Summary
يمكن استخدام هذا الأسلوب لقياس توليف الحمض النووي الريبي. 5-بروموريديني هو إضافة إلى الخلايا وإدماجها في الجيش الملكي النيبالي تجميعي. توليف الحمض النووي الريبي يقاس باستخراج الحمض النووي الريبي فورا بعد وضع العلامات، تليها إيمونوبريسيبيتيشن 5-بروموريديني-استهدفت توسم الجيش الملكي النيبالي والتحليل بالنسخ العكسي والكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Abstract
عند مستويات الدولة ثابت الحمض النووي الريبي مقارنة بين هذين الشرطين، من غير الممكن التمييز بين ما إذا كانت التغييرات هي الناجمة عن التغييرات في الإنتاج أو تدهور للجيش الملكي النيبالي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس إنتاج الحمض النووي الريبي، استخدام 5-بروموريديني وسم الحمض النووي الريبي يليه إيمونوبريسيبيتيشن، الذي يتيح التحقيق في الجيش الملكي النيبالي توليفها في إطار زمني قصير (مثلاً، ح 1). ميزة وضع العلامات 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن على استعمال مثبطات النسخي السامة، مثل α-أمانيتين ووالاكيتنوميسين د، أن هناك لا أو تأثيرات منخفضة جداً على بقاء الخلية أثناء الاستخدام القصير الأجل. بيد لأن 5-بروموريديني-إيمونوبريسيبيتيشن فقط يلتقط الجيش الملكي النيبالي المنتجة في الوقت القصير التوسيم، أنتجت ببطء، فضلا عن سرعة التدهور يمكن أن الحمض النووي الريبي يصعب قياسه بهذه الطريقة. يمكن تحليل استولت عليها 5-بروموريديني-إيمونوبريسيبيتيشن الجيش الملكي النيبالي 5-بروموريديني-المسمى بالنسخ العكسي والكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتسلسل الجيل القادم. يمكن أن يحقق في جميع أنواع من الحمض النووي الريبي، والأسلوب الذي لا يقتصر على قياس مرناً كما يرد في هذا المثال.
Introduction
5-بروموريديني (BrU) إيمونوبريسيبيتيشن (IP) يتيح دراسة إنتاج الحمض النووي الريبي في الخلايا التي تحتوي على لا أو آثار محدودة للغاية على خلية علم وظائف الأعضاء خلال الموجز وسمها الفترة1،2. الأسلوب الذي يستند إلى إدماج مشتقة أردين الاصطناعية يتبع BrU في الحمض النووي الريبي المركبة حديثا بالملكية الفكرية من الحمض النووي الريبي توسم باستخدام الأجسام المضادة-BrU (الشكل 1).
كما كان من المعروف لعقود يمكن أن ينظم هذا البروتين ترانسكريبتيونالي، وكان الافتراض بوجود عوامل النسخ قبل أكثر من 50 عاماً3. اليوم، أنه من المعروف أن العديد من الأمراض تسببها التقلبات من النسخ واستقرار الجيش الملكي النيبالي (S1 الشكل التكميلية في المرجع4)، والقدرة على قياس التغيرات في إنتاج الحمض النووي الريبي لها أهمية كبيرة في فهم الأمراض التنمية.
من ناحية أخرى، توفر أدوات لتنظيم إنتاج الحمض النووي الريبي إمكانيات جديدة لعلاج الأمراض الناجمة عن تعبير البروتين القليل أو الكثير، أو تراكم البروتين كما هو الحال في مرض باركنسون (PD). البروتين السائد تراكم المجاميع غير قابلة للذوبان كما في PD α-سينوكلين، ومستوى α-سينوكلين يرتبط ارتباطاً مباشرا بهذا المرض، كما تضاعف الجين الجينات α-سينوكلين الأسباب الأسرية PD5. وعلاوة على ذلك، المجاميع α-سينوكلين بطريقة تعتمد تركيز. ولذلك Downregulation مستويات مرناً α-سينوكلين هو استراتيجية علاجية مثيرة لاهتمام، وقد تحقق بنجاح باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل لتقليل فقدان الخلايا العصبية في PD نماذج القوارض6،7.
من المهم أن تكون قادرة على قياس التغيرات في إنتاج الحمض النووي الريبي الناجمة عن المرض أو التدخلات العلاجية. أحدث أساليب لقياس مستويات حالة ثابتة من الجيش الملكي النيبالي، مثل النسخ العكسي متبوعاً بالكمية البلمرة المتسلسل (RT-qPCR)، ليست قادرة على التمييز بين التغيرات الناجمة عن طريق تنظيم النسخي أو تغييرها الجيش الملكي النيبالي الاستقرار. يتم حظر أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لتحقيق معدلات تحلل الحمض النووي الريبي إليه النسخي استخدام المركبات مثل α-أمانيتين أو والاكيتنوميسين د متبوعاً بإجراء قياسات للكشف المتحللة. ومع ذلك، هناك بعض المشاكل المرتبطة انسداد الكلي للنسخ في الخلايا، مثل تنظيم دورات تعريفية للمبرمج8،9. بجانب الآثار السامة للخلايا، هذه الموانع النسخي أيضا العديد من المسائل التقنية، مثل بطء امتصاص الخلوية من α-أمانيتين وعدم التحديد والاكيتنوميسين د (استعرض في المرجع10).
لتجنب انسداد الكلي للنسخ، استخدمت نظائر النوكليوتيدات، مثل أردين 5-اثينيل (5-الاتحاد الأوروبي)، 4-ثيوريديني (4-تو) و BrU. هذه هي سهولة تناولها بخلايا الثدييات وإدراجها في الحمض النووي الريبي المركبة حديثا، مما يتيح وضع العلامات نبض من الجيش النيبالي الملكي في إطار زمني محدد. BrU أقل سمية من الاتحاد الأوروبي 5 و 4-تو، مما يجعلها التماثلية المفضل لاختيار11،12.
يمكن استخدام BrU للملكية الفكرية للتحقيق بمعدل توليف الحمض النووي الريبي والاستقرار، ومما يميز بين الأسباب الكامنة وراء التغييرات في مجموع الجيش الملكي النيبالي. هذه المادة سوف تركز على قياس توليف الحمض النووي الريبي، ويشير إلى مرجع2 لمزيد من التفاصيل عن التحقيق بشأن استقرار الجيش الملكي النيبالي. للتحقيق في توليف الحمض النووي الريبي، وصفت الخلايا هي بإيجاز مع BrU مثلاً ح 1 تليها BrU-IP1 (الشكل 1). هذا يتيح للقياسات من الحمض النووي الريبي توليفها في غضون الفترة القصيرة وضع العلامات والتغيرات الملاحظة سيعطي تقدير أفضل للوائح في توليف الحمض النووي الريبي من بقياس التغيرات في مجموع الجيش الملكي النيبالي ب RT-قبكر. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن وقت الوسم، على سبيل المثال، فقط ح 1، تدهور يمكن لا يزال لها تأثير على مستويات الحمض النووي الريبي ولاحظ.
الجيش الملكي النيبالي من تجارب برو--الملكية الفكرية مناسبة لتحليل المصب RT qPCR1 أو2،تسلسل الجيل القادم13. القياسية الحمض النووي الريبي الكشف عن الأساليب الأخرى، مثل شمال النشاف أو ribonuclease حماية المقايسة، قد تنطبق على بعض الكشف أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك، والحفاظ على المخازن المؤقتة على الجليد أو في الثلاجة (باستثناء من شطف المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحزب الديمقراطي الصربي). البروتوكول وينقسم إلى خمسة أقسام: "إعداد من الجيش الملكي النيبالي" العينات؛ إعداد الخرز للملكية الفكرية؛ ربط المسمى BrU الحمض النووي الريبي الخرز؛ شطف وتنقية منضم من الجيش الملكي النيبالي BrU المسمى باستخراج الفينول-الفينول/كلوروفورم-كلوروفورم 3 خطوات؛ تحليل للحمض النووي الريبي (في هذا المثال باستخدام الرايت qPCR)
1-إعداد عينات الحمض النووي الريبي
- HEK293T عد الخلايا باستخدام خلية الآلي العداد والبذور الخلايا 3,500,000 في طبق بتري 10 سم في وسائط النمو 10 مل (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين و 50 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين) للحصول على إجمالي > 40 ميكروغرام الحمض النووي الريبي عند استخراج 48 ساعة في وقت لاحق. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- نضح وسائط النمو 8 مل ح 48 بعد البذر، وترك 2 مل لتجنب جفاف الخلايا. إضافة 2 مم BrU وأي علاج لمل 8 يستنشق وسائط النمو، وإزالة بقايا 2 مل من الخلايا قبل تطبيقه مل 8 وسائط النمو التي تحتوي على BrU. تجنب استخدام وسائط جديدة بناء على طلب من BrU إلى الخلايا، وبهذا يمكن أن تحدث تغييرات في التعبير الجيني.
- احتضان الخلايا ح 1 مع BrU والعلاج. تغسل الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت 5 مل هانك وتريبسينيزي الخلايا باستخدام 2 مل 0.05% التربسين. إضافة وسائط النمو 8 مل لوقف رد الفعل ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، وتدور أسفل الخلايا لمدة 2 دقيقة في س 1,000 ز.
- إزالة المادة طافية واستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من بيليه خلية تستخدم عزل الحمض النووي الريبي كيت (انظر الجدول للمواد) أو أي دولة أخرى تفضل الأسلوب، والوت في "مخزن سين" خالية رناسي ح2الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما.
2-إعداد الخرز للملكية الفكرية
- إعداد الخرز على دفعات لعدد العينات يتم التحقيق فيها بالإضافة إلى واحد إضافي حساب الخسارة خلال بيبيتينج والدوران خلط. ريسوسبيند الماوس المضادة مفتش الخرز المغناطيسي دقة بخلط دوامة وإخراج 20 ميليلتر الخرز كل عينة في أنبوب 1.5 مل رناسي مجاناً. مكان أنبوب 1.5 مل في موقف المغناطيسية وترك ما يقرب من 20 ثانية الخرز جمع على الجانب.
- إزالة المادة طافية وإخراج الأنبوب من موقف المغناطيسية، وريسوسبيند في 400 المخزن المؤقت للملكية الفكرية BrU 1 x ميليلتر من بيبيتينج. تدور أنبوب بإيجاز شديد ل 2 s في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول، وضعه في موقف المغناطيسية، وإزالة المادة طافية. كرر الخطوة الغسيل مرة واحدة.
- كتلة غير محدد ملزم الخرز استخدام الهيبارين. ريسوسبيند الخرز في 1 مل 1 x BrU--الملكية الفكرية + 1 ملغ/مل الهيبارين المخزن المؤقت، والإجازات الدورية للغسيل 30 دقيقة الخرز مرة واحدة، كما هو الحال في الخطوة 2، 2.
ملاحظة: الهيبارين هو بوليمر مشحون سلبا، التي سوف تتنافس مع الكشف للربط. يمكن أيضا استخدام الحمض الريبي النووي النقال أو الكشف غير ذات صلة أخرى إذا كان لا يتم تسلسل التطبيق المتلقين للمعلومات. - ريسوسبيند الخرز في 1 مل 1 x برو-IP المخزن المؤقت وإضافة 1.25 ميكروغرام/العينة المضادة-α-بروموديوكسيوريديني جسم، الذي تسلم أيضا BrU. احتضان الخرز ح 1 أثناء التناوب، أو بين ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل حبات ثلاث مرات كما في الخطوة 2، 2. ريسوسبيند الخرز في المخزن المؤقت BrU للملكية الفكرية س 1 ميليلتر/العينة 50 تستكمل مع 1 مم BrU والإجازات الدورية مدة 30 دقيقة أقل الحساسية لجسم منضمة إلى الخرز وهنا مخاطر الربط غير محدد من خلال الملكية الفكرية.
- أغسل حبات ثلاث مرات كما في الخطوة 2، 2، وريسوسبيند في 50 ميليلتر/نموذج 1xBrU للملكية الفكرية العازلة.
3-ربط المسمى BrU الحمض النووي الريبي الخرز
- قياس تركيزات الحمض النووي الريبي في الجيش الملكي النيبالي تستخرج من الخطوة 1، 3 استخدام كانت الأشعة فوق البنفسجية-المرئية، وتمييع ميكروغرام 40 الجيش الملكي النيبالي من كل عينة في خالية رناسي ح2س إلى إجمالي حجم 200 ميليلتر.
- الحرارة عينات الحمض النووي الريبي لمدة 2 دقيقة عند 80 درجة مئوية تجريدها من الجيش الملكي النيبالي، وتدور بإيجاز في أجهزة الطرد مركزي منضدية. إضافة 200 ميليلتر 2 x برو--الملكية الفكرية + جيش صرب البوسنة/رناسي المانع.
- إضافة 50 ميليلتر حراكه وأعدت الخرز من الخطوة 2.6 لكل عينة وترك تدوير الغسيل حاء 1 الخرز أربع مرات كما في الخطوة 2، 2.
4-شطف وتنقية من الجيش الملكي النيبالي باستخراج الفينول-الفينول/كلوروفورم-كلوروفورم 3 خطوات
-
الوت الجيش الملكي النيبالي، والقيام باستخراج الفينول
- ريسوسبيند الخرز في المخزن المؤقت شطف ميليلتر 200 الوت الجيش الملكي النيبالي، وبعد ذلك بسرعة إضافة 200 ميليلتر الفينول، pH 6.6 (تنبيه: السمية، انظر الملاحظة أدناه الخطوة 4.1.2) لإزالة أي جزيئات الرنا غير العينة.
- جرب مزيج العينة، وتدور 3 دقيقة في 25,000 ز العاشر في أجهزة الطرد مركزي منضدية.
ملاحظة: الفينول السامة وينبغي التعامل معها في غطاء دخان يرتدي حماية الجلد. الرقم الهيدروجيني الحمضية قليلاً يضمن أن يتم استخراج الحمض النووي الريبي فقط، وليس الحمض النووي،. سيبقى الجيش الملكي النيبالي في المرحلة المائية العليا نظراً لطبيعة التهم ماء. سيتم ربط الفينول النوى مسعور من البروتينات والانتقال إلى المرحلة الفينول العضوية أقل.
-
القيام باستخراج الفينول كلوروفورم
- نضح المرحلة العليا قدر ممكن (حوالي 190 ميليلتر من ميليلتر 200، اعتماداً على خبرة في التعامل مع) ونقلها إلى أنبوب مع 200 ميليلتر الفينول/كلوروفورم، pH 6.6 (تنبيه: السمية، انظر الحاشية). تأكد من نضح بنفس المبلغ في العينات.
- جرب مزيج عينة وتدور لمدة 3 دقائق في 25,000 س ز.
ملاحظة: كلوروفورم سامة وينبغي التعامل معها في غطاء دخان يرتدي حماية الجلد. يتم إضافة كلوروفورم لإزالة الفينول، التي يمكن أن تؤثر على تحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات عن طريق تثبيط النسخ العكسي14 وبوليميريز سلسلة من ردود الفعل15.
- القيام باستخراج كلوروفورم يسفط في المرحلة العليا مائي قبل (الآن حوالي 180 ميليلتر)، ونقل إلى أنبوب يحتوي على 200 ميليلتر كلوروفورم. جرب خلط العينة وتدور 3 دقيقة في س 25,000 ز.
- نضح مائي المرحلة العليا قبل (الآن قرابة 170 ميليلتر) ونقلها إلى أنبوب يحتوي على 17 ميليلتر (المجلد 1/10) م 3 CH3كونا، pH 6.0. لتحييد ويعجل بالجيش الملكي النيبالي من محلول مائي، إضافة 2 ميليلتر الجليكوجين (20 ملغ/مل)، ورواسب جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي، ويجعل بيليه رنا أكثر وضوحاً.
- إضافة 500 ميليلتر 96 ٪ الإيثانول لزيادة الربط بين أيونات الملح والحمض النووي الريبي والمزيج بعكس الأنبوب بضع مرات. اترك الأنبوب بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية أو 15 دقيقة على الثلج الجاف.
- وتدور العينة في س 25,000 ز، 4 درجة مئوية للمادة 30 دقيقة تجاهل طافية دون إزعاج بيليه يغسل بيليه في 185 الإيثانول 75% ميليلتر لإزالة أي بقايا الملح. تدور في 25,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية تماما دون إزعاج بيليه وترك بيليه الجافة 5-10 دقيقة مع غطاء مفتوحة. ريسوسبيند في 10 ميليلتر خالية رناسي ح2س تطبق على جانب الأنبوب لتجنب الإخلال بيليه.
5-تحليل للحمض النووي الريبي
- يعد استخدام نسخ عكسي كدنا كدنا كيت (انظر الجدول للمواد) أو أي دولة أخرى فضلت أسلوب استخدام 2 عينة الحمض النووي الريبي ميليلتر والجيش الملكي النيبالي إجمالي الخميرة 1 ميكروغرام كالناقل الحمض النووي الريبي لرد فعل التوليف كدنا (لا يستخدم إذا كان يستخدم كدنا لتسلسل الجيل القادم). استخدم 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي دون خميرة الحمض النووي الريبي لكدنا إعداد الإدخال المطابق.
- مزيج ميليلتر 9 إضعاف كدنا مع 10 ميليلتر qPCR سيد ميكس ومسبار فلوروجينيك ميليلتر 1، سواء المحددة في الجدول للموادوكدنا تمييع 01:25.
ملاحظة: تمييع كدنا يعتمد على إعداد كدنا و qPCR الطريقة المستخدمة. - قم بتشغيل برنامج قبكر التالية (على سبيل المثال، على نظام سريع Real-time PCR أو ما يعادل 7500): 2 دقيقة عند 50 درجة مئوية، 20 s عند 95 درجة مئوية، دورات 40 3 s في 95 درجة مئوية و 30 s عند 60 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدينا الاختبارات المبدئية لوضع العلامات BrU الوقت أجريت في الخلايا AsPC-1. تم علاج الخلايا مع BrU 0، 1 و 2 وح 4.5، متبوعاً بمجموع استخراج الحمض النووي الريبي و BrU للملكية الفكرية. وقيست GAS5 وجابده في "الجيش الملكي النيبالي" BrU للملكية الفكرية، مما يدل على أن وسم ح 1 كان كافياً للتوصل إلى إجراء تغيير حوالي 9-و 44-إضعاف مقارنة بالخلفية (ح 0) جابده و GAS5، على التوالي.
استخدمت BrU للملكية الفكرية والتحليل الوارد وصفها أعلاه للتحقيق إذا اكتشف التغييرات في حالة ثابتة مستويات مرناً α-سينوكلين عليها مثل بولو كيناز 2 (PLK-2) تثبيط كان سببها التغيرات في توليف مرناً1. تم اختيار وقت الوسم ح 1 لأن هذا يوفر وضع العلامات كافية مقارنة بالخلفية (الشكل 2)، وكما يسمح الوقت العلاج ليكون لها تأثير. حمل 2 مم BrU معاملة لا أية تغييرات السمات في الخلايا HEK293T لح 1 أو معاملة ح 4 أطول (الشكل 3A).
Α-سينوكلين transfected HEK293T الخلايا وتم علاج ح 1 مع [دمس] أو مثبط PLK-2 محددة (PLK-2i) حضور BrU لتسمية المركب حديثا الجيش الملكي النيبالي. كانت الآخرة حصاد الخلايا وتم استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي. وجمعت الجيش الملكي النيبالي المسمى BrU المنتجة في علاج ح 1 استخدام BrU للملكية الفكرية ("برو--الملكية الفكرية" في الشكل 3) من الحصيلة الكلية للحمض النووي الريبي ("الإدخال" في الشكل 3). الحصول على كمية الحمض النووي الريبي مع BrU للملكية الفكرية من 40 ميكروغرام ابتداء من المواد تختلف بين خطوط الخلايا المختلفة، ونحن عموما الحصول على ما يقرب من 500 نانوغرام من الخلايا HEK293T، ولكن فقط 10-50 نانوغرام من خلايا هيلا. تسبب تثبيط PLK-2 زيادة α-سينوكلين مرناً في كل من الإدخال و BrU للملكية الفكرية (الشكل 3B) مما يوحي بأن الزيادة في حالة ثابتة الجيش الملكي النيبالي هو الناجم عن زيادة في توليف الحمض النووي الريبي. لضمان أن PLK-2 طاء لا يسبب فقط زيادة في إنتاج الحمض النووي الريبي، 3 جينات الذاتية إضافية (أكتب وهمبس و NADH) قياس (الشكل 4). أيا من هذه الجينات زاد في الإدخال (الشكل 4A) و BrU للملكية الفكرية (الشكل 4) عند معاملة PLK-2i.
للتحقق من صحة خصوصية برو--الملكية الفكرية، أدرج عنصر تحكم مع الخلايا غير BrU معاملة. مقارنة مستويات 18sRNA التي استولت عليها BrU للملكية الفكرية من الخلايا BrU المعالجة وغير المعالجة (الشكل 5). وهذا يبين بوضوح أن برو--الملكية الفكرية هي محددة للغاية، ويلتقط سوى نسبة ضئيلة جداً من الحمض النووي الريبي غير المسمى (الشكل 5).
لأن الجيش الملكي النيبالي المسمى BrU فقط ينتج ضمن ح 1، من المهم أن تختار جين سليم مرجع، حيث قد أعرب عن بعض الجينات المناسبة عادة في تركيزات منخفضة للغاية أن تكون موثوقة. واختير 18sRNA كجين مرجعية للبيانات المعروضة في الشكل 3B و الرقم 4 بسبب وفرة عالية. ، ومع ذلك، اختبار عدة مرجعية الجينات، وأظهرت بعض دورات عتبة عالية (> 30) (الشكل 6). تبين هذه البيانات أيضا أن الفرق بين المسمى BrU IP'ed الجيش الملكي النيبالي، ومجموع الجيش الملكي النيبالي في الإدخال هي حوالي 5 للأشعة المقطعية، وبعض الكشف التي أعرب عنها في كميات قليلة في الخلية قد ولذلك لا يمكن بشكل صحيح الكشف عنها عقب BrU للملكية الفكرية.
رقم 1: وصف برو--الملكية الفكرية للتحقيق في توليف الحمض النووي الريبي. الحمض النووي الريبي (A) يتم نسخها في الخلايا من الحمض النووي من قبل رنا بولمرس. (ب) عليها، بالإضافة إلى وسائل الإعلام، هو تناول الخلايا BrU وإدراجها في الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا. (ج) لقياس معدلات توليف الحمض النووي الريبي: هو المسمى الحمض النووي الريبي (1) حديثا تجميعي ح 1 مع BrU، يتم استخراج الحمض النووي الريبي (2) من الخلايا مباشرة بعد وضع العلامات، والحمض النووي الريبي (3) BrU المسمى إيمونوبريسيبيتاتيد باستخدام الأجسام المضادة-BrU، (4) المسمى BrU (و المقابلة الإدخال) ويتم تحليل الحمض النووي الريبي RT-قبكر أو التسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم وضع العلامات وقت. مثال لإجراء تقييم أولى لوضع العلامات BrU الوقت. AsPC-1 الخلايا نمت في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين و 50 U/mL/50 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين تعامل مع BrU بتركيز نهائي 2 مم 0, 1, 2, وح 4.5 قبل استخراج الحمض النووي الريبي والتحليل حسب RT-قبكر. البيانات هي كمياً ك 2-Ct، ويرد كمتوسط تريبليكاتيس التقنية ± انحراف معياري، n = 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: معالجة نتائج الممثل عرض الإدخال، والجيش الملكي النيبالي BrU للملكية الفكرية من [دمس] و 2 طاء PLK الخلايا. العلاج BrU ح 1 و 4 ح 2 مم (A) الحث على عدم أي تغييرات السمات مرئية في الخلايا HEK293T. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) مواءمة الشكل من مرجع1. 3,500,000 HEK293T خلايا المصنف الواحد طبق 10 سم و transfected مع بلازميد الإعراب عن α-سينوكلين ح 24 بعد البذر. كانت ح 24 وظيفة تعداء الخلايا المحتضنة ح 1 مع BrU حضور [دمس] أو PLK-2 طاء، متبوعاً باستخراج الحمض النووي الريبي و BrU للملكية الفكرية. قامت بتحليل للحمض النووي الريبي RT-قبكر باستخدام مسبار مجموعات موجهة ضد البشرية سنكا (α-سينوكلين) و 18sRNA. كان كمياً بالنسبة للملكية الفكرية BrU برو--الملكية الفكرية و "سنكا الإدخال" الإدخال 18sRNA، على التوالي، باستخدام الأسلوب 2-ΔΔCتي . تم تطبيع النتائج للعينات المعالجة [دمس]. يتم تقديم البيانات كمتوسط الانحرافات المعيارية ±. أجريت المقارنات الإحصائية استخدام الطالب مزاوج اختبار t، * p < 0.001، n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: قياس جينات أخرى لم تتغير حسب PLK-2i- 2 طاء PLK التغييرات لا المجموع ولا تجميعي الجيش الملكي النيبالي أكتب، همبس، و NADH. أكتب (A)، وهمبس، والجيش الملكي النيبالي NADH من مدخلات تقاس بثلاث نسخ في تجربة واحدة وكمياً بالنسبة إلى 18sRNA في الإدخال باستخدام الأسلوب 2-ΔΔCتي . تم تطبيع القيم للعينات [دمس] تعامل وتمثل الأشرطة يعني تريبليكاتيس الانحرافات المعيارية ±، n = 1. (ب) أكتب وهمبس و NADH كانت تقاس في "الجيش الملكي النيبالي" BrU-IP'ed وكمياً بالنسبة إلى 18sRNA في BrU-الملكية الفكرية. قيم تم تطبيع إلى [دمس] وقدم كما هو الحال في A، n = 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خصوصية الملكية الفكرية BrU. لمقارنة 18sRNA التي استولت عليها BrU للملكية الفكرية من الخلايا BrU-وغير-برو-تعامل، التحقق من صحتها بالنسبة "إدخال الحمض النووي الريبي" لمراعاة الاختلافات في ابتداء من المواد الجيش الملكي النيبالي من برو--الملكية الفكرية وتطبيع الآخرة لعينات تعامل BrU. وكان إلا جزء صغير جداً (0.002) من غير BrU المسمى 18sRNA إيمونوبريسيبيتاتيد، مما يدل على أن برو--الملكية الفكرية محددة للغاية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مستويات مرناس مختلفة في "إدخال الجيش الملكي النيبالي" بالمقارنة مع "الحمض النووي الريبي" برو--الملكية الفكرية- تم اختبار عدة جينات إشارة محتملة لأن بعض الكشف سيكون حاضرا في تركيزات منخفضة للغاية في "الجيش الملكي النيبالي" BrU للملكية الفكرية بسبب كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي المنتجة داخل ح 1 معاملة BrU. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام برو--الملكية الفكرية لتحديد إنتاج الحمض النووي الريبي بوسم حديثا إنتاج الحمض النووي الريبي ح 1 مع برو، تليها مباشرة استخراج الحمض النووي الريبي وإيمونوبريسيبيتيشن من الجيش النيبالي الملكي المسمى BrU. هذا الأسلوب قد وصفت سابقا في مرجع16، وتتضمن هذه المقالة بعض الخطوات الإضافية لزيادة خصوصية الملكية الفكرية، والجيش الملكي النيبالي النقاء، بحبات قبل علاج بتركيزات منخفضة من BrU فضلا عن خطوة تنقية فينول كلوروفورم زيادة نقاء الحمض النووي الريبي أثر الملكية الفكرية. بالإضافة إلى ذلك، نقدم أيضا البيانات التي تبين خصوصية برو--الملكية الفكرية هنا بمقارنة الحمض النووي الريبي تم التقاطها من BrU وغير BrU تعامل الخلايا. تنقية الفينول كلوروفورم رخيصة، ولكن نظراً لكميات قليلة من الحمض النووي الريبي المسمى مع برو، يمكن الحصول على إشارات زيادة في تحليل المتلقين للمعلومات باستخدام أدوات تنظيف الحمض النووي الريبي بدلاً من ذلك. غير أن تجربتنا أن استخراج الحمض النووي الريبي الأكثر المساواة عبر العينات يتم الحصول عليها باستخدام تنقية الفينول كلوروفورم.
BrU-وضع العلامات والملكية الفكرية-، على النقيض من تحليل لمجموع مستويات الحمض النووي الريبي، قادرة على التحقيق في الأسباب الكامنة وراء التغيرات في مستويات الدولة ثابت الحمض النووي الريبي. الأسلوب ليس لديها محدودة آثار على أو فيزيولوجيا الخلية، على النقيض من ذلك باستخدام مثبطات النسخي مثل α-أمانيتين ودال والاكيتنوميسين اقترح أن المقارنة للحمض النووي الريبي المركبة حديثا إلى مستويات حالة ثابتة يمكن استخدامها لحساب معدلات تحلل الحمض النووي الريبي17، والأسلوب BrU للملكية الفكرية الموصوفة هنا يتيح التصميم المتزامن توليف الحمض النووي الريبي والانحلال في فحص واحد.
وفي الشكل 5، أثبتنا أن الجيش الملكي النيبالي فقط IP'ed من BrU تعامل الخلايا، تبين أن هناك بالفعل BrU أدرجت في الجيش الملكي النيبالي في خط الخلية المستخدمة هنا. ومع ذلك، فإننا نقترح إجراء اختبار أولى لإدماج BrU في الجيش الملكي النيبالي في خطوط الخلايا الأخرى قبل تنفيذ BrU-الملكية الفكرية. يمكن أن يتم هذا على سبيل المثال، باستخدام الأجسام المضادة-BrU كمياً BrU في مجموع مقتطفات الحمض النووي الريبي عن طريق نقطة وصمة عار أو المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم.
هنا أننا لم تقدم اختبار الكفاءة BrU للملكية الفكرية عبر العينات، ولكن هذا يمكن أن يحقق استخدام المسمى BrU طفرات في الحمض النووي الريبي أنتجت أما في المختبر أو من كائن آخر، مثل melanogaster المورفولوجية. ثم يمكن أيضا استخدام هذا الجيش الملكي النيبالي في المصب كوانتيفيكيشنز ونورماليزيشنز.
تقنيات بيبيتينج الصحيحة الحاسمة عند إجراء فحوصات الكمية البالغة الحساسية، مثل برو--الملكية الفكرية و RT-قبكر، وينبغي بذل جهد خاص لأداء بيبيتينج متساوية عبر العينات. عمليات الاستخراج الفينول كلوروفورم تتطلب بعض الخبرة، ولكن عند بيبيتينج غير مرضية، يمكن إعادة مختلطة مراحل مائي والفينول/كلوروفورم وطرد مرة أخرى.
ويقترح هذا البروتوكول وضع العلامات BrU ح 1 عند قياس توليف الحمض النووي الريبي. هذه المرة وضع العلامات يتيح تقدير تقريبي للتغييرات في النسخ، أن غالبية البشرية ومرناس الفئران قد قدرت أن يكون نصف العمر > ح 618،19. بيد أنه ينبغي توخي الحذر، تمارس عند تفسير البيانات التي تم الحصول عليها، منذ الكشف العديد من إنصاف < 1 ح18،19، مثل النصوص عدة الناجمة عن الدهون، وسرعة زيادة على التحفيز ورفض العودة إلى مستويات خط الأساس ضمن ح 2 بعد التعريفي20. لتقليل مخاطر التأثيرات من تدهور الجيش الملكي النيبالي، ووقت وضع العلامات BrU يمكن تقليلها، مع ذلك، من المهم أيضا لتسمية الجيش الملكي النيبالي ما يكفي لتكون قادرة على التمييز بين الحمض النووي الريبي التي حصلت عليها BrU للملكية الفكرية من الخلفية (والتي تم الحصول عليها بعد وسم ح 1 في أعمالنا (الأيدي الشكل 2)). وثمة خيار آخر قياس توليف الحمض النووي الريبي والانحلال من الجينات للاهتمام باستخدام برو--وضع العلامات والملكية الفكرية، والأسلوب الأخير الذي تم وصفه في2. البيانات من هذين النهجين تكمل بعضها البعض، وإذا كان يتم قياس تغيير في التوليف بين هذين الشرطين، بل ويعتبر أي تغيير في معدلات تسوس، يمكن أن يستنتج أن التغيرات المقيسة في الجيش الملكي النيبالي ترجع إلى التنظيم للتوليف. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن كل تقنيات قياس وظيفة الحمض النووي الريبي فقط بتقدير مستويات الحمض النووي الريبي وتهمل تماما للتحقيق في آليات أخرى للتأثير على مهام الجيش الملكي النيبالي مثل التعديلات الكيميائية14.
منذ هي المحتضنة الخلايا مع BrU لالا ح 1، يمكن مرناس المنتجة ببطء شديد من الصعب قياس استخدام أسلوب BrU للملكية الفكرية. وهذا هو نقطة واحدة حيث يمكن استعمال مثبطات النسخي مثل α-أمانيتين ووالاكيتنوميسين د المفضل على مدى BrU للملكية الفكرية، ومع ذلك، يمكن استخدام فقط قياس التغيرات في التدهور وعدم مباشرة قياس إنتاج الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا التغلب على مستويات منخفضة من الحمض النووي الريبي المسمى BrU بزيادة فترة حضانة المرض مع برو، على الرغم من الأوقات حضانة طويلة تزيد من خطر التأثيرات بتدهور الجيش الملكي النيبالي. في هذه الحالة، لم يعد ممكناً معرفة ما إذا كانت التغييرات في الجيش الملكي النيبالي المسمى BrU سببها التغييرات في إنتاج الحمض النووي الريبي أو الانحلال.
في هذا المثال، تحليل رنا المسمى BrU القبض على المتلقين للمعلومات تتم باستخدام قبكر RT، بيد الجيل التالي تسلسل أيضا أسلوب المتلقين للمعلومات مستخدمة على نطاق واسع للشاشة للتغييرات في مجموعة كبيرة من الكشف2،13. وبالمثل، الأسلوب الذي لا يقتصر على تحليل مرناس، ولكن يجوز تحليل جميع أنواع الكشف2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
مؤسسة Lundbeck، جامعة آرهوس، وداندريتي، والشركة Lundbeck تؤيد هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
