Summary
Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.
Abstract
Wenn Steady-State RNA-Ebene zwischen zwei Bedingungen verglichen werden, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob Änderungen durch Veränderungen in der Produktion oder Abbau der RNA entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der RNA-Produktion, mit 5-Bromouridine Kennzeichnung von RNA, gefolgt von Immunopräzipitation, die Untersuchung der RNA synthetisiert innerhalb eines kurzen Zeitraums (z.B. 1 h) ermöglicht. Der Vorteil von 5-Bromouridine-Kennzeichnung und Immunopräzipitation über die Verwendung von giftigen transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D ist, dass es keine oder sehr geringe Auswirkungen auf die Zellviabilität bei kurzfristigen Einsatz. Da 5-Bromouridine-Immunopräzipitation nur RNA produziert innerhalb der kurzen Kennzeichnung Zeit erfasst, langsam erzeugt sowie schneller abgebaut kann RNA jedoch schwierig, mit dieser Methode zu messen sein. Die 5-Bromouridine-gekennzeichnete RNA durch 5-Bromouridine-Immunopräzipitation erfasst kann durch reverse Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden. Alle Arten von RNA untersucht werden können, und die Methode beschränkt sich nicht auf mRNA zu messen, wie in diesem Beispiel dargestellt wird.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) Immunopräzipitation (IP) ermöglicht die Untersuchung der RNA-Produktion in Zellen ohne oder sehr begrenzte Auswirkungen auf die Zelle Physiologie während der kurzen Periode1,2Kennzeichnung. Die Methode basiert auf Einbeziehung der synthetischen Uridin Ableitung BrU in neu synthetisierte RNA gefolgt von IP-Adresse des gekennzeichneten RNA mit Anti-BrU-Antikörpern (Abbildung 1).
Es ist bekannt für Jahrzehnte die Proteinsynthese transcriptionally geregelt werden kann, und die Existenz von Transkriptionsfaktoren wurde vor mehr als 50 Jahren die Hypothese3. Heute ist bekannt, dass verschiedene Krankheiten durch Dysregulation der Transkription und der Stabilität der RNA entstehen (ergänzende Abbildung S1 in Referenz4), und die Fähigkeit, Veränderungen in der Produktion von RNA zu messen ist von großer Bedeutung im Verständnis der Krankheit Entwicklung.
Auf der anderen Seite bieten Werkzeuge, RNA-Produktion zu regulieren neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die durch zu wenig oder zu viel Protein-Expression oder Protein Akkumulation wie z. B. bei Morbus Parkinson (PD). Das vorherrschende Protein akkumulieren als unlösliche Aggregate in PD ist α-Synuclein und das Niveau der α-Synuclein knüpft direkt an die Krankheit, wie gen-Multiplikation des α-Synuclein Gens familiäre PD5verursacht. Darüber hinaus sammelt α-Synuclein in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Herabregulation von α-Synuclein-mRNA-Niveaus ist daher eine interessante therapeutische Strategie, die erfolgreich erreicht worden ist, mit RNA-Interferenz, um neuronaler Zellverlust im PD Nager-Modelle6,7zu verringern.
Es ist wichtig, um Änderungen in der RNA Produktion verursacht durch Krankheit oder therapeutische Interventionen zu messen können. Modernste Methoden verändert für Steady-State Messhöhen RNA, wie reverse Transkription, gefolgt von quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), nicht in der Lage sind, die Unterscheidung zwischen Änderungen durch transcriptional Regelung oder RNA-Stabilität. Eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung der RNA Zerfall Sätze blockiert der transkriptionellen Maschinen mit Verbindungen wie α-Amanitin oder Actinomycin D gefolgt von Messungen der verfallenden RNAs. Allerdings gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit einer allgemeinen Blockade der Transkription in Zellen, wie Induktion der Apoptose8,9. Neben der zytotoxischen Effekte präsentieren transcriptional Hemmer auch mehrere technische Probleme wie langsame zelluläre Aufnahme von α-Amanitin und mangelnde Spezifität von Actinomycin D (rezensiert in Referenz10).
Um die allgemeine Blockierung der Transkription zu vermeiden, wurden Nukleotidanaloga verwendet, z. B. 5-Ethynyl Uridin (5-EU) und 4-Thiouridine (4-TU) BrU. Diese sind leicht von Säugerzellen aufgegriffen und integriert neu synthetisierte RNA ermöglichen, Puls-Kennzeichnung von RNA innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. BrU ist weniger toxisch als EU-5- und 4-TU, so dass es die bevorzugte Analogon zur Wahl11,12.
BrU-IP kann verwendet werden, zu untersuchen, die bei RNA-Synthese und Stabilität, und somit zu unterscheiden zwischen den zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Gesamt-RNS. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Messung der RNA-Synthese und bezieht sich auf2 für Details zur Untersuchung der Stabilität der RNA um zu verweisen. Um RNA-Synthese zu untersuchen, werden Zellen kurz mit BrU z.B. für 1 h, gefolgt von BrU-IP-1 (Abbildung 1) gekennzeichnet. Dies ermöglicht Messungen der RNA synthetisiert innerhalb der kurzen Zeit der Kennzeichnung und beobachtete Veränderungen geben eine bessere Schätzung der Vorschriften in der RNA-Synthese als durch die Messung von Veränderungen im gesamten RNA durch RT-qPCR. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass obwohl die Kennzeichnung, z. B. nur 1 h dauert Abbau noch einen Einfluss auf die RNA-Ebenen beobachtet haben kann.
RNS von BrU-IP-Experimente eignen sich für nachgelagerte Analyse von RT-qPCR1 oder nächste Generation Sequenzierung2,13. Andere standard RNA Nachweisverfahren, wie Nordbeflecken oder Ribonuklease-Protection-Assay können auch für bestimmte RNAs gelten.
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Protocol
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben und halten Sie Puffer auf Eis oder in den Kühlschrank stellen (mit Ausnahme von der Elution buffer mit SDS). Das Protokoll ist in 5 Abschnitte unterteilt: Vorbereitung der RNA-Proben; Vorbereitung der Perlen für IP; Bindung von BrU gekennzeichnet RNA zu Perlen; Elutions- und Reinigung des gebundenen BrU gekennzeichnet RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion; Analyse der RNA (in diesem Beispiel mit RT-qPCR)
1. Vorbereitung des RNA-Proben
- Graf HEK293T Zellen unter Verwendung einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken und Saatgut 3.500.000 Zellen in einer 10 cm Petrischale in 10 mL Wachstumsmedien (Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum und 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin) um insgesamt zu erhalten > 40 µg RNA bei der Extraktion 48 h später. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten.
- 48 h nach der Aussaat, Aspirieren Wachstumsmedien 8 mL und 2 mL auf die Zellen Austrocknen vermeiden hinterlassen. Fügen Sie 2 mM BrU und jede Behandlung auf die 8 mL aspiriert Wachstumsmedien, und entfernen Sie die restlichen 2 mL aus den Zellen vor erneuten 8 mL enthaltende Wachstumsmedien BrU. Vermeiden Sie den Einsatz von frischen Medien auf Antrag von der BrU an den Zellen, da diese Änderungen in der Genexpression zu induzieren.
- Inkubieren Sie die Zellen 1 h mit BrU und Behandlung. Waschen Sie die Zellen in 5 mL Hank Puffer und trypsinize der Zellen unter Verwendung von 2 mL 0,05 % Trypsin. Fügen Sie 8 mL Wachstumsmedien um die Reaktion zu stoppen, die Zellen an eine 15 mL Tube übertragen und spin-down der Zellen für 2 min bei 1.000 x g hinzu.
- Entfernen den überstand und Gesamt-RNS aus der Zelle Pellet mit RNA Isolierung extrahieren kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere Methode bevorzugt, und eluieren in RNase-freie H2O. Store die RNA bei-80 ° C bis bereit zu gehen.
2. Vorbereitung von Perlen für IP
- Die Anzahl der Samples zu untersuchenden plus eins extra abzurechnen Verlust beim pipettieren und wirbeln mischen bereiten Sie Perlen in Chargen vor. Aufschwemmen Sie Anti-Maus IgG magnetische Beads gründlich durch das Mischen von Wirbel und nehmen Sie 20 µL Perlen pro Probe in eine RNase-freie 1,5 mL-Tube. Ort der 1,5 mL Tube in einem Magnetstativ und lassen ca. 20 s für die Perlen auf der Seite zu sammeln.
- Den überstand zu entfernen, nehmen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ und Aufschwemmen in 400 µL 1 X BrU-IP-Puffer durch pipettieren. Drehen Sie das Rohr ganz kurz für 2 s in einer Zentrifuge Tischplatte legen Sie sie zurück in die Magnetstativ und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die Waschschritt einmal.
- Block unspezifische Bindung an die Perlen mit Heparin. Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 X BrU-IP + 1 mg/mL Heparin Puffer und drehen für 30 min. waschen die Perlen einmal, wie in Schritt 2.2 verlassen.
Hinweis: Heparin ist ein negativ geladenes Polymer, das für die Bindung mit RNAs konkurrieren. tRNA oder andere irrelevant RNAs können auch verwendet werden, wenn die nachgeschaltete Anwendung nicht Sequenzieren ist. - Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 x BrU-IP-Puffer und 1,25 µg/Probe Anti-α-Bromodeoxyuridine Antikörper, der erkennt auch BrU hinzufügen. Inkubieren Sie die Perlen für 1 h beim Drehen, oder über Nacht bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2. Aufschwemmen der Perlen in 50 µL/Probe 1 X BrU-IP-Puffer mit 1 mM BrU und lassen drehen für 30 min, die Empfindlichkeit der Antikörper gebunden, die Perlen und hiermit zu senken das Risiko der unspezifischen Bindung UZ ergänzt.
- Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2 und Aufschwemmen in 50 µL/Probe 1xBrU-IP-Puffer.
3. verbindliche BrU gekennzeichnet RNA, Perlen
- RNA-Konzentrationen in der RNA-Auszüge aus Schritt 1.3 Messen mit Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie, und 40 µg RNA von jeder Probe in RNase-freie H2O auf ein Gesamtvolumen von 200 µL zu verdünnen.
- Erwärmen Sie RNA-Proben für 2 min bei 80 ° C zu denaturieren RNA und Spin kurz in einer Tischplatte Zentrifuge. Fügen Sie 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse-Inhibitor.
- Fügen Sie 50 µL Nukleinsäuretablette und Perlen aus Schritt 2.6 zu jeder Probe vorbereitet und rotierenden 1H waschen die Perlen viermal wie in Schritt 2.2 zu verlassen.
4. Elutions- und Reinigung der RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion
-
Eluieren Sie RNA und durchführen Phenol Extraktion
- Aufschwemmen der Perlen in 200 µL Elution Puffer zu eluieren RNA, und schnell Danach fügen Sie 200 µL Phenol, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Hinweis unten Schritt 4.1.2), nicht-RNA-Moleküle aus der Probe zu entfernen.
- Whirl-Mischung der Probe und Spin 3 min bei 25.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge.
Hinweis: Phenol ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Die leicht saure pH-Wert sorgt dafür, dass nur RNA und nicht DNA extrahiert. Die RNA wird in der oberen wässrigen Phase aufgrund der hydrophilen Gebühren bleiben. Die hydrophobe Kerne von Proteinen werden Phenol zu binden und die untere Bio Phenol-Phase bewegen.
-
Phenol-Chloroform Extraktion durchführen
- Aspirieren Sie soviel obere Phase wie möglich (ca. 190 µL 200 µL, je nach Erfahrung im Handling) und verschieben Sie ihn auf ein Rohr mit 200 µL Phenol/Chloroform, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Anmerkung). Achten Sie darauf, die gleiche Menge über Proben Aspirieren.
- Whirl Mischen der Probe und Spin für 3 min bei 25.000 x g.
Hinweis: Chloroform ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Chloroform wird hinzugefügt, Phenol, entfernen die nachgelagerte Analyse der RNA durch Hemmung der reversen Transkription14 und Polymerase-Kettenreaktionen15beeinflussen können.
- Chloroform Extraktion durch Absaugen der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt rund 180 µL) durchzuführen und zu einem Schlauch mit 200 µL Chloroform übertragen. Whirl mischen die Probe und spin 3 min bei 25.000 x g.
- Aspirieren der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt ca. 170 µL) und überträgt es auf ein Rohr mit 17 µL (1/10-bändige) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Fügen Sie zu neutralisieren und RNA aus der wässrigen Lösung auszufällen, 2 µL Glykogen (20 mg/mL), die Ausscheidungen zusammen mit RNA und RNA-Pellet sichtbarer macht.
- Fügen Sie 500 µL 96 % Ethanol um Bindung zwischen den Salzionen und RNA und Mischung zu erhöhen durch Umdrehen der Röhre ein paar Mal. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei-20 ° C oder 15 min auf Trockeneis.
- Drehen Sie die Probe bei 25.000 x g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand ohne zu stören das Pellet und waschen Sie das Pellet in 185 µL 75 % Ethanol, Salz zu entfernen. Mit 25.000 x g, 4 ° C für 5 min drehen.
- Verwerfen Sie überstand vollständig zu, ohne zu stören das Pellet und lassen Sie das Pellet 5-10 min mit einem geöffnetem Deckel trocknen. Aufschwemmen Sie in 10 µL RNase-freie H2O auf der Seite der Röhre angewendet, um nicht zu stören das Pellet.
5. Analyse der RNA
- Bereiten Sie cDNA mit einer cDNA reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere bevorzugte Methode mit 2 µL RNA-Probe und 1 µg Hefe Gesamt-RNS als Träger RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion (nicht verwendet, wenn cDNA für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet wird). Verwenden Sie 1 µg RNA ohne Hefe RNA für cDNA Vorbereitung der entsprechenden Eingabe.
- Verdünnte cDNA 01:25 und Mix 9 µL verdünnt cDNA mit 10 µL qPCR Mischung und 1 µL Fluorogenic Sonde, beherrschen beide angegeben in der Tabelle der Materialien.
Hinweis: Die cDNA-Verdünnung richtet sich nach der cDNA Vorbereitung und qPCR-Methode verwendet. - Führen Sie das folgende qPCR-Programm (z. B. auf einem 7500 schnell Real-Time PCR System oder Äquivalent): 2 min bei 50 ° C, 20 s bei 95 ° C, 40 Zyklen von 3 s bei 95 ° C und 30 s bei 60 ° C.
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Representative Results
Unsere ersten Tests der BrU-Kennzeichnung Zeit wurden AsPC-1-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden für 0, 1, 2 und 4,5 h, gefolgt von insgesamt RNA-Extraktion und BrU-IP mit BrU behandelt. GAS5 und GAPDH wurden in BrU-IP-RNA, gemessen, die bewiesen, dass 1 h Kennzeichnung ausreichend, eine ca. 9 - und 44 - fache-Änderung im Vergleich zum Hintergrund (0 h) für GAPDH und GAS5, bzw. zu erreichen war.
BrU-IP und der oben beschriebenen Analyse wurden verwendet, um herauszufinden, ob die Änderungen entdeckt im Steady-State-Niveau von α-Synuclein mRNA auf Polo-Like Kinase 2 (PLK-2) Hemmung durch Veränderungen in der mRNA-Synthese1verursacht wurden. Eine 1 h Kennzeichnung Zeit wurde gewählt, weil dies ausreichende Kennzeichnung im Vergleich zum Hintergrund (Abbildung 2 bietet) und auch die Behandlungszeit erlaubt zu wirken. 2 mM BrU Behandlung nicht morphologischen Änderungen in den HEK293T Zellen für 1 Stunde oder länger 4 h Behandlung (Abbildung 3A) induzieren.
Α-Synuclein transfizierten HEK293T Zellen in Anwesenheit von BrU frisch synthetisierte RNA beschriften für 1 h mit DMSO oder einer spezifischen PLK-2-Inhibitor (PLK-2i) behandelt wurden. Zellen wurden im folgenden geerntet und Gesamt-RNS extrahiert wurde. BrU gekennzeichnet RNA produziert innerhalb der 1 h-Behandlung wurde mittels BrU-IP ("BrU-IP" in Abb. 3 b) aus dem gesamten Pool der RNA ("Input" in Abb. 3 b) erhoben. Die Menge der RNA gewonnen mit BrU-IP von 40 µg Ausgangsstoff variiert zwischen verschiedenen Zelllinien, und wir erhalten in der Regel ca. 500 ng von HEK293T Zellen, aber nur 10-50 ng von HeLa-Zellen. PLK-2 Hemmung verursacht eine Erhöhung in α-Synuclein-mRNA in der Eingabe und BrU-IP (Abb. 3 b) darauf hindeutet, dass die Erhöhung der Steady-State, die RNA durch eine Erhöhung der Synthese von RNA verursacht wird. Um sicherzustellen, dass die PLK-2i nicht nur zu einem Gesamtanstieg in RNA-Produktion wurden 3 weitere endogene Gene (ACTB, HMBS und NADH) gemessen (Abbildung 4). Weder diese Gene wurde in der Eingabe (Abbildung 4A) und BrU-IP (Abbildung 4 b) PLK-2i Behandlung erhöht.
Um die Besonderheit des BrU-IP zu überprüfen, wurde ein Steuerelement mit nicht-BrU behandelt Zellen aufgenommen. Die Höhe der 18sRNA von BrU-IP von BrU-behandelten und unbehandelten Zellen erfasst wurden verglichen (Abbildung 5). Dies zeigt deutlich, dass die BrU-IP hochspezifisch ist und nur einen sehr kleinen Bruchteil der radioaktiv markierten RNA (Abbildung 5 nimmt).
Da die BrU gekennzeichnet RNA nur innerhalb von 1 h produziert wird, ist es wichtig, eine richtige Referenz-gen zu wählen, da einige normalerweise geeignete Gene in zu niedrigen Konzentrationen zuverlässig ausgedrückt werden könnte. 18sRNA wurde als Referenz-gen für die Daten in Abbildung 3 b und Abbildung 4 wegen seiner hohen Fülle gewählt. Einige Referenz-Gene getestet wurden, jedoch, und einige zeigten hohe Schwelle Zyklen (> 30) (Abbildung 6). Diese Daten zeigt auch, dass der Unterschied zwischen BrU gekennzeichnet IP'ed RNA und Gesamt-RNS in der Eingabe ca. 5 Ct und einige RNAs in geringen Mengen in der Zelle ausgedrückt könnte daher nicht richtig erkannt werden nach BrU-IP.
Abbildung 1: Beschreibung der BrU-IP für die Untersuchung der RNS-Synthese. (A) RNA durch RNA-Polymerasen in Zellen von DNA transkribiert wird. (B) zusätzlich zu den Medien, BrU ist von Zellen aufgenommen und integriert die neu transkribierten RNA. (C) zur Messung der RNA-Synthese-Preise: (1) neu synthetisierte RNA für 1 h mit BrU gekennzeichnet ist, (2) RNA wird aus den Zellen extrahiert, unmittelbar nach der Kennzeichnung, (3) BrU gekennzeichnet RNA ist Immunoprecipitated mit Anti-BrU-Antikörpern (4) BrU gekennzeichnet (und entsprechende Eingabe) wird RNA durch RT-qPCR oder Sequenzierung analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bewertung der Kennzeichnung Zeit. Beispiel für eine erste Bewertung der BrU-Kennzeichnung Zeit. AsPC-1-Zellen gewachsen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und 50 U/mL / 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin mit BrU behandelt wurden, um eine Endkonzentration von 2 mM 0, 1, 2 und 4,5 h vor RNA-Extraktion und Analyse von RT-qPCR. Daten wird als 2-Ctquantifiziert und präsentiert sich als Mittel der technischen Triplicates ± Standardabweichung, n = 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse zeigen ein- und BrU-IP-RNA aus DMSO und PLK-2i behandelten Zellen. (A) 1 h und 4 h 2 mM BrU Behandlung keine sichtbaren morphologischen Veränderungen in HEK293T Zellen induzieren. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Adapted Figur aus Referenz1. 3.500.000 HEK293T Zellen wurden pro 10 cm Schale entkernt und mit einem Plasmid mit dem Ausdruck α-Synuclein 24 h nach Aussaat transfiziert. 24 h Post Transfektion Zellen wurden mit BrU in Anwesenheit von DMSO oder PLK-2i, gefolgt von RNA-Extraktion und BrU-IP-1 h inkubiert. Analyse der RNA durch RT-qPCR erfolgte mit Sonde Sätzen gegen menschliche SNCA (α-Synuclein) und 18sRNA. BrU-IP und Input SNCA war relativ BrU-IP quantifiziert und Eingang 18sRNA, bzw. mit der 2-ΔΔCT -Methode. Ergebnisse wurden auf der DMSO-behandelten Proben normalisiert. Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mit Schülers ungepaarten t-Test, durchgeführt * p < 0,001, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Messung anderer Gene nicht verändert durch PLK-2i. PLK-2i ändert weder insgesamt noch synthetisierte RNA ACTB, HMBS und NADH. (A) ACTB, HMBS und NADH RNA vom Eingang waren in dreifacher Ausfertigung in einem Experiment gemessen und quantifiziert im Vergleich zu 18sRNA im Eingang mit der 2-ΔΔCT -Methode. Werte wurden auf die DMSO behandelt Proben normiert und Balken stehen für Mittelwert von Triplicates ± Standardabweichung, n = 1. (B) ACTB, HMBS und NADH waren auch in der BrU-IP'ed-RNA gemessen und quantifiziert im Vergleich zu 18sRNA in der BrU-IP. Werte wurden auf DMSO normalisiert und präsentiert wie in A, n = 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Spezifität der BrU-IP. Zum Vergleich der 18sRNA von BrU-IP von BrU - und nicht-BrU-behandelten Zellen gefangen genommen wurde RNA aus BrU-IP validiert relativ Input RNA, um Unterschiede im Ausgangsmaterial zu berücksichtigen und im folgenden BrU-behandelten Proben normalisiert. Nur ein sehr kleiner Bruchteil (0,002) von nicht-BrU-gekennzeichnete 18sRNA war Immunoprecipitated, zeigen, dass die BrU-IP hochspezifisch ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Ebenen der verschiedenen mRNAs in BrU-IP-RNA im Vergleich zum Eingang RNA. Mehrere potenzielle Referenz-Gene wurden getestet, weil einige RNAs in sehr geringen Konzentrationen in BrU-IP-RNA durch kleine Mengen erzeugten RNA innerhalb 1 h BrU Behandlung anwesend sein werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des BrU-IP für Bestimmung der RNA-Produktion durch Kennzeichnung von neu RNA für 1 h mit BrU produzierten, gefolgt von sofortige RNA-Extraktion und Immunopräzipitation BrU gekennzeichnet RNA. Diese Methode ist bisher in Referenz16beschrieben worden, und dieser Artikel enthält einige zusätzliche Schritte, um IP-Spezifität und RNA Reinheit, von Pre-Behandlung von Perlen mit niedrigen Konzentrationen von BrU sowie eine Phenol-Chloroform Reinigungsstufe zu erhöhen RNA-Reinheit nach IP zu erhöhen. Darüber hinaus präsentieren wir auch Daten, die hier zeigen die Spezifität des BrU-IP durch den Vergleich der RNS aus BrU und nicht-BrU erfasst behandelten Zellen. Phenol-Chloroform-Reinigung ist billig, aber in Anbetracht der niedrigen Mengen von RNA mit BrU gekennzeichnet, erhöhte Signale in der nachfolgenden Analyse könnte stattdessen mithilfe von RNA Aufräum Bausätze bezogen werden. Unsere Erfahrung ist jedoch, dass die meisten gleiche Gewinnung von RNA über Proben mit Phenol-Chloroform Reinigung erreicht wird.
BrU-Kennzeichnung und -IP sind im Gegensatz zur Analyse von insgesamt RNA-Level, in der Lage, die zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Steady-State RNA Levels zu erforschen. Die Methode hat keine oder begrenzte Auswirkungen auf Zellphysiologie, im Gegensatz zur Verwendung von transcriptional Hemmer so als α-Amanitin und Actinomycin d. Es wurde vermutet, dass Vergleich neu synthetisierte RNA, Steady-State-Ebenen verwendet werden, kann um RNA Verfall Preise17berechnen, und die hier beschriebene BrU-IP-Methode ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung von RNA-Synthese und Verfall in einer Probe.
In Abbildung 5haben wir bewiesen, dass RNA nur IP'ed von BrU behandelten Zellen ist, zeigt, dass es in der Tat BrU in die RNA in der Zelle Zeile verwendet hier aufgenommen. Jedoch empfehlen wir die Durchführung einer Erstprüfung BrU Einbindung in RNA in anderen Zelllinien vor der Durchführung der BrU-IP. Dies könnte, zum Beispiel mithilfe von Antikörpern Anti-BrU BrU gesamtextrakte RNA über Dot-Blot oder Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay quantifizieren.
Hier haben wir einen Test der BrU-IP-Effizienz nicht über Proben vorgestellt, aber dies mit BrU gekennzeichnet Spikes in RNA entweder produziert in-vitro- oder aus einem anderen Organismus, wie Drosophila Melanogasteruntersucht werden kann. Diese RNA konnte dann auch in den nachgeschalteten Quantifizierungen und Normierungen verwendet werden.
Richtige pipettieren Techniken sind entscheidend, wenn hochsensible quantitativen Assays, wie BrU-IP und RT-qPCR durchführen und eine besondere Anstrengungen unternommen werden sollten, gleich pipettieren über Proben durchführen. Die Phenol-Chloroform-Extraktion verlangen einige Erfahrung, sondern auf unbefriedigende pipettieren, Phasen der wässrigen und Phenol/Chloroform neu abgemischt und erneut zentrifugiert.
Dieses Protokoll schlägt BrU-Kennzeichnung für 1 h bei der Messung von RNA-Synthese. Diese Kennzeichnung ermöglicht einer groben Schätzung der Änderungen in der Transkription, da die Mehrheit der Menschen und Mäusen mRNAs voraussichtlich Halbwertszeit haben > 6 h18,19. Vorsicht sollte jedoch, ausgeübt werden, wenn die Interpretation der Daten erzielt, da viele RNAs Halbwertszeiten haben, < 1 h18,19, z. B. mehrere Abschriften induziert durch Lipid A, die rasch nach Stimulation erhöhen und sinken zurück in Grundlinie Niveaus innerhalb 2 h nach Induktion20. Um das Risiko von Einflüssen aus RNA-Abbau, der BrU-Kennzeichnung Zeit senken können verringert werden, es ist jedoch auch wichtig, beschriften Sie genug RNA zu unterscheiden RNA von der Hintergrund (der gewonnen wurde, nach 1 h Kennzeichnung in unsere Hände (BrU-IP erhalten dürfen ( Abbildung 2)). Eine weitere Möglichkeit ist die RNA-Synthese und Verfall des Gens mit BrU-Kennzeichnung und IP-Messen, die letztere Methode ist in2beschrieben. Die Daten aus dieser beiden Ansätze ergänzen einander, und wenn eine Änderung in der Synthese zwischen zwei Bedingungen gemessen, aber keine Änderung in Verfall Preise gesehen, kann davon ausgegangen werden, dass die gemessenen Veränderungen in der RNA durch die Regulierung der Synthese waren. Es ist jedoch zu beachten, dass beide Techniken nur RNA-Funktionalität Messen durch Schätzung RNA-Ebene und völlig vernachlässigen, andere Mechanismen beeinflussen RNA-Funktionen wie z. B. chemische Modifikationen14zu untersuchen.
Da die Zellen mit BrU für nur 1 h inkubiert werden, kann sehr langsam produzierten mRNAs schwer zu messen, der BrU-IP-Methode sein. Dies ist ein Punkt, wo die Verwendung der transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D möglicherweise über BrU-IP, bevorzugten, sie können jedoch nur verwendet werden, um Änderungen im Abbau und nicht direkt messen RNA-Produktion. Das niedrige Niveau der BrU gekennzeichnet RNA überwunden werden durch die Erhöhung der Inkubationszeit mit BrU, aber langen Inkubationszeiten erhöhen das Risiko von Einflüssen durch RNA-Abbau. In diesem Fall ist es nicht mehr möglich, zu wissen, ob Änderungen in der RNS BrU gekennzeichnet durch Veränderungen in der Produktion von RNA oder Zerfall verursacht werden.
In diesem Beispiel die nachgelagerte Analyse der erfassten BrU gekennzeichnet RNA erfolgt über RT-qPCR, nächste Generation Sequenzierung ist jedoch auch eine weit verbreitete nachgelagerten Methode zum Bildschirm für Änderungen in einem großen Pool von RNAs2,13. In ähnlicher Weise die Methode beschränkt sich nicht auf Analyse der mRNAs, sondern kann alle Arten von RNAs2analysieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Lundbeck-Stiftung, Universität Aarhus, Dandrite und Lundbeck a/s unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
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