Summary
ويستهدف هذا البروتوكول خلايا معينة في الأنسجة للتصوير بدقة النانو باستخدام المسح الإلكتروني المجهري (SEM). أولاً يتم تصويرها أعدادا كبيرة من مقاطع المسلسل من المواد البيولوجية جزءا لا يتجزأ من الراتنج في مجهر خفيفة لتحديد الهدف ومن ثم بطريقة هرمية في sem.
Abstract
يمكن استهداف الخلايا المحددة في القرار ultrastructural داخل خلايا مختلطة سكان أو أنسجة بتصوير التسلسل الهرمي باستخدام مزيج من الضوء والمجهر الإلكتروني. مقطوع في صفائف تتألف من شرائط المئات من المقاطع سامسونج عينات جزءا لا يتجزأ من راتنج وأودعت في قطعة من رقاقة السيليكون أو كوفيرسليبس كوندوكتيفيلي المغلفة. صفائف يتم تصويرها بدقة منخفضة باستخدام مستهلك رقمية مثل كاميرا الهاتف الذكي أو مجهر الضوء (LM) لمحة سريعة مساحة كبيرة، أو مجهر الأسفار ميدانية واسعة (الفلورية الخفيفة الميكروسكوب (FLM)) بعد وضع العلامات مع فلوروفوريس. بعد بعد تلطيخ مع المعادن الثقيلة، صفائف يتم تصويرها في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). من الممكن اختيار الأهداف من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة FLM أو من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد مصنوعة من الكدسات SEM الصورة بدقة متوسطة في حالة توفر لا علامات مضيئة. لتحليل ultrastructural، تسجل الأهداف المحددة وأخيراً في وزارة شؤون المرأة في الاستبانة (بضعة نانومتر الصورة بكسل). ويتجلى أداة التعامل مع الشريط الذي يمكن تحديثه وتعديله لأي أولتراميكروتومي. وهو يساعد مع مجموعة الإنتاج وإزالة الركيزة من القارب سكين تقطيع. وتناقش منصة برمجيات يتيح التصوير الآلي للمصفوفات في وزارة شؤون المرأة. مقارنة بالأساليب الأخرى توليد البيانات كبيرة الحجم م، مثل الوجه كتلة المسلسل SEM (SBF-وزارة شؤون المرأة) أو تركيز أيون شعاع (التعزيز-وزارة شؤون المرأة)، ووزارة شؤون المرأة وهذا النهج قد اثنين من المزايا الرئيسية: (1) المحافظة عليها العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، لو في إصدار شرائح إلى أعلى. يمكن أن تكون ملطخة بطرق مختلفة وتصويرها مع قرارات مختلفة. (2) كما يمكن أن تكون المقاطع الملون بعد، فإنه ليس من الضروري استخدام عينات الملطخة بشدة من كتلة مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض لتصوير SEM أو تقديم كتل الأنسجة الموصلة. وهذا يجعل الطريقة التي تنطبق على مجموعة واسعة من المواد والمسائل البيولوجية. مسبوقة وبخاصة المواد مثلاً، من المصارف خزعة ومختبرات علم الأمراض، يمكن مباشرة المضمنة وإعادة بنائها في 3D.
Introduction
لإعادة بناء كميات كبيرة من الأنسجة بدقة ultrastructural عدد من النهج التصوير مختلفة استناداً إلى وزارة شؤون المرأة قد تم المستخدمة1: استعراضات شاملة متوفرة على سبيل المثال., SBF-وزارة شؤون المرأة2والتعزيز-وزارة شؤون المرأة3الصفيف التصوير المقطعي (في)4. بينما للأسلوب الأخير هو الحفاظ على المواد عينة كمجموعة مقاطع المسلسل على الركازة، SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز هي الأساليب المدمرة، تعمل على كتلة العينة واستهلاكها أثناء التصوير. بسبب فرض الراتنج في وزارة شؤون المرأة، أنها تعتمد أيضا على كتل عينة ميتاليزيد بقوة5.
من ناحية أخرى، تحديد بعض الخلايا أو الهياكل ذات الاهتمام داخل عينة أنسجة يمكن أن تستفيد خصوصا من الضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)6،،من78. استخدام FLM لاستهداف يحول دون تطبيق كميات كبيرة من المعادن الثقيلة منذ هذا شأنه إخماد إشارة fluorescence9. لهذه العينات metalized قليلاً فقط، هو في طريقة الاختيار منذ صفائف يمكن بسهولة بعد الملون مع المعادن الثقيلة بعد تصوير LM. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تقريبا أي نوع من أنواع العينة لفي, عينات روتينية حتى من الطبيب كنز الصدر10.
هي ميزة كبيرة أخرى في إمكانية هرمية11 أو التصوير المتعدد القرار12: ليس من الضروري صورة كل شيء في الاستبانة، كما يمكن تحديد الأهداف بطريقة مختلفة (مثلاً، FLM) أو في الصور المنخفضة الوضوح ووزارة شؤون المرأة. تصوير المناطق المثيرة للاهتمام فقط من السكان الأنسجة أو الخلايا في الاستبانة يوفر مساحة تخزين البيانات الرقمية وتنتج مجموعات بيانات الصورة أصغر، وأسهل للتعامل. هنا، هو أثبت سير العمل في استخدام عينة بل metalized ضعيفة: الضغط العالي تجميد جذور النبات (نبات التمويل) جزءا لا يتجزأ من الراتنج ماء.
يتم شرح كيف أعد لمصفوفات والملون وتصويرها في FLM ووزارة شؤون المرأة، وكيف تسجل رصات الصور. أيضا، يتضح كيف يمكن استخدام إعادة حجم FLM 3D لتحديد خلايا معينة للتصوير في وزارة شؤون المرأة بدقة النانو.
Protocol
ملاحظة: كتل عينة ينبغي بلمرة وتحتوي على بعض المعادن الثقيلة. في أماكن أخرى وصف التثبيت وتضمين البروتوكولات لكانت كلتا العينتين هو مبين في الشكل 1 ألف-ب 11. باختصار، العينة هو مبين في الشكل 1 ألف كيميائيا ثابتة، الملون كتلة الأولى مع 1% أوسو4، ثم مع خلات اليورانيل 1%، وجزءاً لا يتجزأ من الراتنج سبور. العينة هو موضح في الشكل 1B جمد الضغط العالي، تجميد المستبدلة مع خلات اليورانيل 0.4 في المائة في الأسيتون، وجزءاً لا يتجزأ من الراتنج HM20 لوويكريل. استخدام مسحوق قفازات مجاناً لإعداد الخطوات التالية.
1-إنشاء صفائف
- تقليم كتلة العينة
ملاحظة: دائماً تشديد الخناق جيدا عند إدراج أجزاء.- إدراج كتلة العينة إلى حامل أولتراميكروتومي عينة ومكان الحامل إلى كتلة التشذيب والانزلاق إلى مرحلة أدنى من أولتراميكروتومي.
- تقليم راتنج بعيداً حول الأنسجة المضمنة مع شفرة حلاقة ترك حافة صغيرة فقط من الراتنج حول العينة. تقليم من الأعلى حتى يتم التوصل إلى هذا الهدف.
ملاحظة: قد تكون على شكل الكتلة-الوجه شبه منحرف أو مستطيل (ونحن قد استخدمت بنجاح كلا الشكلين). من المهم استخدام الجانبين أطول من المستطيل كرائدة والحافة لضمان أن منطقة كبيرة تغطيها الخليط الغراء استقرار الأشرطة. - إدراج صاحب العينة في ذراع أولتراميكروتومي والاستعاضة عن كتلة التشذيب في المرحلة الدنيا بحامل سكين. إدراج سكين تقليم الماس (عادة 45°)، حامل سكين. قم بمحاذاة موازية تماما على حافة سكين تقليم الكتلة-الوجه.
ملاحظة: لإنتاج الضبط الرائدة موازية (أسفل) وزائدة الحواف (العلوي)، تحويل أو نقل فقط السكين لتقليم متقابلين. لكميات كبيرة (أكثر من عدة أقسام مئات)، سكين القطع 90° مفيد. - كافة الجوانب الأربعة على نحو سلس، ثم تناوب صاحب العينة حيث تكون الرائدة والحافة الآن في الموضع الأفقي.
- معطف بعناية على الجانبين الرائدة وزائدة من الكتلة مع خليط لاصق. استخدام فرشاة صغيرة تكونت من الشعر قليلة ثابتة ل مسواك13. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لأن يتبخر المذيب هذا الخليط في غضون ثوان. لا تلوث الكتلة-الوجه بهذا الخليط. واسمحوا كتلة العينة المغلفة الجاف لمدة 5-10 دقيقة.
ملاحظة: للحصول على عدد أكبر من المقاطع (> 200)، قد يكون من الأفضل لمعطف الحافة الأمامية فقط، لأنه مع مرور الوقت، انتفاخ غراء قد بناء على حافة trailing، ويحتمل أن تكون سحب المقاطع على حد السكين.
- إعداد الركيزة
- قص قطعة من رقائق السليكون إلى حجم التي تناسبها في القارب سكين (حوالي 2 × 2.5 سم2 للسكين جمبو). إذا لزم الأمر، علامة القطع ويفر (أرقام أو أحرف) مع خطاط الماس قبل التنظيف، أو مع علامة دائمة بعد التنظيف. تنظيف رقاقة السيليكون يدوياً مع الايزوبروبانول وأنسجة خالية من الوبر.
ملاحظة: لتصوير الارتباطية استخدم إنديوم-تين-أكسيد (إيتو)-مغلفة بالزجاج كوفيرسليبس. أنها يجب أن تعالج بعناية فائقة، وتنظيف إضافية غير ضرورية. - إصلاح الركيزة إلى نهاية واحدة لصفيحة الناقل باستخدام مادة لاصقة قابلة للإزالة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، حواف الركيزة قد يكون تمركزها موازية لحد السكين باستخدام شرائط اثنين من شريط لاصق. - تنشيط البلازما (توهج التفريغ) الركيزة مع الهواء للحصول على سطح ماء. ينبغي أن يتم هذا في مثل هذه طريقة أن توضع قطره الماء على حيزات الركيزة إلى طبقة رقيقة جداً (زاوية الاتصال منخفضة، الرقم 2، د). معلمات هيدروفيليزيشن تعتمد على جهاز البلازما المستخدمة؛ للمعلمات المستخدمة هنا، انظر الجدول للمواد.
ملاحظة: تفعيل البلازما متقلبة للغاية، وحتى تنفيذ ذلك فورا قبل استخدام الركيزة. - إدراج الناقل في المشبك من حامل الركيزة، مع الركيزة المحملة أقرب إلى حد السكين لتحقيق ترطيب الأمثل للركيزة في القارب سكين.
ملاحظة: يرد وصف مفصل لصاحب الركازة، بما في ذلك رسومات التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD)، في يكر وآخرون. 11
- قص قطعة من رقائق السليكون إلى حجم التي تناسبها في القارب سكين (حوالي 2 × 2.5 سم2 للسكين جمبو). إذا لزم الأمر، علامة القطع ويفر (أرقام أو أحرف) مع خطاط الماس قبل التنظيف، أو مع علامة دائمة بعد التنظيف. تنظيف رقاقة السيليكون يدوياً مع الايزوبروبانول وأنسجة خالية من الوبر.
- إعداد تقطيع
- إدراج سكين الماس جمبو حامل سكين وضبط زاوية التخليص (0° لسكين جمبو)، وملء القارب السكين بماء مقطر. النهج السكين لمسافة 1-2 ملم للعينة.
- انخفاض الركيزة في الماء باستخدام مسامير 1 – 3 (الشكل 2A) حامل الركيزة. تحقق من أن المائي يقع في الثلث العلوي من الركازة.
ملاحظة: تحقق من أن الغراء بين لوحة الركيزة والناقل كذلك علاجه بإيعاز الركازة مع ملقط نظيف. غير أنه ينبغي نقل. - لأنه من الصعب أن نرى تطهير الأرض عند استخدام رقاقة سيليكون، انخفاض الركيزة حتى تشعر بأنها تعمل باللمس الكلمة. الآن رفع الركيزة كمية صغيرة. تأكد من أن الركيزة والناقل لا يلامس القارب سكين بينما قطع.
- استخدام المحاقن أو ماصة لضبط مستوى المياه في القارب. بينما يراقب من خلال مجهر، إضافة أو إزالة المياه حتى منطقة كاملة من سطح الماء يظهر انعكاس متجانس للإضاءة الخفيفة أعلى من أولتراميكروتومي.
- التبديل على ضوء أولتراميكروتومي أسفل. ضمان أن الذراع في الموقف الوسط وليس في تراجع استخدام عجلة اليد أولتراميكروتومي. نهج عينة حتى انعكاس حد السكين مرئياً على الوجه كتلة السكين.
- استخدم خيارات التكيف أولتراميكروتومي لمحاذاة العينة بالسكين. أولاً تدوير السكين، ثم تدوير وآماله العينة.
ملاحظة: أنه تتم محاذاة بشكل صحيح إذا كان الشريط الخفيفة، التي يمكن رؤيتها في الفجوة بين العينة والسكين، تظهر حواف متوازية (خطوط متوازية مستقيم ولا آسفين على شكل). - تحقق من الميل للعينة: التأكد من أن الشريط الخفيفة لم تصبح أكثر سمكا أو أرق أثناء تحريك العينة صعودا وهبوطاً. إذا لزم الأمر، استخدم المسمار التكيف قوس لتصحيح هذه المشكلة. حرك السكين أقرب إلى العينة إلى أنه هو فقط فوق الكتلة-الوجه (ولكن ليس على اتصال به).
- تعيين سمك الفرع (آر)، خفض السرعة، وقطع نافذة في وحدة التحكم.
- بدء تمزيقها. إذا لزم الأمر، انتظر حتى يتم قطع المقطع الكامل الأول. قص بعض المقاطع من المؤكد أنها عصا معا على شكل أشرطة (خلاف ذلك الغراء قد يكون تطبيقها مرة أخرى). بدء تشغيل مع قيمة الأعلاف عالية (200 كحد أقصى، شمال البحر الأبيض المتوسط للسكين الترا) حتى يتم قطع المقطع الكامل الأول. ثم تعيين قيمة العلف المطلوب. الشريط كافية الاستقرار، سمك الفرع 100 نانومتر وسرعة قطع من 1 مم/s نقطة انطلاق جيدة. سمك مقطع يمكن تحقيقه أدنى هو حوالي 60 نانومتر، اعتماداً على نوعية العينة.
- وقف تمزيقها. إزالة كافة المقاطع (قطع جزئي) غير الضرورية من حد السكين وقارب استخدام الشعر جفن/القط. إذا كان هناك الكثير من الحطام الصغير تطوف، إزالة الماء تماما مع ماصة وتعبئة السفينة بالمياه العذبة. العملية الآن جاهزة للشريط الإنتاجية الأولى.
- تقطيع
- بدء تمزيقها. بمجرد قد تم خفض عدد من الأقسام (العدد الفعلي يعتمد على حجم الأقسام والركيزة)، وقف عملية تقطيع والإفراج عن الشريط من حد السكين برفق الجرة على حد السكين جفن14 أو الأفضل من ذلك، مع جداً لينة الشعر من الفراء القط.
- التعامل مع (دفع/سحب) الشريط مع جفن نحو الركازة وإرفاق المقطع الأول إلى الركيزة.
ملاحظة: من الضروري دفع الشريط بلطف حتى أنه عصي إلى الجزء الجاف من الركازة. - يواصل تمزيقها وإرفاقها الشرائط على الركازة. بدء تشغيل على جانب واحد والتحرك تدريجيا أكثر إلى آخر مع كل الشريط الجديد.
ملاحظة: تجنب تحركات ضخمة من المياه لتجنب تفكك شرائط الفعل المرفقة. نفس الشيء صحيح بالنسبة للتيارات الهوائية. استخدام الدرع التنفس سلمت أولتراميكروتومي. وفي الظروف البيئية غير المواتية، يوصي ضميمة أولتراميكروتومي15. - عندما تغطي الركازة تماما مع شرائط 4 – 5 شرائط (عادة ما تكون ممكنة)، بلطف رفع من الركازة من القارب سكين استخدام مسامير ميكرومانيبولاتور حامل الركيزة.
ملاحظة: الحركات المناسبة: رفع عمودياً (المسمار 1) وتناوب/إمالة بها (المسمار 3)، أو مزيج من كليهما. - واسمحوا الصفيف الشريط الجاف قبل تخزينها في بيئة خالية من الغبار. بعد التجفيف، إزالة الركيزة المحملة لاصقة بأسرع من الناقل (في نفس اليوم، خلاف ذلك الركيزة قد يكون من الصعب جداً لإزالة أو حتى قد كسر خلال ديمونتينج).
2-تلطيخ لتصوير LM
ملاحظة: أساليب مختلفة تلطيخ العلامات الممكنة، بما في ذلك البروتوكولات الفلورة. هنا يتم اختيار وصمة مباشرة، بل غير محدد إلى مخطط جدران الخلية.
-
يوديد Propidium تلطيخ
- تغطية الجزء السفلي من الزجاج كبير طبق بتري (قطرها 30 سم) مع بارافيلم وخط حافة الطبق مع النسيج الرطب لبناء غرفة رطبة.
- استخدم حوالي 300-500 ميليلتر لحل كل ساترة. ضع قطره واحدة لكل ساترة على بارافيلم ووضع الزجاج رأسا على الانخفاض، حيث أن الأقسام على اتصال مع السائل المصبوغة. يغطي الطبق والانتهاء من ذلك مع رقائق الألومنيوم لحماية العينات من الضوء. احتضان هذه العينات ح 16 عند 4 درجة مئوية.
- إزالة ساترة مع الملقط وغسله بتحريكه صعودا وهبوطاً في كوب 100 مل مليئة 80 مل ماء المقطر. كرر هذه الخطوة في الكأس آخر مع المياه العذبة. جاف ساترة بعناية مع الهواء المضغوط.
3-تسجيل المكدس الصورة في FLM
- مكان ساترة في مرحلة FLM واسع المجال المشترك.
- اختر مجموعة عامل التصفية المناسب (جدول المواد) للأسفار التي يتعين مراعاتها.
- مع عدسة هدف مناسب، والتقاط صورة للكائن في كل مقطع: محاولة لملء حقل الرؤية والحفاظ على الاتجاه ثابت. واستخدمت لتلميح الجذر، هدفا جوية X 40.
ملاحظة: إذا كان الشرائط ليست مباشرة تماما، يمكن أن تساعد مرحلة الدورية توجيه المقاطع مع أخذ الصور. إذا كان ذلك ممكناً، توسيط الصورة على ميزة معينة أو الحفاظ على ميزة مثل حافة القسم على مسافة متساوية إلى حافة الصورة المسجلة. - إذا كان ذلك ممكناً، استخدام 16 بت إلى الحد من التشبع بكسل والحفاظ على الوقت التعرض المستمر.
4-تسجيل المكدس الصورة FLM
- استيراد سلسلة الصورة إلى فيجي16 مكدس ظاهري.
- فتح من جديد تراكيم17 (فارغة) من القائمة ملف.
- انقر على الحق في حقل الصورة، واستيراد المكدس إلى تراكيم ك "شريحة واحدة كل طبقة".
- محاذاة الطبقات (انقر على الحق في حقل الصورة)، قم بتعيين النطاق (أول صورة إلى آخر)، واختر لا شيء كالمرجع. لكافة الإعدادات، استخدام القيم الافتراضية، واختر جامدة كالتحول المنشود.
- عندما يتم التسجيل النهائي ومرضية، احفظ dataset المنحازة التي انقر بالزر الأيمن واختر تصدير. جعل صورة مسطحة وتعيين النطاق من أول إلى آخر صورة وترك البرنامج إظهار مكدس الناتجة عن ذلك. حفظ المكدس في تنسيق tif.
5-تلوين وتركيب للتصوير ووزارة شؤون المرأة
ملاحظة: لإعداد حلول المصبوغة انظر الجدول للمواد. الحلول قد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا، محمية من الضوء والهواء.
تنبيه: خلات اليورانيل وسترات الرصاص تحتوي على المعادن الثقيلة، وسامه. ارتداء القفازات والتخلص من النفاية طبقاً لتعليمات السلطات المحلية.
- تغطية الجزء السفلي من الزجاج كبير طبق بتري (قطرها 30 سم) مع بارافيلم وخط حافة الطبق مع النسيج الرطب لبناء غرفة رطبة.
ملاحظة: من المهم أن الكريات عدة من هيدروكسيد الصوديوم متوضعة داخل طبق بيتري قرب قطرات المصبوغة لمنع هطول الأمطار المفرطة سترات الرصاص. -
تلوين خلات اليورانيل
- الطرد المركزي خلات اليورانيل في 2,680 س ز لبضع ثوان للرواسب الجسيمات الصغيرة.
- استخدم حوالي 300 – 500 ميليلتر لحل كل ساترة. ضع قطره واحدة لكل ساترة على بارافيلم ووضع الزجاج رأسا على الانخفاض، حيث أن الأقسام على اتصال مع السائل المصبوغة.
- احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتغطي الطبق أثناء التلوين.
- إزالة ساترة مع الملقط والمياه والصرف الصحي بأنها تتحرك صعودا وهبوطاً في كوب مليء بالماء المقطر (راجع الخطوة 2.1.3).
-
يؤدي تلطيخ سترات
- أثناء الاحتضان خلات اليورانيل، إعداد الحل سترات الرصاص.
ملاحظة: يجب أن تتم تصفيته سترات الرصاص دائماً مباشرة قبل استخدامها لإزالة أي رواسب. أيضا الطرد المركزي الحل سترات الرصاص في 2,680 س ز لبضع ثوان كما في الخطوة 5.2.1. - استخدم حوالي 300 – 500 ميليلتر لحل كل ساترة. ضع قطره واحدة لكل ساترة على بارافيلم مباشرة قبل الغسيل كوفيرسليبس بعد تلطيخ خلات اليورانيل، ووضع الزجاج رأسا على الانخفاض، حيث أن الأقسام على اتصال مع السائل المصبوغة. ضع القطرات (300 – 500 ميليلتر) على بارافيلم مباشرة قبل الغسيل كوفيرسليبس بعد تلطيخ خلات اليورانيل.
ملاحظة: لتجنب تشكيل رواسب، لا تتنفس على قطرات سترات الرصاص. - ضع ساترة غسلها رأسا إلى الانخفاض (ليس هناك حاجة الجافة).
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتغطي الطبق أثناء تلطيخ.
- إزالة ساترة مع الملقط وغسله كما هو موضح أعلاه في كوب مع المياه العذبة (الخطوة 5.2.4).
- أثناء الاحتضان خلات اليورانيل، إعداد الحل سترات الرصاص.
- جاف ساترة بعناية مع الهواء المضغوط.
-
تركيب عينات لتصوير SEM
- جبل رقائق السيليكون على بذرة الألومنيوم مع لوحة الكربون لزجة.
ملاحظة: كوفيرسليبس المغلفة إيتو قد أما سيتم تحميلها باستخدام الطلاء الفضة والنحاس-الشريط – تأكد من سطح موصل متصل إلى كعب الروتين – أو مع منصات الكربون كما ذكر أعلاه. وفي هذه الحالة، يمكن إجراء اتصال موصلة من إيتو-السطح إلى كعب الروتين مع قطره طلاء الفضة.
- جبل رقائق السيليكون على بذرة الألومنيوم مع لوحة الكربون لزجة.
6-التسلسل الهرمي التصوير في وزارة شؤون المرأة
ملاحظة: في انبعاثات ميدان وزارة شؤون المرأة، اختر من طاقة الأولية منخفضة (3 كيلوفولت أو أقل)، شعاع الحالية في مجموعة من 50 إلى 800 من السلطة الفلسطينية لتجنب فرض رسوم، ومسافة عمل مناسبة لكفاءة جمع الإلكترونات الثانوية و/أو منتشرة في ظهره. التحديد الحالي شعاع يعتمد على خصائص العينة (مثلاً.، تضمين الراتنج)؛ سوف تكون الجرعة الإلكترون أيضا حلاً وسطا بين تيار صغيرة (أقل ضررا بالعينة) وتيار عالية، وهو مفيد للتصوير السرعة وبالتالي يخفض الوقت اكتساب الصورة الإجمالية. كشفه للإلكترونات منتشرة في الظهر توفير تباين جيد، هي أقل حساسية للشحن من العينة، وإظهار أقل من التحف سطح العينة (طيات، علامات السكين). وينبغي تعديل التباين والسطوع مثل أن يتم توسيط الرسم البياني.
-
تصوير SEM
- أولاً تعريف الزوايا الأربعة من الصفيف بالاستيلاء على صورة من كل زاوية في تضخم منخفض، حول 100 x. إنشاء منطقة للفائدة (ROI) أرفق الصفيف بالكامل. تعيين وضع بروتوكول تصوير مع المعلمات التالية: استخدام كاشف الإلكترونات الثانوية (جنوب شرق)، مما يسمح للتصوير عالية السرعة في حجم بكسل صورة كبيرة (على سبيل المثال 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط)، وفترة زمنية قصيرة يسكن (مثلاً 0.2 المايكروثانيه).
ملاحظة: للتغلب على قيود الإلكترون الضوئية في كبيرة مسح الحقول من وجهة (FOV)، التي قد تؤدي إلى تشوهات في المحيط من الصور، استخدام أوضاع التكبير المنخفض مخصصة (المقدمة من معظم الشركات المصنعة لوزارة شؤون المرأة) أو استخدام الوسيلة، 1 إلى 2 ك مسح حقول الصور واحدة. - إنشاء قسم تعيين عن طريق إنشاء عائد يحدد فقط الأنسجة في القسم الأول. استنساخ لجميع الفروع اللاحقة باستخدام أداة الختم. قم بتدوير رويس عند الحاجة إلى استيعاب شرائط مثنية.
- تسجيل سلسلة الصورة استخدام حجم بكسل متوسط (حوالي 50 نانومتر) ويسكن وقت طويل بما يكفي لتحديد والتعرف بنية الهدف. استخدام FOV للصور واحدة في مجموعة من 6-10 كيلو بكسل.
ملاحظة: يمكن برنامج أطلس 5 تلقائياً بتجميع الفسيفساء تتألف من الصور المتاخمة لتغطية مساحات كبيرة من عائد الاستثمار/قسم عبر مقاطع المسلسل. - إنشاء موقع ضمن هذه المجموعة القسم، الذي يحتوي على بنية الهدف للتصوير العالي بالقرار ووزارة شؤون المرأة. جعل عائد الاستثمار كبيرة بما يكفي لمراعاة لدقة المرحلة. فحص وضبط مواقف المواقع.
ملاحظة: من الأهمية بمكان رويس في مثل هذه طريقة أن المركز، حيث سيتم ضبط تلقائي للصورة، وأوتوستيجميشن، لا تجلس في مادة "فارغة" مع أي من التفاصيل الهيكلية، على سبيل المثال.، فاكوليس. - تعريف إعدادات ضبط تلقائي للصورة، والتحقق من الأداء الأقل طول الشريط (أيأطول مسافة المرحلة له بالسفر) على عائد صغيرة قريبة من الموقع الذي سوف يتم أخذ صورة عنه.
- تعريف بروتوكولا تصوير لاقتناء SEM عالية الدقة. لرؤية غشاء المقصورات، اختر حجم بكسل الصورة nm 3 – 5. حدد وقت يسكن اعتماداً على الجهاز حيث أن الصورة ليست صاخبة جداً.
- قبل البدء في شراء، تعريف قيم التركيز في القسم الأول على الأقل لكل الشريط باستخدام الخيار البروتوكول الاختيار.
- ابدأ التصوير الآلي بوزارة شؤون المرأة على مدى سلسلة كاملة من المستهدفة رويس.
- تصدير البيانات المكتسبة كسلسلة الصورة، ويفضل أن يكون ذلك في تنسيق tif.
- أولاً تعريف الزوايا الأربعة من الصفيف بالاستيلاء على صورة من كل زاوية في تضخم منخفض، حول 100 x. إنشاء منطقة للفائدة (ROI) أرفق الصفيف بالكامل. تعيين وضع بروتوكول تصوير مع المعلمات التالية: استخدام كاشف الإلكترونات الثانوية (جنوب شرق)، مما يسمح للتصوير عالية السرعة في حجم بكسل صورة كبيرة (على سبيل المثال 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط)، وفترة زمنية قصيرة يسكن (مثلاً 0.2 المايكروثانيه).
7-تسجيل المكدس الصورة SEM
- استيراد صورة سلسلة إلى فيجي مكدس ظاهري.
ملاحظة: سوف تكون هذه الملفات الكبيرة من البيانات في المجموعة من بضعة غيغابايت اعتماداً على العدد من الأبواب وحجم العائد على الاستثمار. - المحاصيل الصورة SEM المكدس لمزيد من المعالجة إلى منطقة قريبة من هيكل الفائدة قدر الإمكان، وضبط السطوع والتباين.
- فتح من جديد تراكيم17 (فارغة) من القائمة ملف.
- انقر على الحق في حقل الصورة، واستيراد المكدس إلى تراكيم ك "شريحة واحدة كل طبقة".
- محاذاة الطبقات (انقر على الحق في حقل الصورة)، اختر المربعات كالوضع، وتعيين النطاق (أول صورة إلى آخر)، واختر لا شيء كالمرجع. للحصول على إعدادات، استخدام القيم الافتراضية واختيار جامدة كالتحول المنشود.
- عندما يتم التسجيل مكتملة ومرضية، احفظ dataset المنحازة التي انقر بالزر الأيمن واختر تصدير. جعل صورة مسطحة وتعيين النطاق من أول إلى آخر صورة، والسماح للبرنامج إظهار مكدس الناتجة. حفظ المكدس في تنسيق tif.
Representative Results
ووصف سير العمل هنا يبدأ (الشكل 1) مع عينة جزءا لا يتجزأ من كتلة راتنج. أثناء إعداد عينة، ينبغي إدخال بعض المعادن الثقيلة في الأنسجة، ولكن ليس من الضروري استخدام البروتوكولات الأمثل للتلميع قوية بدلاً من ذلك. ويبين الشكل 1A جذر نبات (الرشاد) كتلة الملطخة تقليديا مع 1% أوسو4 و metalized خلات اليورانيل 1%، بينما جذر نبات في الشكل 1B ضعيف فقط استخدام خلات اليورانيل 0.5%. نوع النموذج الأخير الأنسب للنهج ستتحقق كما تميل بعض المعادن الثقيلة إخماد الأسفار. مع حامل الركيزة مخصصة (الشكل 2)، يمكن أن تكون صفائف من عدة مئات من المقاطع المنتجة (الشكل 1). بعد وضع العلامات الفلورية، مثل هذه الصفائف تصويرها في FLM واسع المجال قياسي (الشكل 1)، ثم ملطخة بحلول المعادن الثقيلة وتصويرها في وزارة شؤون المرأة في قرارات مختلفة (الشكل 1E–ز).
أدوات هامة لتوليد استنساخه من المصفوفات، خاصة عند وضع عدة أشرطة من سكين قارب مبضع على الركازة، هي حامل الركيزة (الشكل 2A، خصيصا في مختبر صاحبي) والماس جامبو سكين بقارب كبيرة بما يكفي لاستيعاب شرائح المجهر (الشكل 2). غضروف مسطح، مما يتيح مراقبة جيدة من الشرائط، ضروري، ويمكن أن يتحقق عن طريق تنظيف البلازما من الركازة: قطره صغيرة من الماء المقطر لا ينبغي أن يشكل بنية تشبه العدسة على الركازة كما في الشكل 2 (الركيزة غير المعالجة)، لكن طبقة رقيقة (الشكل 2D، الركيزة البلازما المنشط). في ظل هذه الظروف، شرائط تعلق على الجزء الجاف من ساترة إيتو المغلفة بسهولة تصور (الشكل 2E) ويمكن ملاحظة والتحكم أثناء الرفع من الركازة من الماء.
على سبيل مثال، تم تصويرها صفائف ملطخة يوديد propidium لتسمية جدران الخلايا النباتية مع حقل واسع قياسية FLM (الشكل 3A). نظراً للمقاطع فقط 100 نانومتر سميكة، حتى يلطخ الإفراط كما هو موضح هنا يدخل طمس قليلاً. بعد التسجيل، واختيرت الخليتين محاطة تماما بحجم أعيد بناؤها من المكدس الصورة (الشكل 3B) لتصوير عالي الدقة في 3D (انظر أيضا تكميلية الفيلم S1). على أثر تلطيخ إضافية مع سترات خلات والرصاص اليورانيل، تم تصويرها في الصفيف في sem. الشكل 3 جيم يبين نظرة عامة، تسجل مع 60 بكسل صورة نانومتر؛ ساحة مظلمة في وسط الصورة يشير إلى الموضع حيث أعدم مهام ضبط تلقائي للصورة، وجرعة إضافية أدت إلى تلوث طفيف. المناسبة رويس في تلك الأبواب المسلسل (شرائح 51 إلى 248 من شرائح 435 في المجموع) التي تحتوي على الخلايا الهدف الثاني المحدد في المكدس FLM سجلت ثم مع حجم بكسل صورة شمال البحر الأبيض المتوسط 5 (3D الشكل؛ انظر أيضا تكميلية الفيلم S2).
كان يتم تصوير هرمية الآلي من الصفائف في SEM الموصوفة هنا مع الحل منصة برمجيات ومعدات زايس أطلس 5. أولاً، لمحة عامة عن الصفيف بالكامل تم إنشاؤه باستخدام كاشف سراج الدين، مع كبير جداً (1,000 nm) صورة بكسل والوقت يسكن منخفضة جداً (الشكل 4 أ). دوروا تبين أنسجة فقط على القسم الأول ونشرها إلى جميع الأقسام الأخرى من الصفيف. ثم سجلت مجموعة المقطع هذه مع 60 نانومتر بيكسلات الصورة استخدام وقت يسكن أطول (الشكل 4 باء). وأخيراً، أنشئت مجموعة موقع التي تحتوي على الخلايا الهدف اثنين زائد واحد "طبقة" المحيطة بالخلايا لمراعاة عدم دقة المرحلة، مع المعلمات التالية: كشف حساب الضمان باء (الطاقة تشتت ارتدادي الانتقائي)، 5 نانومتر الصورة بكسل، طويلة جداً (40 المايكروثانيه) يسكن الوقت ( 4 الشكل). التكبير لمثل هذه صور يظهر التفاصيل سوبسيلولار (الشكل 4) مثل الميتوكوندريا (M) ونواة (N)، فاكوليس (V) وهيولي (الأسهم). انظر أيضا تكميلية فيلم S3 للتكبير من لمحة عامة عن مجموعة كاملة للتفاصيل سوبسيلولار للخلية الهدف واحد.
الصفيف هو موضح هنا (مقاطع 200) بالإضافة إلى أحد الأقسام 250 استغرق حوالي 8 ح لإنتاج إضافية، ليلة واحدة وصمة عار LM، ويوم واحد لتسجيل (يدوياً) في FLM. بعد تلطيخ يستغرق حوالي 1-2 ح في المجموع، اعتماداً على عدد الصفائف الفردية. المطلوبة لتسجيل وزارة شؤون المرأة، وبضع ساعات لإعداد تشغيل نظام أطلس، والتسجيل الآلي كان ح 3 – 4 لمجموعة القسم (60 شمال البحر الأبيض المتوسط الحجم بكسل) القرار المتوسطة (أقسام 200, 450 × 200 ميكرومتر2) وحوالي 5 أيام الاستبانة (5 نانومتر حجم بكسل) عائد الاستثمار تحتوي على خلايا الهدف الثاني (200 المقاطع، 55 x 30 ميكرون2). لاحظ أنه بسبب انخفاض المحتوى المعدني للعينة المعروضة هنا، أن سرعة مسح بطيئة جداً استخدامها للوصول إلى الكشف عن إشارة إلى الضوضاء جيدة، مما يعني (لكشف المتاحة حاليا) وقت يسكن المايكروثانيه 40 للعائد على الاستثمار ذات الدقة العالية.
هناك العديد من الخطوات في سير العمل كله عرضه للمخاطر: ومن الناحية المثالية ينبغي أن تكون شرائط أكثر أو أقل مباشرة ووضعها في الترتيب الصحيح (الشكل 5A). ومع ذلك، غالباً ما تنتج بنت (الشكل 5B) أو المنحنى (الشكل 5)، أو شرائط حتى كسر. يمكن أن ينتج هذا بسبب اقتطاع غير صحيحة (الرائدة وحواف خلفية موازية ليست بالضبط)، أو لاصقة التطبيقية غير موحد، بل أيضا من نموذج غير متماثل أو غير متساو تسلل. مزعجة لا سيما العينات التي تحتوي على مكونات ناعمة ومن الصعب جداً على حد سواء. مكونات هذا الأخير قد يكون من الصعب على التسلل مثل جدار الخلية من جذور النباتات المعروضة هنا (الشكل 5). في هذه الحالة، يمكن أن يكون سبب طيات (رؤوس) بسهولة بضغط متغير والاسترخاء خلال تمزيقها. للألى التصوير في وزارة شؤون المرأة، شرائط منحنية لا يمثل مشكلة كبيرة، حيث يمكن تدويرها في رويس لاستيعاب انحناء الشريط.
هو تلطيخ خطوة حاسمة أخرى في البروتوكول: الغسيل غير كافية يمكن أن تؤدي إلى المخلفات في المقطع (الشكل 5E، و)، وفي أسوأ الأحوال، تغطي المنطقة الأكثر إثارة للاهتمام (دائرة في إحدى الخلايا الهدف الثاني في الشكل 5F). أيضا، الغبار (الشكل 5، جسيمات تشتت الضوء بشدة) أدخلت القارب سكين، مثلاً، مع ناقل الركازة قذرة، يمكن أن يسبب مشاكل خطيرة: في FLM، يمكن أن يكون الغبار الفلورية العالية (انظر بعض الشرائح في "الفيلم تكميلية" S1) إلى درجة أن بعض الخوارزميات التسجيل لا تعمل. الدالة "محاذاة" في تراكيم17 ومع ذلك، يمكن التعامل مع هذه المكدسات كما هو موضح في تكميلية الفيلم S1.
رقم 1: سير العمل لتصوير هرمية الارتباطية. بدءاً من عينة جزءا لا يتجزأ من كتلة راتنج (A، عينة بشدة ميتاليزيد)، والعينة الأولى قلص (ب، عينة metalized ضعيفة) وثم صفائف تتألف من عدة شرائط من مقاطع المسلسل (ج)، وضعت هنا على ساترة المغلفة إيتو، يتم إنتاجها باستخدام أولتراميكروتومي. بعد صبغة بصبغة فلورسنت، تسجل أكوام من الصور في FLM واسع المجال (د). بعد زيادة تلطيخ جولات مع المعادن الثقيلة الأملاح، يتم تصويرها مكدسات في SEM (ه–ز) في قرارات مختلفة (أحجام بكسل صورة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أدوات لإعداد مصفوفات. حامل الركيزة التي يتم تجميعها من ميكرومانيبولاتورس مع سبعة محاور حركة تعلق على أولتراميكروتومي قياسية (A): المسامير، وأبرزت مع الدوائر، حركة (2) الأفقي والرأسي (1) وآماله (3) من الناقل الركيزة . سكين الماس جامبو مع زورق كبيرة الحجم لاستيعاب ركائز الكبيرة (السهم)، هنا مع قطعة من رقاقة السيليكون المنشط البلازما التي شنت على ناقل ألومنيوم الحجم الشريحة (ب). 20 ميليلتر قطرات الماء المقطر وضعها على الركازة رقاقة سليكون غير معالجة (ج) أو على الركازة المنشط البلازما (د). أربعة أشرطة عائمة في زورق سكين, موصولة إلى ساترة إيتو المغلفة بغاياتها أقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: العلاقة بين البيانات LM مع بيانات وزارة شؤون المرأة- نظرات عامة (، ج) والخلايا المستهدفة (ب، د) المسجلة مع FLM (، ب) ووزارة شؤون المرأة (ج، د). (ب) تكبير برمجيات، والبيانات الأصلية وسجلت مع عدسة هدف X 40 على رقاقة كاميرا 1,388 x 1,040 بكسل، بينما تسجل مع 60 حجم بكسل الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط، و (د) (ج) مع 5 حجم بكسل الصورة في شمال البحر الأبيض المتوسط، التي توضح الحقيقية زيادة في القرار في sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: هرمية التصوير في SEM "زايس أطلس 5 يجيدون" استخدام نظرة عامة على صفيف سجلت 1,000 بيكسلات الصورة نانومتر باستخدام كاشف سراج الدين (A). ويعرض القسم مع العائد على الاستثمار على الأنسجة في كل قسم وسجلت مع بيكسلات الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط 60 (ب). يحدد الموقع مع عائد مسلسل على الخلايا الهدف وسجلت مع بيكسلات الصورة شمال البحر الأبيض المتوسط 5 (ج). عند التكبير في مثل هذه الصور ذات الدقة العالية (د)، تصبح مرئية المقصورات غشاء داخل الخلايا مثل فاكوليس (V) ونواة (ن) الميتوكوندريا (M) هيولى (الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مشاكل نموذجية. 1-الناشئة عن عملية تقطيع: قد يسبب شرائط على ضغط مثالي على التوالي (A)، ولكن عدم انتظام كوفيرسليبس المغلفة إيتو أثناء تقطيع بنت (ب) أو شرائط منحنية (د)، أو حتى طيات (ج). 2-الناجمة عن التعامل مع الركيزة وشرائط في المياه، مثلاً، من خلال تمزيقها وتلطيخ: ضوء نثر الجسيمات في الطبقة السفلية (د)، ريم قطرات على المقطع (دائرة في ه) أو الاوساخ لطخت بها عبر الأنسجة بسبب عدم كفاية الغسيل بعد تلطيخ (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الفيلم S1: المكدس الصورة FLM. الصور 435 الانحياز في فيجي16 استخدام تراكيم17 وحفظها كملف الفيلم (.avi). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الفيلم S2: المكدس الصورة SEM. محاذاة الصور 210 في فيجي16 استخدام تراكيم17. وكان المكدس الأصلي (300 الصور) مجموعة البيانات هذه 15 غيغابايت. إلى تقليص حجم المكدس من 3.3 غيغابايت (بعد المحاذاة والاقتصاص فقط هما استهداف الخلايا)، تم تحجيمه في x y بمقدار 0.2 باستخدام فيجي وثم حفظه كفيلم.avi. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية فيلم S3: التكبير مع مستويات دقة مختلفة في sem. التي تم إنشاؤها في الفيلم وتصديرها من برنامج أطلس 5 في تنسيق.mp4. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
سير عمل لاستهداف خلايا معينة داخل أنسجة بالنقل المتعدد الوسائط في هرمية تجلى: عينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج هو شرائح إلى صفائف مقاطع المسلسل، التي يتم وضعها على الركازة موصلة باستخدام حامل الركيزة خصيصا. بعد وضع العلامات مع فلوروفوري والتصوير في FLM، يتم استخدام حجم أعيد بناؤها لتحديد الخلايا المستهدفة. بعد جولات تلطيخ إضافية مع المعادن الثقيلة ليعرض على النقيض، يتم تصويرها هذه الأهداف على عدة أقسام مئات دقة النانو في SEM استخدام منصة برمجيات الآلي.
لإنتاج صفائف كثافة مع عدة شرائط طويلة، حامل الركيزة مشابهة لتلك الموضحة هنا ضروري. قد يكون شخص المريض وغير المهرة قادرة على إرفاق عدة شرائط الركازة سليكون، شبه مغمورة في زورق سكين, واسترداد الصفيف بخفض منسوب المياه تدريجيا حتى يجلسون الشرائط على الركازة. ومع ذلك، في تجربتنا، هناك ميل تحطيم تشكيل عند الركيزة لمس أي جزء من القارب سكين (انظر الملاحظة في 1.3.2 في البروتوكول). وبالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء أكثر صعوبة مع ركائز المغلفة إيتو: (1) نظراً لشفافية إيتو-الزجاج، من الصعب رؤية حافة الماء حيث قد ينتهي الأشرطة ترفق؛ و (2) لأن السطح المغلفة إيتو أخشن كثيرا من رقاقة السيليكون مصقول للغاية، الشرائط تميل إلى كسر أثناء الرفع وقد تعدت شظايا صغيرة تتألف من بعض الأقسام، وبالتالي تدمير ترتيب المقاطع.
من الممكن أيضا سير العمل كله دون الارتباط ببيانات FLM. وفي هذه الحالة، قد يكون جمع البيانات في وزارة شؤون المرأة القيام بها في عدة دورات. إعادة بناء ثلاثي الأبعاد أولية أو على الأقل قد يكون من الضروري لتحديد أهداف التقييم البيانات دقة منخفضة أو متوسطة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تطبيق البقع النسيجي التقليدية برايتفيلد LM (التي لا تتطلب FLM). وبطبيعة الحال، هي الأخرى خيارات6،7،8 جسم وضع العلامات على الصفائف، كما تبين فعلا في الورقة الأولى في الساعة18، أو وراثيا ترميز البروتينات الفلورية (إكسفبس) أو قبل تضمين العلامات مع المحافظة على الأسفار أثناء إعداد عينة.
حد عامة لمناقشة الأسلوب هو استخدام المقاطع لسماكة معينة وعينات منفصلة الناتجة من الحجم الثلاثي الأبعاد: القرار في Z يمكن فقط جيدة مثل سمك الفروع منذ SEM بجمع البيانات فقط من سطح القسم (د ابيندينج على الطاقة الأولية الطاقة/الهبوط المحدد). وهذا يعني أن حجم ثلاثي الأبعاد الناتجة متباين فوكسيلس، على سبيل المثال.، 5 × 5 × 100 nm3 إذا 100 أقسام نانومتر وحجم بكسل صورة 5 نانومتر المستخدمة. لكيانات صغيرة جداً في نطاق حجم أدناه 1 ميكرومتر، وهذا قد لا تكون كافية لوصف ultrastructural حقيقية. هو القيد تقنية أكثر دقة المرحلة التي تستخدم في وزارة شؤون المرأة للتصوير الآلي. ونتيجة لهذا، من الضروري اختيار دوروا أكبر من مواصفات دقة المرحلة لضمان أن يتم تصويرها منطقة الهدف الكامل.
مقارنة SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز ككتلة-الوجه من أساليب التصوير، قد ستتحقق في نهائي ومن سيئات فوكسيلس متباين، كما هو موضح أعلاه. مع التعزيز-وزارة شؤون المرأة، يمكن الحصول على الخواص فوكسيلس 5 × 5 × 5 نانومتر3 عند تصحيح الانحراف سليم في المكان.
الثغرات في حجم أعيد بناؤها بسبب فقدان المقاطع أثناء إعداد مصفوفات يمكن أيضا قلق من أن عدم مصادفة مع SBF-وزارة شؤون المرأة أو التعزيز-وزارة شؤون المرأة. مع تثبيت الشريط جيدا بالغراء، وهذا عادة فقط مسألة للجزء الأخير من الشريط: قد يكون معطوباً عند إطلاقه من حد السكين تستخدم في جفن. ومع ذلك، في تجربتنا، الخسارة في قسم واحد في كل الأقسام 20 – 50 لا تؤثر تسجيل الصورة.
من ناحية أخرى، يمنح إمكانية مرحلة ما بعد وصمة عار صفائف إشارة جيدة والتباين للتصوير ووزارة شؤون المرأة، وحتى على عينات ميتاليزيد ضعيفة مثل ارتفاع الضغط المجمدة تلميحات الجذر هو موضح هنا. ولذلك، فإنه ليس من الضروري التوصل إلى حل وسط المحافظة ultrastructural الأمثل بالعديد من التثبيت الكيميائي وخطوات التلميع. أيضا، تقديم عينات روتينية من مختبر علم الأمراض بدرجات متوسطة من المعدنة بيانات ممتازة10. تعزيز النقيض بعد تضمين مثل هذه لا يمكن SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز بصورة عامة. وعلاوة على ذلك، وبهذه الطرق المدمرة، أيتستهلك العينة أثناء التصوير، هرمية التصوير في قرارات مختلفة ومواقع أو التصوير المتكرر في نقطة لاحقة في وقت مستحيل. من حيث المبدأ، إنشاء وحدات التخزين غير محدودة، تتألف من FOVs كبيرة (مثلاً، تصل إلى عدة ملليمترات للعقول الماوس كله في كونيكتوميكس) بخياطة الفسيفساء، وإعدادا هائلة من المقاطع يمكن اكتسابها من خلال تي، بينما في التعزيز-وزارة شؤون المرأة، FOVs تتجاوز 100 ميكرومتر µm x 100 ويصعب تحقيق مع الصكوك الروتينية.
زيادة التشغيل الآلي في وصف-سير العمل سيكون ميزة أكيدة، منذ تنفيذ الأساليب المذكورة أعلاه SBF-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة-التعزيز تمزيقها والتصوير داخل نفس الصك بطريقة مؤتمتة بالكامل على حد سواء. يوجد نوع واحد من التشغيل الآلي لتقطيع: "أتومتومي"12 ويمكن توليد وجمع آلاف مقاطع، ولكن استخدام Kapton الشريط الركازة يجعل مثل صفائف صعبة للصورة في FLM. على كوفيرسليبس إيتو المغلفة المستخدمة هنا، ينبغي أن يكون تصوير القرار فائقة حتى ممكن. وسيكون هدف مرغوب فيه جداً، وكذلك لأتمتة تسجيل رزمة البيانات FLM. من ناحية أخرى، التشغيل الآلي يمكن أن تكون مكلفة وفيما عدا صاحب الركازة، يعتمد سير العمل المقدمة هنا (من حيث الأجهزة) فقط على الأجهزة التي تتوفر عادة في م روتينية مرفق المختبر أو الأساسية، مما يجعل من انخفاض مستوى الوصول.
Disclosures
طقم تلقت المبالغ المسددة "صكوك بويكيلير" لتوريد نموذج وظيفي لحامل الركيزة. تالر مارلين هو الموظف من زايس مجهرية GmbH، الشركة المصنعة لأنظمة المجهر المشار إليها في هذه المادة. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر زايس بعض الحلول مثل حزم الحل "زايس أطلس" لمجموعة واسعة من التطبيقات في مجال التصوير ثلاثي الأبعاد، ومساحة كبيرة للصكوك التعزيز-وزارة شؤون المرأة ووزارة شؤون المرأة. ليس لها علاقة بالكشف عن جميع مؤلفين آخرين.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل 13GW0044 فكز منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث، ومشروع مورفيكوانت-3D. ونحن نشكر "بارتلز كارولين" للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
| Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
| Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
| Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
| Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
| Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
| Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
| FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sectioning | |||
| Razor blades | Plano | T585-V | |
| Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
| Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
| Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
| ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
| Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
| Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
| Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
| Diamond scriber | Plano | T5448 | |
| Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
| Brush | Selfmade | ||
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
| Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
| Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
| Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
| Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
| Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
| Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
| Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
| Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
| NaOH pellets | Merck | 106469 | |
| 1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
| Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting | |||
| Stubs | Plano | G301F | |
| Carbon pads | Plano | G3347 | |
| Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
| Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions/mixtures | |||
| Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
| Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
| Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
| Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |
References
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience. J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R. Array tomography. J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).
- Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).
- Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures. Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Verkade, P., Müller-Reichert, T. Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).
- Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design. Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).
- Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample. Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).
- Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).
- Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).
- Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J.
- Fahrenbach, W. H. Continuous serial thin sectioning for electron microscopy. J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
