 측정 되었고 BrU IP에는 18sRNA 기준으로 계량. 값 DMSO를 정상화 하 고 A로 제시 되었다 n = 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: BrU IP의 특이성. BrU-IP BrU 및 비-BrU-대우 셀에서 잡혀 18sRNA의 비교, 대 한 BrU IP에서 RNA 시작 물자에 차이 계정에 입력 RNA를 기준으로 유효성이 검사 되었고이 BrU 처리 샘플 정규화. 매우 작은 부분만 (0.002) BrU 셔 서 18sRNA의 immunoprecipitated, BrU-IP는 매우 구체적인 시연 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: BrU IP RNA 입력 RNA에 비해 다른 mRNAs의 수준. 몇몇 잠재적인 참조 유전자 일부 RNAs BrU IP RNA BrU 치료 1 시간 내 생산된 RNA의 적은 양 때문에 매우 낮은 농도에서 있을 것입니다 있기 때문에 테스트 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이성 BrU와 비 BrU에서 캡처한 RNA를 비교 하 여 보여주는 데이터 제시 세포 치료. 페 놀-클로 프롬 정화 저렴 한, 하지만 부 순으로 표시 하는 RNA의 낮은 금액을 고려 하면 다운스트림 분석에서 증가 신호 대신 RNA 청소 키트를 사용 하 여 가져올 수 있습니다. 그러나 우리의 경험, 이다, 샘플에서 RNA의 가장 동등한 추출 페 놀-클로 프롬 정화를 사용 하 여 얻어진 다.
BrU 라벨 및-IP는, 달리 총 RNA 수준, 정상 상태 RNA 수준에 변화의 근본 원인 조사 능력의 분석. 방법에는 또는 제한 효과 세포 생리학에 반대로 transcriptional 억제제의 사용을 같은 α-amanitin 및 악티노마이신 d. 그것은 정상 상태 수준으로 새로 합성된 RNA의 비교 RNA 감퇴 요금17, 계산 하 사용 될 수 있으며 여기에 설명 된 BrU IP 메서드를 RNA 합성 및 분석 한 결과 부패의 동시 결정을 수 있습니다 제안 되었습니다.
그림 5에서 우리는 RNA는 BrU에서 IP'ed만 취급 셀, BrU 여기 사용 세포 선에서 RNA에 통합은 실제로 보여주는 시연. 그러나, 정관의 BrU RNA로 다른 셀 라인에서 BrU IP를 수행 하기 전에 초기 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다. 이 예를 들어 점 오 점 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 통해 총 RNA 추출에서 BrU 척도를 안티-BrU 항 체를 사용 하 여 할 수 있었다.
여기 우리가 하지 BrU IP 효율 테스트에 걸쳐 제시 샘플, 하지만이 중 생산 RNA에서 생체 외에서 또는 초파리 melanogaster같은 다른 유기 체에서 BrU 표시 스파이크를 사용 하 여 조사 수 있습니다. 이 RNA 다음 또한 사용할 수 다운스트림 quantifications 및 정규화에.
BrU IP 및 RT-정량, 등 매우 민감한 양적 분석을 수행할 때 올바른 pipetting 기술 중요 하다 그리고 특정 노력 동등한 pipetting 샘플에 걸쳐 수행 하 여야 한다. 페 놀-클로 프롬 기사 몇 가지 경험을 요구 하지만 불만족 pipetting 시 수성 및 페 놀/클로 프롬 단계 다시 혼합 하 고 수 다시 centrifuged.
이 프로토콜 제안 BrU 라벨 1 h 때 RNA 합성을 측정 합니다. 이 라벨 시간 이후 대부분의 인간 녹음 방송에 있는 변화의 대략적인 견적 및 마우스 mRNAs 반감기는 견적 되었다 > 6 h18,19. 그러나 주의 한다,, 많은 RNAs 반감기 이후 얻은 데이터를 해석할 때 행사 < 1 h18,19, 빠르게 자극에 따라 증가 하 고 다시 거절 지질 A에 의해 유도 된 여러 사본 등 베이스 라인 수준 유도20후 2 시간 이내. 그러나 RNA 저하, BrU 라벨 시간에서에서 영향의 위험을 낮추기 위하여 감소 될 수 있다,, 그것은 또한 RNA BrU IP (우리의 손에 (라벨 1 시간 후 얻은 배경에서 얻은 구별 수 충분 한 RNA를 분류 하는 것이 중요 그림 2))입니다. 또 다른 옵션은 RNA 합성 및 BrU 라벨 및 IP를 사용 하 여 관심사의 유전자의 측정, 후자의 방법2에서 설명 하는. 이 두 가지 방법에서 데이터, 서로 보충 하 고 두 조건 사이 합성에 변화를 측정 하는 변화가 감소율에서 볼 경우, 종결 될 수 있다 RNA 측정된 변화 합성의 규제 때문 이었다. 그러나, 그것은 기억 모두 기법만 RNA 수준을 예측 하 여 RNA 기능을 측정 하 고 조사 화학 수정14등 RNA의 기능에 영향을 미치는 다른 메커니즘을 완전히 무시 하는 것이 중요.
셀만 1 h BrU와 알을 품는, 이후 매우 느리게 생산된 mRNAs BrU IP 메서드를 사용 하 여 측정 하기 어려울 수 있습니다. 그러나 이것은 한 지점 어디 α-amanitin 등 악티노마이신 D transcriptional 억제제의 사용 BrU-IP를 통한 선호 수 있습니다, 그들은 사용할 수 있습니다만 저하에 변화를 측정 하 여 직접 측정 하는 RNA 생산. BrU 셔 서 RNA의 저급은 또한 극복 될 수 있다 증가 함으로써 BrU와 보육 시간, 하지만, 긴 부 화 시간이 증가 영향의 위험 RNA 저하에 의해. 이 경우, 그것은 더 이상 변화 BrU 셔 서 RNA에서 RNA 생산 또는 변경 인해 발생 여부를 알 수 없습니다.
그러나이 예제에서 캡처된 BrU 셔 서 RNA의 다운스트림 분석 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 수행 됩니다, 그리고, 차세대 시퀀싱도 변화 RNAs2,13의 큰 수영장에 대 한 화면에 널리 사용 되는 다운스트림 메서드. 마찬가지로, 방법, mRNAs의 분석을 제한 하지 않습니다 하지만 RNAs2의 모든 종류를 분석할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
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