Summary
Denne metoden kan brukes til å måle RNA syntese. 5-Bromouridine er lagt til celler og innlemmet i syntetisert RNA. RNA syntese måles av RNA utvinning umiddelbart etter merking, etterfulgt av 5-Bromouridine-målrettet immunoprecipitation av merket RNA og analyse av omvendt transkripsjon og kvantitative polymerasekjedereaksjons.
Abstract
Når steady state RNA nivåer sammenlignes mellom to betingelser, er det ikke mulig å skille om forandringer er forårsaket av endringer i produksjon eller degradering av. Denne protokollen beskriver en metode for måling av RNA produksjon, bruker 5-Bromouridine merking av RNA etterfulgt av immunoprecipitation, som gjør etterforskningen av RNA syntetisert innen kort tid (f.eks, 1 time). Fordelen av 5-Bromouridine-merking og immunoprecipitation over bruken av giftige transcriptional hemmere, som α-amanitin og actinomycin D, er at det er ingen eller svært lav effekt på cellen levedyktighet under kortvarig bruk. Men fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation bare fanger RNA produsert innen kort merking tiden, sakte produsert samt raskt forringes kan RNA være vanskelig å måle på denne måten. Den 5-Bromouridine-merket RNA fanget av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres av omvendt transkripsjon, kvantitativ polymerasekjedereaksjons og neste generasjons sekvensering. Alle typer RNA kan undersøkes og metoden er ikke begrenset til måle mRNA som presenteres i dette eksempelet.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) tillater studiet av RNA produksjon i celler uten eller svært begrenset effekter på celle fysiologi under kort merking periode1,2. Metoden er basert på innlemmelse av syntetisk uridine derivative BrU i nylig syntetisert RNA etterfulgt av IP av merket med anti-BrU antistoffer (figur 1).
Det har vært kjent for flere tiår at proteinsyntese transcriptionally kan reguleres og eksistensen av transkripsjonsfaktorer var hypotesen mer enn 50 år siden3. I dag, det er kjent at flere sykdommer er forårsaket av feilregulering transkripsjon og RNA stabilitet (supplerende figur S1 i referanse4), og muligheten til å måle endringer i RNA produksjon er av stor betydning i forståelsen sykdom utvikling.
Derimot, gir verktøy å regulere RNA produksjon nye muligheter for behandling av sykdommer forårsaket av for lite eller for mye protein uttrykk eller protein akkumulering som i Parkinsons sykdom (PD). Dominerende protein samler som uløselig mengdefunksjoner i PD er α-synuclein, og nivået av α-synuclein er direkte knyttet til sykdommen, som gene multiplikasjon av α-synuclein genet fører familiær PD5. Videre samler α-synuclein i en konsentrasjon avhengige måte. Downregulation α-synuclein mRNA nivåer er derfor en interessant terapeutiske strategi, som har vært vellykket oppnådd ved hjelp av RNA-interferens redusere neuronal celle tap i PD gnager modeller6,7.
Det er viktig å kunne måle endringene i RNA produksjon skyldes sykdom eller terapeutisk intervensjon. Toppmoderne metoder endret for måling steady state nivåer av som omvendt transkripsjon etterfulgt av kvantitative polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR), ikke kan skille mellom endringer forårsaket av transcriptional regulering eller RNA stabilitet. Brukte metode for undersøkelse av RNA forfall priser er blokkering av transcriptional maskiner bruker forbindelser som α-amanitin eller actinomycin D etterfulgt av målinger av råtnende RNAs. Det er imidlertid noen problemer forbundet med en total blokkering transkripsjon i celler, for eksempel induksjon av apoptose8,9. Foruten de cytotoksiske effektene presentere transcriptional hemmere også flere tekniske problemer som treg mobilnettet opptak av α-amanitin og mangel på spesifisitet av actinomycin D (omtalt i referanse10).
For å unngå total blokkering transkripsjon, brukt nukleotid analoger som 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) og BrU. Disse er lett tatt opp av pattedyrceller og innlemmet i nylig syntetisert RNA, aktivere puls-merking av RNA innenfor en bestemt tidsramme. BrU er mindre toksiske enn 5-EU og 4-TU, gjør det foretrukne analog valg11,12.
BrU-IP kan brukes til å undersøke både frekvensen av RNA syntese og stabilitet, og dermed skille mellom de underliggende årsakene til endringer i totalt RNA. Denne artikkelen vil fokusere på måling av RNA syntese og refererer referanse2 for detaljer om etterforskningen av RNA stabilitet. Undersøke RNA syntese, merkes kort celler med BrU f.eks 1t etterfulgt av BrU-IP1 (figur 1 c). Dette kan målinger av RNA syntetisert i den korte merking tiden og observerte endringer vil gi et bedre estimat av regelverket i RNA syntese enn ved å måle endringer i totalt RNA av RT-qPCR. Det bør nevnes, imidlertid, at selv om merking tiden er, for eksempel bare 1 h, degradering fortsatt har en innflytelse på RNA nivåene observert.
RNA fra BrU-IP eksperimenter er egnet for nedstrøms analyse av både RT-qPCR1 eller neste generasjons sekvensering2,13. Andre standard RNA gjenkjenningsmetoder, som Nord blotting eller ribonuclease beskyttelse analysen, kan også gjelde for enkelte RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Utføre alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er oppgitt og holde buffere på isen eller i kjøleskapet (unntatt fra tilsettes buffer inneholder SDS). Protokollen er delt i 5: Forberedelse av RNA prøver; utarbeidelse av perler for IP; binding av BrU-merket til perler; elueringsrør og rensing av bundet BrU-merket av 3 trinn fenol-fenol/kloroform-kloroform utvinning; analyse av RNA (i dette eksempelet bruker RT-qPCR)
1. forberedelse av prøver
- Antall HEK293T celler ved hjelp av en automatisert celle counter og frø 3,500,000 celler i en 10 cm Petriskål i 10 mL vekst medier (Dulbeccos endret Eagle's Medium supplert med 10% fosterets kalv serum og 50 µg/mL penicillin/streptomycin) for å få totalt > 40 µg RNA ved utpakking 48 timer senere. Opprettholde cellene på 37 ° C og 5% CO2.
- 48 timer etter seeding, Sug opp 8 mL vekst medier og etterlate 2 mL for å unngå uttørking cellene. Legg 2 mM BrU og behandling til de 8 mL pustende vekst medier, og fjerne gjenværende 2 mL fra cellene før at det 8 mL BrU som inneholder vekst medier. Unngå bruk av fersk media ved bruk av BrU til cellene, siden dette kan skape genuttrykk.
- Inkuber cellene 1t med BrU og behandling. Vask cellene i 5 mL Hank's buffer og trypsinize celler med 2 mL 0,05% trypsin. Legge til 8 mL vekst medier for å stoppe reaksjonen overføre cellene til en 15 mL tube og Nedspinning cellene i 2 minutter på 1000 x g.
- Fjerne nedbryting og ekstra totale RNA fra cellen pellet bruker en RNA isolering kit (se Tabell for materiale) eller andre foretrukket metode, og elute i RNase-fri H2O. Store RNA ved-80 ° C helt klar til å fortsette.
2. utarbeidelse av perler for IP
- Forberede perler i grupper av prøver undersøkes pluss en ekstra til kontoen for tap under pipettering og virvler miksing. Resuspend anti-musen IgG magnetiske perler grundig av virvel miksing og ta ut 20 µL perler per prøve i en RNase-fri 1,5 mL tube. Sted 1,5 mL røret en magnetisk og la ca 20 s perler å samle på siden.
- Fjerne nedbryting, ta ut røret fra magnetiske stativet og resuspend 400 µL 1 x BrU-IP buffer av pipettering. Spin røret veldig kort for 2 s i en bord sentrifuge, sett den tilbake i den magnetiske stå og fjerne nedbryting. Gjenta trinnet vask en gang.
- Blokk uspesifikke binding til perlene bruker heparin. Resuspend perler i 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparin buffer, og la roterende 30 min. vaskes perlene en gang, som i trinn 2.2.
Merk: Heparin er en negativt ladde polymer som vil konkurrere med RNAs for bindingen. tRNA eller andre irrelevante RNAs kan også brukes hvis programmet nedstrøms ikke er sekvensering. - Resuspend perler i 1 mL 1 x BrU-IP bufferen og legge 1,25 µg/sample anti-α-Bromodeoxyuridine antistoff, som gjenkjenner også BrU. Inkuber perlene 1t mens rotere eller over natten i romtemperatur.
- Vask perlene tre ganger i trinn 2.2. Resuspend perler i 50 µL/prøve 1 x BrU-IP buffer supplert med 1 mM BrU og la roterende for 30 min å redusere følsomheten til antistoffer bundet til perlene og herved risikoen for uspesifikke bindende under IP.
- Vask perlene tre ganger i trinn 2.2, og resuspend i 50 µL/prøve 1xBrU-IP-bufferen.
3. binding av BrU-merket til perler
- Måle RNA konsentrasjonene i RNA ekstrakter fra trinn 1.3 bruker UV-synlig spectrophotometry, og fortynne 40 µg RNA fra hver prøve i RNase-fri H2O til et totalt volum på 200 µL.
- Varme RNA prøver i 2 minutter på 80 ° C til denature RNA og spinn kort i en tabletop sentrifuge. Legge til 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse hemmer.
- Legge til 50 µL resuspended og forberedt perler fra trinn 2.6 til hver prøve og la roterende 1 h. vask perlene fire ganger i trinn 2.2.
4. elueringsrør og rensing av av 3 trinn fenol-fenol/kloroform-kloroform utvinning
-
Elute RNA og utføre fenol utvinning
- Resuspend perler i 200 µL elueringsbufferen å elute RNA og raskt etterpå legge 200 µL fenol, pH 6.6 (Advarsel: giftig, se merknaden nedenfor trinn 4.1.2) å fjerne alle ikke-RNA molekyler fra utvalget.
- Virvel mix prøven og spin 3 min 25.000 x g i en tabletop sentrifuge.
Merk: Fenol er giftig og bør behandles i avtrekksvifte iført hud sikringen. Litt surt pH sikrer at bare RNA og DNA, er utdraget. RNA forblir i den øvre vandige fasen på grunn hydrofile av kostnader. Hydrofobe kjernene proteiner vil binde fenol og flytte til den nedre organiske fenol-fasen.
-
Utføre fenol-kloroform utvinning
- Sug opp så mye øvre-fase som mulig (ca 190 µL av 200 µL, avhengig av erfaring i håndtering) og flytter det til en rør med 200 µL fenol/kloroform, pH 6.6 (Advarsel: giftig, se note). Kontroller at samme beløp som inneholder over prøver.
- Virvel bland utvalg og spinn for 3 min 25.000 x g.
Merk: Kloroform er giftig og bør behandles i avtrekksvifte iført hud sikringen. Kloroform legges til fjerne fenol, som kan påvirke nedstrøms analyse av RNA begrenser omvendt transkripsjon14 og polymerase kjedereaksjoner15.
- Utføre kloroform utvinning av aspirating den vandige øvre fasen som før (nå ca 180 µL), og overføre til et rør som inneholder 200 µL kloroform. Virvel bland prøven og spin 3 min 25.000 x g.
- Sug opp den vandige øvre fasen som før (nå ca 170 µL) og overføre den til et rør som inneholder 17 µL (1/10 volum) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Å nøytralisere og utløse RNA fra vandig løsning, legge 2 µL glykogen (20 mg/mL), som precipitates sammen med RNA og gjør RNA pellet mer synlig.
- Legg til 500 µL 96% etanol å øke bindingen mellom salt ioner og RNA og blanding av invertere røret et par ganger. La røret overnatting på 20 ° C eller 15 min på tørris.
- Spinn prøven på 25.000 x g, 4 ° C for 30 min. Forkast nedbryting uten å forstyrre pellet og vaske pellet i 185 µL 75% etanol å fjerne eventuelle gjenværende salt. Spinn på 25.000 x g, 4 ° C i 5 minutter.
- Forkaste nedbryting helt uten å forstyrre pellet og la pellets til tørk 5-10 min med en åpne lokket. Resuspend i 10 µL RNase-fri H2O brukes på siden av røret for å unngå å forstyrre pellet.
5. analyse av RNA
- Utarbeide cDNA ved hjelp av en cDNA omvendt transkripsjon kit (se Tabell for materiale) eller andre foretrukket metode å bruke 2 µL RNA prøven og 1 µg gjær totale RNA som bærer RNA for cDNA syntese reaksjonen (ikke brukt hvis cDNA brukes for neste generasjons sekvensering). Bruk 1 µg RNA uten gjær RNA for cDNA utarbeidelse av tilhørende inngangen.
- Fortynne cDNA 1:25 og blanding 9 µL fortynnet cDNA med 10 µL qPCR Master mix og 1 µL fluorogenic sonde, begge angis i Tabellen for materiale.
Merk: CDNA fortynning avhenger cDNA forberedelse og qPCR metoden brukes. - Kjøre følgende qPCR program (f.eks på en 7500 rask Real-time PCR system eller tilsvarende): 2 min ved 50 ° C, 20 s på 95 ° C, 40 sykluser av 3 s på 95 ° C og 30 s på 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår første testene BrU-merking tid ble utført i AsPC-1 celler. Cellene ble behandlet med BrU til 0, 1, 2 og 4.5 h, etterfulgt av totale RNA utvinning og BrU-IP. GAS5 og GAPDH ble målt i BrU-IP RNA, som viste at 1t merking var tilstrekkelig til å nå en ca 9 - og 44 ganger endring sammenlignet med bakgrunnen (0 h) for GAPDH og GAS5, henholdsvis.
BrU-IP og analyse beskrevet ovenfor ble brukt til å undersøke om endringene oppdaget i steady state nivåer av α-synuclein mRNA på Polo-lignende kinase 2 (PLK-2) hemming var forårsaket av endringer i mRNA syntese1. En 1t merking tid ble valgt fordi dette gir tilstrekkelig merking sammenlignet med bakgrunnen (figur 2), og også tillater behandling tid å ha en effekt. 2 mM BrU behandling ikke få morfologiske endringer i HEK293T celler for 1t eller lengre 4 h behandling (figur 3A).
Α-Synuclein transfekterte HEK293T celler ble behandlet for 1t med DMSO eller en bestemt PLK-2-hemmer (PLK-2i) i nærvær av BrU merke fersk syntetisert RNA. Cellene ble heretter høstet og totale RNA ble pakket ut. BrU-merket RNA produsert i 1t behandling ble samlet inn med BrU-IP ("BrU-IP" i figur 3B) fra den totale pool av RNA ("Input" i figur 3B). Mengden av RNA oppnådd med BrU-IP fra 40 µg starter materiale varierer mellom ulike linjer, og vanligvis får ca 500 ng fra HEK293T cellene, men bare 10-50 ng fra HeLa celler. PLK-2 hemming forårsaket en økning i α-synuclein mRNA i både inn- og BrU-IP (figur 3B) tyder på at økningen i steady state RNA skyldes en økning i syntesen av RNA. Å sikre at PLK-2i ikke bare føre til en generell økning i RNA produksjon, 3 ekstra endogene gener (ACTB, HMBS og NADH) ble målt (Figur 4). Ingen av disse genene ble økt i Input (figur 4A) og BrU-IP (figur 4B) på PLK-2i behandling.
For å validere spesifisiteten av BrU-IP, ble en kontroll med ikke-BrU behandlet celler. Nivåene av 18sRNA av BrU-IP fra BrU-behandlet og ubehandlet celler ble sammenlignet (figur 5). Dette viser klart at BrU-IP er svært spesifikke og fanger bare en liten brøkdel av den ikke-merket RNA (figur 5).
Fordi RNA BrU-merket er bare produsert i 1 time, er det viktig å velge en riktig referanse genet, siden noen normalt egnet gener kan uttrykkes for Lavinnblanding å være pålitelig. 18sRNA ble valgt som en referanse genet for dataene som vises i figur 3B og Figur 4 på grunn av sin høye overflod. Flere referanse gener, men testet, og noen viste høy terskel sykluser (> 30) (figur 6). Dataene viser også at forskjellen mellom BrU-merket IP'ed RNA og totale RNA i inndataene er ca 5 Ct's, og noen RNAs uttrykt i små mengder i cellen kan derfor ikke skal oppdages etter BrU-IP.
Figur 1: beskrivelse av BrU-IP for undersøkelse av RNA syntese. (A) RNA transkribert i celler fra DNA av RNA-polymerases. (B) på tillegg til media, BrU er tatt opp av celler og innlemmet i den nylig transkribere RNA. (C) For å måle RNA syntese priser: (1) nylig syntetisert RNA er merket 1t med BrU, (2) RNA er Hentet fra cellene umiddelbart etter merking, (3) BrU-merket RNA er immunoprecipitated bruker anti-BrU antistoffer, (4) BrU-merket (og tilsvarende inngang) analyseres RNA av RT-qPCR eller sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vurdering av merking tid. Eksempel på en innledende vurdering av BrU-merking tid. AsPC-1 celler dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplert med 10% fosterets bovin serum og 50 U/mL / 50 µg/mL penicillin/streptomycin ble behandlet med BrU i en siste konsentrasjon av 2 mM for 0, 1, 2 og 4.5 h før RNA utvinning og analyse av RT-qPCR. Dataene er kvantifisert som 2-Ct, og blir presentert som den tekniske triplicates ± standardavvik, n = 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultater som viser Input og BrU-IP RNA DMSO og PLK-2i behandlet celler. (A) 1 time og 4 h 2 mM BrU behandling ikke få synlige morfologiske endringer i HEK293T celler. Skala bar = 100 µm. (B) tilpasset figur Referanse1. 3,500,000 HEK293T celler ble sådd per 10 cm rett og transfekterte med en plasmider uttrykke α-synuclein 24 h etter seeding. 24 h innlegget transfection celler ble inkubert 1t med BrU i nærvær av DMSO eller PLK-2i, etterfulgt av RNA utvinning og BrU-IP. Analyse av RNA ble gjort av RT-qPCR ved hjelp av sonden sett rettet mot menneskelig SNCA (α-synuclein) og 18sRNA. BrU-IP og Input SNCA ble kvantifisert i forhold til BrU-IP og inngang 18sRNA, henholdsvis med metoden 2-ΔΔCT . Resultatene var normalisert til DMSO-behandlet prøvene. Dataene er presentert så bety ± standardavvik. Statistiske sammenligninger ble utført med Student kortet t-test, * p < 0,001, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: måling av andre gener ikke endres av PLK-2i. PLK-2i endrer verken totale eller syntetisert RNA av ACTB, HMBS og NADH. (A) ACTB, HMBS og NADH RNA inndata ble målt i tre eksemplarer i ett eksperiment og kvantifisert i forhold til 18sRNA i Input med metoden 2-ΔΔCT . Verdier var normalisert til DMSO behandlet prøvene og barer representerer gjennomsnittet av triplicates ± standard avvik, n = 1. (B) ACTB, HMBS og NADH ble også målt i BrU-IP'ed RNA og kvantifisert i forhold til 18sRNA i BrU-IP. Verdiene ble normalisert til DMSO og presentert som A, n = 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: spesifisitet av BrU-IP. For sammenligning av 18sRNA av BrU-IP fra BrU - og ikke-BrU-behandlet celler, ble RNA fra BrU-IP godkjent i forhold til Input RNA hensyn til forskjeller i å starte materiale og heretter normalisert BrU-behandlet smakebiter. Bare en liten brøkdel (0,002) av ikke-BrU-merket 18sRNA var immunoprecipitated, viser at BrU-IP er svært spesifikke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: nivåer av forskjellige mRNAs i BrU-IP RNA forhold til Input RNA. Flere potensielle referanse gener ble testet fordi noen RNAs vil være tilstede i svært lave konsentrasjoner i BrU-IP RNA på grunn av små mengder produsert RNA innen 1 h BrU behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver bruken av BrU-IP for fastsettelse av RNA produksjonen av merking av nylig produsert RNA 1t med BrU, etterfulgt av umiddelbar RNA utvinning og immunoprecipitation av BrU-merket. Denne metoden har tidligere blitt beskrevet i referanse16, og denne artikkelen inneholder noen tilleggstrinn for å øke IP spesifisitet og RNA renhet, av pre behandlende perler med lave konsentrasjoner BrU samt et fenol-kloroform rensing skritt øke RNA renhet følgende IP. I tillegg presenterer vi også data her viser spesifisitet av BrU-IP ved å sammenligne RNA tatt fra BrU og ikke-BrU behandlet celler. Fenol-kloroform rensing er billig, men vurderer de lave mengder RNA merket med BrU, økt signaler i nedstrøms kan oppnås ved hjelp av RNA oppryddingen kits i stedet. Vår erfaring er at det meste lik utvinning av over prøver er oppnådd med fenol-kloroform rensing.
BrU-merking og -IP er, i motsetning til analyse av totale RNA nivåer, undersøke de underliggende årsakene til endringer i steady state RNA nivåer. Metoden har ingen eller begrenset effekter på cellen fysiologi, i motsetning til bruk av transcriptional hemmere slik som α-amanitin og actinomycin D. Det har blitt foreslått at sammenligning av nylig syntetisert steady state nivåer kan brukes til å beregne RNA forfall priser17, og BrU-IP metoden beskrevet her kan samtidig fastsettelse av både RNA syntese og nedbrytning i ett analysen.
I figur 5vist vi at RNA er bare IP'ed fra BrU behandlet celler, viser at det er faktisk BrU innlemmet i RNA i cellen linje her. Imidlertid foreslår vi gjennomføre en første test av BrU innlemmelse i RNA i andre linjer før du utfører BrU-IP. Dette kan for eksempel gjøres ved hjelp av anti-BrU antistoffer for å kvantifisere BrU i totale RNA ekstrakter via dot blot eller koblede enzym-immunosorbent analysen.
Her har vi ikke presentert en test av BrU-IP effektivitet over eksempler, men dette kan undersøkes med BrU-merket toppene i RNA enten produsert i vitro eller fra en annen organisme, som Drosophila melanogaster. Denne RNA kan deretter også brukes i nedstrøms quantifications og normalizations.
Korrekt pipettering teknikk er avgjørende når du utfører svært følsom kvantitative analyser, som BrU-IP og RT-qPCR, og en spesiell innsats bør gjøres å utføre like pipettering over prøver. Fenol-kloroform utdrag krever litt erfaring, men på utilfredsstillende pipettering, vann- og fenol/kloroform fasene kan være re-mikset og sentrifugeres igjen.
Denne protokollen antyder BrU-merking 1t når du måler RNA syntese. Merking nå gir et grovt overslag over endringer i transkripsjon, siden fleste menneskelige og mus mRNAs er kostnadsberegnet til har halveringstid > 6 h18,19. Forsiktighet bør imidlertid, utvises ved å tolke dataene innhentet, siden mange RNAs har < 1 h18,19, som flere utskrifter av Lipid A, som raskt øke ved stimulering og falle tilbake til Base linje nivåer innen 2 timer etter induksjon20. For å redusere risikoen for påvirkninger fra RNA fornedrelse, tiden BrU-merking kan reduseres, men det er også viktig å merke nok RNA å skille RNA innhentet av BrU-IP fra bakgrunnen (som ble innhentet etter 1t merking i våre hender ( Figur 2)). Et annet alternativ er å måle både RNA syntese og nedbrytning av genet av interesse BrU-merking og IP, sistnevnte er beskrevet i2. Data fra disse to tilnærmingene utfylle hverandre, og hvis en endring i syntese mellom to betingelser måles, men ingen endring er sett i forfall priser, kan det konkluderes at målt endringene i RNA skyldtes regulering av syntese. Det er imidlertid viktig å huske at begge teknikkene bare måle RNA funksjonalitet estimering av RNA nivåer og helt unnlater å undersøke andre mekanismer påvirke RNA funksjoner som kjemiske modifikasjoner14.
Siden cellene er ruges med BrU bare 1t, kan veldig sakte produsert mRNAs være vanskelig å måle bruker metoden BrU-IP. Dette er ett punkt der bruk av transcriptional hemmere som α-amanitin og actinomycin D kan være foretrukket over BrU-IP, men de kan bare brukes til å måle endringer i nedbrytning og ikke direkte måle RNA produksjon. De lave nivåene av BrU-merket kan også løses ved å øke inkubasjon tiden med BrU, men lang incubation ganger øke risikoen for påvirkning av RNA degradering. I så fall er det ikke lenger mulig å vite om endringer i BrU-merket RNA skyldes endringer i RNA produksjon eller forfall.
I dette eksemplet nedstrøms analyse av det fanget BrU-merket RNA utføres ved hjelp av RT-qPCR, neste generasjons sekvensering er imidlertid også brukte nedstrøms metode til skjermen for endringer i et stort utvalg av RNAs2,13. Tilsvarende metoden er ikke begrenset til analyse av mRNAs, men kan analysere alle typer RNAs2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Lundbeck stiftelsen, Aarhus universitet, Dandrite og Lundbeck A/S støttet dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
