Summary
Denna metod kan användas för att mäta RNA-syntes. 5-Bromouridine läggs till celler och införlivas syntetiserade RNA. RNA-syntes mäts av RNA-extraktion omedelbart efter märkning, följt av 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation märkta RNA och analys av omvänd Transkription och kvantitativa polymeras-kedjereaktion.
Abstract
När steady state RNA-nivåer jämförs mellan två villkor, är det inte möjligt att särskilja huruvida förändringar orsakas av förändringar i produktionen eller nedbrytning av RNA. Det här protokollet beskriver en metod för mätning av RNA produktion, med hjälp av 5-Bromouridine märkning av RNA följt av immunoprecipitation, som möjliggör undersökning av RNA syntetiseras inom en kort tidsram (t.ex., 1 h). Fördelen med 5-Bromouridine-märkning och immunoprecipitation över användningen av giftiga transkriptionell hämmare, såsom α-amanitin och actinomycin D, är att det finns ingen eller mycket låg effekt på cellernas viabilitet under kortvarig användning. Eftersom 5-Bromouridine-immunoprecipitation endast fångar RNA produceras inom den korta tid som märkning, långsamt produceras samt snabbt försämrad kan RNA dock svårt att mäta med denna metod. 5-Bromouridine-märkt RNA fångas av 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseras genom omvänd Transkription, kvantitativa polymeraskedjereaktion och nästa generations sekvensering. Alla typer av RNA kan utredas, och metoden är inte begränsad till att mäta mRNA som presenteras i detta exempel.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) tillåter studier av RNA produktion i celler med inga eller mycket begränsade effekter på cell fysiologi under den korta märkning perioden1,2. Metoden bygger på införlivandet av syntetiska uridin derivatan BrU i nyligen syntetiserade RNA följt av IP märkta RNA med hjälp av anti-BrU antikroppar (figur 1).
Det har varit känt för årtionden att proteinsyntesen transcriptionally kan regleras, och förekomsten av transkriptionsfaktorer antogs i mer än 50 år sedan3. Idag, det är känt att flera sjukdomar orsakas av dysreglering av transkription och RNA stabilitet (kompletterande figur S1 i referens4), och förmågan att mäta förändringar i RNA produktion är av stor betydelse för förståelse sjukdom utveckling.
Å andra ger verktyg att reglera RNA produktionen nya möjligheter för behandling av sjukdomar som orsakas av för lite eller för mycket proteinuttryck eller protein ackumulering som vid Parkinsons sjukdom (PD). Det dominerande proteinet ackumulera som olösliga aggregat i PD är α-synuclein, och nivån på α-synuclein är direkt kopplad till sjukdomen, eftersom genen multiplikation av α-synuclein genen orsakar familjär PD5. Dessutom aggregerar α-synuclein i en koncentration koncentrationsberoende sätt. Nedreglering av α-synuclein mRNA nivåer är därför en intressant terapeutisk strategi, som har infriats med RNA-interferens för att minska neuronala cellförlust i PD gnagare modeller6,7.
Det är viktigt att kunna mäta förändringar i RNA produktion orsakas av antingen sjukdom eller terapeutiska interventioner. Toppmodern metoder ändras för mäta steady state-nivåer av RNA, såsom omvänd Transkription följt av kvantitativa polymeras-kedjereaktion (RT-qPCR), inte kunna skilja mellan förändringar orsakade av Transkriptionsreglering eller RNA stabilitet. En allmänt använd metod för utredning av RNA decay priser blockering av transkriptionell maskinen använder föreningar såsom α-amanitin eller actinomycin D följt av mätningar av ruttnande RNASEN. Det finns dock vissa problem i samband med en total blockering av transkription i celler, såsom induktion av apoptos8,9. Bredvid de cytotoxiska effekterna presentera transkriptionell hämmare också flera tekniska frågor, såsom långsam cellernas upptag av α-amanitin och bristande specificitet av actinomycin D (ses i referens10).
För att undvika en total blockering av transkription, har nukleotid analoger använts, såsom 5-ethynyl uridin (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) och BrU. Dessa är lätt tas upp av däggdjursceller och införlivas med nyligen syntetiserade RNA, aktivera puls-märkning av RNA inom en viss tidsram. BrU är mindre giftig än 5-EU och 4-TU, gör det det föredragna analogt val11,12.
BrU-IP kan användas för att undersöka både graden av RNA-syntes och stabilitet, och därmed skilja mellan de underliggande orsakerna till förändringar i total-RNA. Denna artikel kommer att fokusera på mätning av RNA-syntes och avser referens2 för information om utredning av RNA stabilitet. För att undersöka RNA-syntes, är celler kort märkta med BrU t.ex. för 1 h följt av BrU-IP1 (figur 1 c). Detta möjliggör mätningar av RNA syntetiseras inom den korta tid som märkning och observerade förändringar kommer att ge en bättre uppskattning av förordningar i RNA-syntes än genom att mäta förändringar i total-RNA av RT-qPCR. Det bör dock nämnas att även om märkning tiden är, till exempel endast 1 h, nedbrytning kan fortfarande påverka de RNA-nivåer som observerats.
RNA från BrU-IP experiment lämpar sig för efterföljande analys av både RT-qPCR1 eller nästa generations sekvensering2,13. Andra standard RNA upptäckt metoder, såsom norra blotting eller ribonunkleas analys, kan också vara tillämpliga för vissa RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Utföra alla steg i rumstemperatur om inget annat anges och hålla buffertar på is eller i kylen (utom från elueringen buffert innehållande SDS). Protokollet är indelad i 5 avsnitt: förberedelse av RNA-prover. beredning av pärlor för IP; bindningen av BrU-märkt RNA till pärlor; eluering och rening av bundna BrU-märkt RNA genom 3 steg fenol-fenol/kloroform-kloroform extraktion; analys av RNA (i detta exempel använder RT-qPCR)
1. beredning av RNA-prover
- Greve HEK293T celler med en automatisk cell counter och utsäde 3 500 000 celler i en 10 cm petriskål i 10 mL tillväxtmassmedia (Dulbeccos modifierade örnens Medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum och 50 µg/mL penicillin/streptomycin) för att erhålla totalt > 40 µg RNA vid extraktion 48 h senare. Upprätthålla celler vid 37 ° C och 5% CO2.
- 48 h efter sådd, aspirera 8 mL tillväxt medier och lämna 2 mL bakom för att undvika uttorkning cellerna. Lägga till 2 mM BrU och någon behandling till 8 mL aspirerade tillväxt medier, och ta bort resterande 2 mL från cellerna innan du omtillämpa 8 mL BrU innehållande tillväxt medier. Undvika användning av färska media efter ansökan av BrU på cellerna, eftersom detta kan orsaka förändringar i genuttryck.
- Inkubera cellerna för 1 h med BrU och behandling. Tvätta cellerna i 5 mL Hanks buffert och trypsinize celler med 2 mL 0,05% trypsin. Lägg till 8 mL tillväxt medier för att stoppa reaktionen, överföra cellerna till en 15 mL tub och snurra ner cellerna för 2 min vid 1 000 x g.
- Avlägsna supernatanten och extrahera total-RNA från cellpelleten använder en RNA isolering kit (se Tabell för material) eller någon annan föredrog metod, och eluera i RNase-fri H2O. Store RNA vid-80 ° C tills de ska gå vidare.
2. förberedelse av pärlor för IP
- Förbereda pärlor i batchar för antalet prover undersökas plus en extra att redogöra för förlust under pipettering och virvla blandning. Återsuspendera antimus IgG magnetiska pärlor grundligt genom att virvel blanda och ta ut 20 µL pärlor per prov i ett RNase-fri 1,5 mL tub. Plats 1,5 mL röret i en magnetisk stå och lämna cirka 20 s för pärlorna att samla på sida.
- Ta bort supernatanten, ta ut röret från magnetiska stativet och återsuspendera i 400 µL 1 x BrU-IP buffert av pipettering. Snurra röret mycket kortfattat för 2 s i en bordsskiva centrifug, placera det tillbaka i magnetiska stativet och avlägsna supernatanten. Upprepa tvätt en gång.
- Blockera ospecifik bindning till pärlorna med heparin. Återsuspendera pärlorna i 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL heparin buffert, och lämna roterande för 30 min. Tvätta pärlorna en gång, som i steg 2.2.
Obs: Heparin är en negativt laddad polymer, som kommer att konkurrera med RNAs för bindning. tRNA eller andra irrelevanta RNAs kan också användas om programmet nedströms inte sekvensering. - Återsuspendera pärlorna i 1 mL 1 x BrU-IP buffert och tillsätt 1,25 µg/prov anti-α-Bromdeoxiuridin antikroppar, som också erkänner BrU. Inkubera pärlorna för 1 h medan roterande, eller över natten i rumstemperatur.
- Tvätta pärlorna tre gånger som i steg 2.2. Återsuspendera pärlorna i 50 µL/prov 1 x BrU-IP buffert kompletteras med 1 mM BrU och lämna roterande för 30 min att sänka känsligheten av antikropp bunden till pärlorna och härmed risken för ospecifik bindning under Undersökningsperioden.
- Tvätta pärlorna tre gånger som i steg 2.2 och återsuspendera i 50 µL/sample 1xBrU-IP-buffert.
3. bindande BrU-märkt RNA till pärlor
- Mäta RNA koncentrationer i RNA extrakt från steg 1.3 använder ultraviolett-synligt spektrofotometri och späd 40 µg RNA från varje prov i RNase-fri H2O till en total volym på 200 µL.
- Värm RNA prover för 2 min vid 80 ° C att denaturera RNA och spinn kort i en bordsskiva centrifug. Tillsätt 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse inhibitor.
- Tillsätt 50 µL resuspended och förberett pärlor från steg 2,6 till varje prov och lämna roterande 1 h. Tvätta pärlorna fyra gånger som i steg 2.2.
4. eluering och rening av RNA genom 3 steg fenol-fenol/kloroform-kloroform extraktion
-
Eluera RNA och utföra fenol utvinning
- Återsuspendera pärlorna i 200 µL eluering buffert eluera RNA, och snabbt därefter tillsätt 200 µL fenol, pH 6,6 (försiktighet: giftig, se not nedan steg 4.1.2) ta bort alla icke-RNA-molekyler från provet.
- Virvel mix provet och spin 3 min vid 25 000 x g i en bordsskiva centrifug.
Obs: Fenol är giftig och bör hanteras i dragskåp bär hudskydd. Något surt pH säkerställer att endast RNA, och inte DNA, extraheras. RNA förblir i övre vattenfasen hydrofil pågrund av avgifter. Hydrofoba kärnar ur av proteiner kommer binda fenol och flytta till den lägsta organiska fenol-fasen.
-
Utföra fenol-kloroform utvinning
- Sug upp så mycket övre-fas som möjligt (cirka 190 µL av de 200 µL, beroende på erfarenhet i hantering) och flytta den till ett rör med 200 µL fenol/kloroform, pH 6,6 (försiktighet: giftig, se not). Se till att aspirera samma belopp över prover.
- Virvel blanda provet och spin för 3 min vid 25 000 x g.
Obs: Kloroform är giftig och bör hanteras i dragskåp bär hudskydd. Kloroform läggs till ta bort fenol, vilket kan påverka efterföljande analys av RNA genom att hämma omvänd Transkription14 och polymeras kedjereaktioner15.
- Utföra kloroform extraktion genom att aspirera övre vattenfasen som innan (nu ungefärligt 180 µL), och överför till en tub som innehåller 200 µL kloroform. Virvel blanda provet och snurra 3 min vid 25 000 x g.
- Aspirera övre vattenfasen som innan (nu ungefär 170 µL) och överföra den till ett rör som innehåller 17 µL (1/10 volym) 3 M CH3COONa, pH 6,0. För att neutralisera och fällningen RNA från en vattenlösning, tillsätt 2 µL glykogen (20 mg/mL), som påskyndar tillsammans med RNA och gör RNA pelleten mer synliga.
- Tillsätt 500 µL 96% etanol för att öka bindningen mellan salt joner och RNA och blanda genom att vända rör ett par gånger. Låt röret över natten vid-20 ° C eller 15 min på torris.
- Snurra provet vid 25 000 x g, 4 ° C i 30 min. Kassera supernatanten utan att störa pelleten och tvätta pelleten i 185 µL 75% etanol att ta bort eventuell kvarvarande salt. Snurra på 25 000 x g, 4 ° C i 5 min.
- Kassera supernatanten helt utan att störa pelleten och lämna pelleten för att torka 5-10 min med öppet lock. Återsuspendera i 10 µL RNase-fri H2O tillämpas på sidan av tuben för att undvika att störa pelleten.
5. analys av RNA
- Förbereda cDNA använder en cDNA omvänd Transkription kit (se Tabell för material) eller något annat program metod med 2 µL RNA-prov och 1 µg jäst total-RNA som bärare RNA för cDNA syntes reaktionen (används inte om cDNA används för nästa generations sekvensering). Använda 1 µg RNA utan jäst RNA för cDNA förberedelse av motsvarande ingång.
- Utspädd cDNA 1:25 och mix 9 µL utspädd cDNA med 10 µL qPCR Master mix och 1 µL fluorogenic sond, båda de angivna i Tabell för material.
Obs: CDNA utspädning beror på cDNA förberedelse och qPCR-metod som används. - Kör följande qPCR-program (t.ex. på en 7500 snabbt Real-time PCR system eller motsvarande): 2 min vid 50 ° C, 20 s vid 95 ° C, 40 cykler av 3 s vid 95 ° C och 30 s vid 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra första tester BrU-märkning tid utfördes i AsPC-1 celler. Cellerna behandlades med BrU för 0, 1, 2 och 4,5 h, följt av total RNA-extraktion och BrU-IP. GAS5 och GAPDH mättes i BrU-IP RNA, som visade att 1 h märkning var tillräckligt för att nå ett ungefärligt 9 och 44 gånger förändring jämfört med bakgrunden (0 h) för GAPDH och GAS5, respektive.
BrU-IP och den analys som beskrivs ovan användes för att undersöka om förändringar upptäcktes i steady state-nivåer av α-synuclein mRNA vid Polo-liknande Kinas 2 (PLK-2) hämning orsakas av förändringar i mRNA syntes1. En 1 h märkning tid valdes eftersom detta ger tillräcklig märkning jämfört med bakgrunden (figur 2) och också behandlingstiden få effekt. 2 mM BrU behandling inducerade inte någon morphologic ändringar i HEK293T celler för 1 h eller längre 4 h behandling (figur 3A).
Α-Synuclein transfekterade HEK293T celler behandlades för 1 h med DMSO eller en specifik PLK-2-hämmare (PLK-2i) i närvaro av BrU att märka nymalen syntetiserade RNA. Cellerna nedan har skördats och total-RNA extraherades. BrU-märkt RNA produceras inom 1 h behandling samlades in med BrU-IP (”BrU-IP” i figur 3B) från den totala poolen av RNA (”Input” i figur 3B). Mängden RNA erhålls med BrU-IP från 40 µg utgångsmaterial varierar mellan olika cellinjer, och vi får generellt cirka 500 ng från HEK293T celler, men endast 10-50 ng från HeLa cells. PLK-2 hämning orsakade en ökning i α-synuclein mRNA i både indata och BrU-IP (figur 3B) tyder på att ökningen i steady state RNA orsakas av en ökning av syntesen av RNA. Att säkerställa att PLK-2i orsakar inte bara en total ökning i RNA produktion, 3 ytterligare endogena gener (ACTB, HMBS och NADH) var mätt (figur 4). Ingen av dessa gener ökades i Input (figur 4A) och BrU-IP (figur 4B) vid PLK-2i behandling.
För att validera specificitet BrU-IP, ingick en kontroll med icke-BrU behandlade celler. Nivåerna av 18sRNA fångas av BrU-IP från BrU-behandlade och obehandlade celler jämfördes (figur 5). Detta visar tydligt att de BrU-IP är mycket specifika och bara fångar en mycket liten bråkdel av omärkt RNA (figur 5).
Eftersom den BrU-märkt RNA produceras endast inom 1 h, är det viktigt att välja en korrekt Referensgenen, eftersom vissa normalt lämplig gener kan uttryckas i alltför låga koncentrationer vara tillförlitliga. 18sRNA valdes som en referens gen för de data som presenteras i figur 3B och figur 4 på grund av dess höga överflöd. Flera gener som referens, men testades, och några visade hög tröskel cykler (> 30) (figur 6). Dessa data visar också att skillnaden mellan BrU-märkt IP'ed RNA och total-RNA i indata är ca 5 CTS och vissa RNAs uttryckt på låga belopp i cellen kan därför inte korrekt identifieras efter BrU-IP.
Figur 1: Beskrivning av BrU-IP för utredning av RNA-syntes. (A) RNA transkriberas i celler från DNA av RNA polymeraser. (B) vid tillägg till media, BrU är tas upp av celler och införlivas nyligen transkriberade RNA. (C) för att mäta RNA syntes priser: (1) nyligen syntetiserade RNA är märkt för 1 h med BrU, (2) RNA utvinns ur cellerna omedelbart efter märkning, (3) BrU-märkt RNA är immunoprecipitated med anti-BrU antikroppar, (4) BrU-märkt (och motsvarande ingång) analyseras RNA av RT-qPCR eller sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bedömning av märkning tid. Exempel på en första bedömning av BrU-märkning tid. AsPC-1 celler odlade i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 50 U/mL / 50 µg/mL penicillin/streptomycin behandlades med BrU med en slutlig koncentration på 2 mM för 0, 1, 2 och 4,5 h innan RNA-extraktion och analys av RT-qPCR. Data är kvantifierad som 2-Ctoch presenteras som medelvärdet av tekniska exemplar ± standardavvikelsen, n = 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat visar indata och BrU-IP RNA från DMSO och PLK-2i behandlade celler. (A) 1 h och 4 h 2 mM BrU behandling inducerade inte några synliga morphologic ändringar i HEK293T celler. Skalstapeln = 100 µm. (B) anpassas diagram från referens1. 3 500 000 HEK293T celler var seedade per 10-cm skålen och transfekterade med en plasmid uttrycker α-synuclein 24 h efter sådd. 24 h post transfection celler inkuberades för 1 h med BrU i närvaro av DMSO eller PLK-2i, följt av RNA-extraktion och BrU-IP. Analys av RNA gjordes av RT-qPCR med probe set mot mänskliga SNCA (α-synuclein) och 18sRNA. BrU-IP och Input SNCA kvantifierades i förhållande till BrU-IP och ingång 18sRNA, respektive, med 2-ΔΔCT -metoden. Resultaten var normaliserade till DMSO-behandlade proverna. Data presenteras som medelvärdet ± standardavvikelser. Statistiska jämförelser utfördes med Students oparat t-test, * p < 0,001, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mätning av andra gener som inte ändras av PLK-2i. PLK-2i ändras varken totala heller syntetiserade RNA av ACTB, HMBS och NADH. (A) ACTB, HMBS och NADH RNA från input mättes i tre exemplar i ett experiment och kvantifieras i förhållande till 18sRNA ingång med 2-ΔΔCT -metoden. Värden var normaliserade till DMSO behandlade proverna och staplarna representerar medelvärdet av exemplar ± standardavvikelsen, n = 1. (B) ACTB, HMBS och NADH också mättes i BrU-IP'ed RNA och kvantifieras i förhållande till 18sRNA för BrU-IP. Värden var normaliserade till DMSO och presenteras som i A, n = 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: specificitet BrU-IP. För jämförelse av 18sRNA fångas av BrU-IP från BrU - och ej BrU-behandlade celler, var RNA från BrU-IP valideras i förhållande till Input RNA att ta hänsyn till skillnader i utgångsmaterial och härefter normaliserade till BrU-behandlade prover. Endast en mycket liten bråkdel (0,002) av icke-BrU-märkt 18sRNA var immunoprecipitated, vilket visar att de BrU-IP är mycket specifika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: nivåer av olika mRNA i BrU-IP RNA jämfört med Input RNA. Flera potentiella referens gener testades eftersom vissa RNAs kommer att vara närvarande i mycket låga koncentrationer i BrU-IP RNA på grund av små mängder producerade RNA inom 1 h BrU behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver användningen av BrU-IP för bestämning av RNA produktion av märkning av nyligen producerade RNA för 1 h med BrU, följt av omedelbar RNA-extraktion och immunoprecipitation BrU-märkt RNA. Denna metod har tidigare beskrivits i referens16, och den här artikeln innehåller några ytterligare steg för att öka IP-specificitet och RNA renhet, genom pre behandlande pärlor med låga koncentrationer av BrU samt en fenol-kloroform reningssteg till öka RNA renhet efter IP. Dessutom presenterar vi också data som här visar specificiteten av BrU-IP genom att jämföra RNA erövrat från BrU och icke-BrU behandlade celler. Fenol-kloroform rening är billigt, men med tanke på de låga mängder RNA märkt med BrU, ökad signaler i den efterföljande analysen kan erhållas genom att använda RNA clean-up kit istället. Vår erfarenhet är dock att mest jämställda utvinning av RNA över prover erhålls med fenol-kloroform rening.
BrU-märkning och -IP är, i motsats till analys av total RNA-nivåer, kan utreda de bakomliggande orsakerna till förändringar i steady state RNA-nivåer. Metoden har ingen eller begränsad effekter på cellfysiologi, i motsats till användningen av transkriptionell hämmare sådan som α-amanitin och actinomycin D. Det har föreslagits att jämförelse av nyligen syntetiserade RNA till steady state-nivåer kan användas för att beräkna RNA decay priser17och den BrU-IP-metod som beskrivs här möjliggör samtidig bestämning av både RNA-syntes och förfall i en analys.
I figur 5visade vi att RNA är endast IP'ed från BrU behandlade celler, visar att det verkligen är BrU införlivas RNA i den cellinje som används här. Vi föreslår dock genomföra ett inledande test av BrU införlivande i RNA i andra cellinjer innan du utför den BrU-IP. Detta kan exempelvis göras genom att använda anti-BrU antikroppar kvantifiera BrU i total RNA extrakt via dot blot eller enzymkopplad immunadsorberande analys.
Här har vi inte presenterat ett test av BrU-IP effektivitet över prover, men detta kan undersökas med hjälp av BrU-märkt spikar i RNA som antingen produceras i vitro eller från en annan organism, såsom Drosophila melanogaster. Detta RNA skulle då också kunna användas i nedströms kvantifieringar och normalizations.
Korrekt teknik för pipettering är avgörande när du utför mycket känsliga kvantitativa analyser, såsom BrU-IP och RT-qPCR, och särskilda ansträngningar bör göras för att utföra lika pipettering över prover. De fenol-kloroform extraktioner kräver viss erfarenhet, men vid otillfredsställande pipettering, vattenfasen och fenol/kloroform faserna kan vara åter blandas och centrifugeras igen.
Detta protokoll föreslår BrU-märkning för 1 h när mätning RNA-syntes. Denna märkning tid ger en grov uppskattning av förändringar i transkription, sedan majoriteten av mänskliga och möss mRNA har uppskattats ha halveringstid > 6 h18,19. Försiktighet bör dock, iakttas vid tolkning av data erhållits, eftersom många RNAs har halveringstider < 1 h18,19, såsom flera avskrifter som induceras av Lipid A, som snabbt ökar vid stimulering och sjunka tillbaka till base-line nivåer inom 2 h efter induktion20. För att minska risken för påverkan från RNA nedbrytning, BrU-märkning tiden kan minskas, men det är också viktigt att märka tillräckligt RNA för att kunna skilja RNA erhålls genom BrU-IP från bakgrunden (som erhölls efter 1 h märkning i våra händer ( (Se figur 2)). Ett annat alternativ är att mäta både RNA-syntes och förfall av genen av intresse använda BrU-märkning och IP är den senare metoden beskrivs i2. Data från dessa två metoder kompletterar varandra, och om en förändring i syntes mellan två villkor mäts men ingen förändring ses i förfall priser, det kan konstateras att de uppmätta förändringarna i RNA berodde på regleringen av syntes. Det är dock viktigt att komma ihåg att båda teknikerna bara mäta RNA funktionalitet genom att uppskatta RNA-nivåer och helt försumma att undersöka andra mekanismer som påverkar RNA funktioner såsom kemiska modifieringar14.
Eftersom cellerna inkuberas med BrU för endast 1 h, kan mycket långsamt producerad mRNA vara svårt att mäta med metoden BrU-IP. Detta är en punkt där användningen av transkriptionell-hämmare såsom α-amanitin och actinomycin D kanske att föredra framför BrU-IP, de kan dock endast användas att mäta förändringar i nedbrytning och inte direkt mäta RNA produktion. De låga nivåerna av BrU-märkt RNA kan också lösas genom att öka inkubationstiden med BrU, dock långa inkubationstider öka risken för påverkan av RNA nedbrytning. I så fall är det inte längre möjligt att veta huruvida förändringar i BrU-märkt RNA orsakas av förändringar i RNA produktion eller förfall.
I det här exemplet nedströms analysen av fångade BrU-märkt RNA utförs med RT-qPCR, men nästa generations sekvensering är också en allmänt använd nedströms metod till skärmen för förändringar i en stor pool av RNAs2,13. Likaså, metoden är inte begränsad till analys av mRNA, men kan analysera alla typer av RNAs2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Stiftelsen Lundbeck, Århus universitet, Dandrite och Lundbeck A/S stöds detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
