Summary
यहां हम चूहों में कार्डियक-विशिष्ट जीन हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । संज्ञाहरण के तहत, माउस दिल चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से बाह्य थे । बाद में, एडिनोवायरस एंकोडिंग विशिष्ट जीन मायोकार्डियम में एक सिरिंज के साथ इंजेक्शन, के द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति माप द्वारा पीछा किया गया vivo इमेजिंग और पश्चिमी दाग विश्लेषण में ।
Abstract
विशेष रूप से दिल में जीन हेरफेर हृदय रोग pathomechanisms और उनकी चिकित्सीय क्षमता की जांच शक्ति प्रदान काफी है । vivo में कार्डिएक-विशिष्ट जीन डिलीवरी सामांयतः या तो प्रणालीगत या स्थानीय वितरण द्वारा प्राप्त की है । पूंछ नस के माध्यम से प्रणालीगत इंजेक्शन रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस 9 (AAV9) का उपयोग करके हृदय जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ में आसान और कुशल है । हालांकि, इस विधि के कुशल transduction के लिए वेक्टर के एक अपेक्षाकृत उच्च राशि की आवश्यकता है, और untargeted अंग जीन transduction में परिणाम हो सकता है । यहाँ, हम एक सरल, कुशल, और चूहों में vivo कार्डिएक-विशिष्ट जीन हेरफेर में के लिए intramyocardial इंजेक्शन की समय बचाने की विधि का वर्णन. संज्ञाहरण के तहत (वेंटिलेशन के बिना), कवच प्रमुख और छोटे मांसपेशियों को कुंद में विच्छेदित किया गया, और माउस दिल जल्दी से मैनुअल externalization द्वारा चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष में एक छोटा सा चीरा के माध्यम से उजागर किया गया था । बाद में, एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase (ल्यूक) और विटामिन डी रिसेप्टर (VDR), या लघु hairpin आरएनए (shRNA) लक्ष्यीकरण VDR, मायोकार्डियम में एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया गया था । बाद में vivo इमेजिंग कि luciferase सफलतापूर्वक दिल में विशेष रूप से व्यक्त किया गया था प्रदर्शित । इसके अलावा, पश्चिमी दाग विश्लेषण सफल व्यक्त या माउस दिल में VDR के मुंह बंद करने की पुष्टि की । एक बार महारत हासिल, इस तकनीक जीन हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही कोशिकाओं या माउस दिल में nanogels के रूप में अंय सामग्री के इंजेक्शन ।
Introduction
हृदय रोग रुग्णता और मृत्यु दुनिया भर में1,2का प्रमुख कारण है । रोधगलन और हृदय की विफलता सहित जीवन की धमकी दिल की स्थिति के लिए प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों की कमी अंतर्निहित pathomechanisms और उपंयास चिकित्सीय विकल्प3की पहचान के गहन अन्वेषण को आकर्षित करती है । इन वैज्ञानिक अन्वेषणों के लिए, कार्डियक-विशिष्ट जीन हेरफेर व्यापक रूप से4,5प्रयोग किया जाता है । कार्डिएक जीन हेरफेर जीनोम संपादन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है शक्तिशाली प्रतिलेखन उत्प्रेरक का उपयोग कर प्रभाव nuclease (तलेन) और नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic (CRISPR)/CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) उपकरण, या द्वारा संकुल की तरह अस्थानिक आनुवंशिक सामग्री की डिलिवरी (उदा, वायरस वैक्टर ले जाने जीन ब्याज की एंकोडिंग प्रोटीन)6। हालांकि जीनोम संपादन चूहों में रहने वाले सटीक और spatiotemporal जीनोम संशोधनों की अनुमति देता है, यह अभी भी एक समय लेने वाली और श्रम गहन अभ्यास है6। वैकल्पिक रूप से, हृदय-वायरस वेक्टर या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) जटिल प्रसव द्वारा विशेष जीन हेरफेर नियमित रूप से6प्रदर्शन कर रहे हैं ।
वायरस वेक्टर डिलीवरी वयस्क माउस दिल मोटे तौर पर दो रणनीतियों: प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन द्वारा हासिल की है । AAV9 के रूप में AAVs के cardiotropic सीरोटाइप के प्रणालीगत इंजेक्शन कार्डियक विशिष्ट जीन हेरफेर7के लिए आक्रामक है । हालांकि, इस विधि के एक अपेक्षाकृत उच्च राशि की आवश्यकता है वेक्टर कुशल transduction और जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है, और इस तरह की मांसपेशी और जिगर7के रूप में लक्षित अंगों की महत्वपूर्ण transduction में परिणाम हो सकता है । लोकल वायरस इंजेक्शन intramyocardial इंजेक्शन या intracoronary डिलिवरी7द्वारा हासिल की है । Intracoronary डिलीवरी intramyocardial इंजेक्शन की तुलना में दिल के भीतर वायरस का एक और भी वितरण करने के लिए सुराग । हालांकि, इस तकनीक का नुकसान प्रणालीगत संचलन और transduction के लिए untargeted अंगों में तेजी से वायरल वैक्टर से बाहर धोने रहे हैं8, और आपरेशन के दौरान दबाव माप के लिए उपकरणों की अपनी आवश्यकता । इसके विपरीत, intramyocardial इंजेक्शन मायोकार्डियम में बेहतर वायरस प्रतिधारण सक्षम बनाता है और साथ ही साइट विशिष्ट वितरण, लेकिन यह समान रूप से वायरल वेक्टर7वितरित करने के लिए विफल रहता है. छोटे जानवरों के लिए, intracoronary प्रसव के लिए तकनीकी रूप से कठिन प्रदर्शन है, जबकि प्रणालीगत AAV9 इंजेक्शन और intramyocardial इंजेक्शन अधिक सामांयतः4,5,7अभ्यास कर रहे हैं । हालांकि प्रणालीगत इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है, पारंपरिक intramyocardial इंजेक्शन यांत्रिक वेंटिलेशन और thoracotomy की आवश्यकता है, व्यापक ऊतक क्षति का कारण बनता है, और समय लेने वाली है ।
इस रिपोर्ट में, हम intramyocardial इंजेक्शन के लिए एक आसान, समय की बचत, और अत्यधिक कुशल विधि वर्णित है । एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase और VDR, या shRNA लक्ष्यीकरण VDR, हृदय जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर इंजेक्शन था । एक बार महारत हासिल, इस विधि जीन हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही कोशिकाओं या माउस दिल में अंय सामग्री के इंजेक्शन ।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थानों के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर किया गया था, और संस्थान की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । पुरुष C57BL/6J चूहों (8-10 सप्ताह की आयु) सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया. चूहों 24 ° c ± 4 डिग्री सेल्सियस में रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत स्थित थे, एक 12-एच प्रकाश के तहत/अंधेरे चक्र, पानी और भोजन के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ.
1. एडीनोवायरस समाधान की तैयारी
- शुद्ध एडीनोवायरस समाधान के आगमन पर, एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में समाधान की दुकान ।
नोट: एडीनोवायरस इंजेक्शन व्यवहार्य चूहों में प्रदर्शन किया गया था । एडीनोवायरस सदिश की बाँझता को सुनिश्चित करने के लिए, एडीनोवायरस (एंकोडिंग luciferase, VDR, या shRNA लक्ष्यीकरण VDR) को व्यावसायिक रूप से9,10तक तैयार और शुद्ध किया गया । - आपरेशन के दिन, बाहर शुद्ध एडीनोवायरस समाधान ले (3 x 1010 पट्टिका बनाने इकाइयों [pfu]/mL) से-८० ° c फ्रीजर, और गल एडीनोवायरस वेक्टर समाधान पर बर्फ ।
- एक facemask, बाँझ दस्ताने, और बाँझ गाउन पर रखो ।
- एक ५०-µ एल हैमिल्टन सिरिंज जो आपरेशन से पहले दिन निष्फल किया गया है तैयार करते हैं ।
नोट: नसबंदी के लिए, हैमिल्टन सिरिंज धुंध में लिपटे और एक उच्च तापमान में रखा गया था/उच्च दबाव नसबंदी । ' ' ठोस के लिए नसबंदी ' ' की विधा का चयन किया गया और नसबंदी को "स्टार्ट" बटन दबाकर शुरू किया गया. - शुद्ध एडीनोवायरस समाधान की पूरी गल के बाद, ७५% इथेनॉल के साथ एडीनोवायरस समाधान युक्त ट्यूब स्प्रे, और एक लामिना प्रवाह बाँझ डाकू में एडीनोवायरस समाधान चाल ।
- एक लामिना प्रवाह बाँझ डाकू में, महाप्राण ५० µ एल एडीनोवायरस एक सुई के बिना हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर समाधान, हैमिल्टन सिरिंज के लिए एक 30 जी सुई की कुर्की के बाद.
- 30 जी सुई ऊपर की ओर से सिरिंज पकड़ो, और धीरे सुई एडीनोवायरस समाधान के साथ भरा है जब तक सिरिंज के गोताख़ोर धक्का (सुई टिप से पहली समाधान बूंदों की उपस्थिति से पुष्टि).
नोट: यह लगभग ४५ µ एल समाधान लेता है 30 जी सुई भरने के लिए, तो अब लगभग कोई समाधान सिरिंज में दिखाई दे रहा है. - एक और 30 µ l एडीनोवायरस समाधान महाप्राण सावधानी से ऊपर तैयार सिरिंज का प्रयोग करें, और बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर ढीला छाया सिरिंज जगह.
2. संज्ञाहरण और ऑपरेटिव तैयारी
- एक isoflurane vaporizer में 20 मिलीलीटर isoflurane जोड़ें, और एक ऑक्सीजन टैंक के लिए isoflurane vaporizer कनेक्ट ।
- वाल्व खोलने के लिए और ऑक्सीजन टैंक से ऑक्सीजन प्रवाह isoflurane vaporizer करने के लिए करते हैं । isoflurane vaporizer में एक ऑक्सीजन प्रवाह मॉनिटर के माध्यम से 2 L/मिनट पर ऑक्सीजन प्रवाह की दर बनाए रखें ।
- isoflurane vaporizer से जुड़े एक प्लास्टिक पिंजरे में 2 मिनट के लिए १००% ऑक्सीजन (2 एल/मिनट) में 4% isoflurane के साथ माउस के संज्ञाहरण प्रेरित ।
- प्लास्टिक पिंजरे से बाहर ले anesthetized माउस, और एक लामिना प्रवाह बाँझ डाकू में प्रवण स्थिति में एक प्लास्टिक मंच पर यह सुरक्षित है, और एक नाक शंकु के माध्यम से १००% ऑक्सीजन (2 एल/मिनट) में 2% isoflurane के साथ संज्ञाहरण को बनाए रखने ।
- पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया के अभाव द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
- प्रत्येक आंख के लिए बाँझ नेत्र क्रीम लागू करें सुखाने से कॉर्निया की रक्षा के लिए ।
- छाती और पेट के ऊपरी दाढ़ी । 1 मिनट के लिए मुंडा साइट के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोमनाशक क्रीम लागू करें. लोमनाशक क्रीम निकालें और गीले धुंध के साथ शेष फर ।
- सर्जिकल साइट (छाती के निचले हिस्से छोड़ दिया) आयोडीन-chlorhexidine आधारित एंटीसेप्टिक (जैसे entoiodine) की 3 सफ़ाई के साथ निष्फल । एक बाँझ कपड़ा के साथ सर्जिकल साइट को कवर ।
3. माउस हार्ट में एडीनोवायरस का Intramyocardial इंजेक्शन
- बंद दस्ताने ले लो और बाँझ दस्ताने की एक नई जोड़ी पर डाल दिया ।
- संदंश, एक माइक्रो मच्छर hemostat, सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी, और एक उच्च तापमान में आपरेशन से पहले दिन पर एक सुई धारक/उच्च दबाव नसबंदी (चरण १.४ नोट देखें).
- एक ०.५ सेमी त्वचा असिरूप और axilla को जोड़ने लाइन के साथ चीरा बनाओ । कुंद काटना कवच प्रमुख और कवच मामूली मांसपेशियों संदंश और एक सूक्ष्म मच्छर hemostat के साथ ।
- कवच प्रमुख और कवच छोटी मांसपेशियों को वापस लेने के द्वारा पसलियों के बीच रिक्त स्थान का पर्दाफाश । के माध्यम से पियर्स और चौथा पसलियों के बीच अंतरिक्ष (या अवलोकन द्वारा व्यापक पसलियों के बीच अंतरिक्ष) एक सूक्ष्म मच्छर hemostat के साथ खुला ।
- चीरा की ओर दिल पुश करने के लिए धीरे से छाती की दीवार के दाईं ओर दबाने से गैर प्रमुख हाथ की तर्जनी उंगली के साथ दिल externalize ।
- धीरे सूचकांक उंगली और गैर प्रमुख हाथ के अंगूठे के साथ बाहरी दिल सुरक्षित ।
- तीन साइटों में वाम निलय के मायोकार्डियम में 30 µ एल एडीनोवायरस समाधान की कुल सुई (ventral, पृष्ठीय, और बाईं निलय के पार्श्व दीवार) हैमिल्टन एडीनोवायरस के साथ भरा सिरिंज के माध्यम से (चित्रा 1C) प्रमुख हाथ के साथ.
- इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, तुरंत दिल intrathoracic अंतरिक्ष में वापस जगह है ।
- मैन्युअल रूप से त्वचा चीरा साइट की ओर छाती की दीवार दबाकर धीरे intrathoracic अंतरिक्ष में हवा खाली.
नोट: सफल हवा निकासी कवच प्रमुख और कवच मामूली निष्कासित हवा की वजह से मांसपेशियों के फड़फड़ा द्वारा सबूत हो सकता है । - एक 5-0 रेशम सीवन के साथ क्षैतिज गद्दे सीवन से त्वचा को बंद करें ।
नोट: कवच प्रमुख और कवच छोटे मांसपेशियों टांका नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे केवल कुंद विदारक है और उनके संरचनात्मक संरचनाओं आपरेशन भर में बरकरार हैं ।
4. पश्चात प्रबंधन
- प्रशासन buprenorphine (3 मिलीग्राम/दो बार के लिए उपचर्म इंजेक्शन के माध्यम से पहले ४८ के बाद ऑपरेटिव दर्द को कम करने के लिए ऑपरेशन11।
- ऑपरेशन के बाद, तुरंत एक गर्मी पैड पर चूहों (३७ डिग्री सेल्सियस) पूरी तरह से बरामद तक बनाए रखने. यह पूरी तरह से ठीक होने के बाद माउस पिंजरे में वापस रखें ।
- एक उच्च तापमान में इस्तेमाल किया हैमिल्टन सिरिंज और 30 जी सिरिंज सुई निष्फल/उच्च दबाव नसबंदी (चरण १.४ नोट देखें). एक sharps कंटेनर में निष्फल 30 जी सिरिंज सुई लीजिए.
5. कार्डिएक Luciferase अभिव्यक्ति को मापने के लिए Vivo इमेजिंग में
- 5 दिन पर एडीनोवायरस इंजेक्शन के बाद, luciferin के एक ताजा स्टॉक समाधान पर 15 मिलीग्राम/एमएल में Dulbecco की फास्फेट बफर खारा (DPBS) तैयार करते हैं । समाधान को एक ०.२ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
- इंट्रा-peritoneally १५० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन पर luciferin समाधान के साथ जाग चूहों इंजेक्षन ।
- इमेजिंग सिस्टम चालू करें ।
- इमेजिंग प्रणाली के स्वत: आत्म परीक्षण के बाद, "Luminescent," के रूप में इमेजिंग मोड का चयन करें और निम्न सेटिंग्स बनाने: एक्सपोजर: ऑटो; बिन्नी: 8; FStop: 1; उत्तेजना: ब्लॉक; उत्सर्जन: खुला ।
- luciferin इंजेक्शन के बाद 10 मिनट में, chloral हाइड्रेट इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize (३०० मिलीग्राम/ पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया के अभाव द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
- anesthetized चूहों प्रवण स्थिति में एक गर्म इमेजिंग चरण पर, सीने कैमरे की ओर निर्देशित के साथ सुरक्षित ।
- छवियों को इकट्ठा (प्रत्येक माउस के लिए 1 छवि) और छाती के आसपास ब्याज (रॉय) के समान परिपत्र माप क्षेत्रों ड्राइंग द्वारा संकेतों की तीव्रता मात्रा ।
- छवियों के संग्रह के बाद, चूहों बलिदान और ऊतकों को इकट्ठा के रूप में निंनलिखित अनुभाग में उल्लेख किया ।
6. ऊतकों की कटाई
- वायरस इंजेक्शन (चित्रा 1b) के बाद अलग समय बिंदुओं पर, 4% isoflurane के साथ चूहों anesthetize, और एक नाक शंकु के माध्यम से 2% isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने, और प्रवण स्थिति में एक प्लास्टिक के मंच पर यह सुरक्षित ।
- पूर्वकाल गर्दन में एक midline ventral चीरा बनाओ । omohyoid और sternocleidomastoid मांसपेशियों को वापस लेने के द्वारा सही आम मन्या धमनी का पर्दाफाश.
- सही आम मन्या धमनी transecting और खून की निकासी के द्वारा चूहों को कुर्बान ।
- पेट में एक midline ventral चीरा लगाएं । midclavicular लाइन के साथ रिब पिंजरे के दोनों किनारों से पसलियों में कटौती, और डायाफ्राम transect ।
- असिरूप को उठाने से दिल बेनकाब होता है । आरोही महाधमनी का पता लगाएं और धीरे perivascular वसा ऊतक निकालें ।
- Cannulate महाधमनी और प्रतिगामी perfuse 4 ° c फॉस्फेट बफर समाधान (पंजाब) के ०.५ मिलीलीटर से भरा एक 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक 30 जी सुई के साथ दिल की.
- छिड़काव के बाद, दिल के उत्पाद, और इसे छोड़ दिया और सही निलय में विभाजित । जिगर, फेफड़े, और तिल्ली उत्पाद ।
- ठंडे पंजाबियों (4 डिग्री सेल्सियस) में दो धुल के बाद, सभी एकत्र ऊतकों को अलग से क्रायोजेनिक शीशियों में तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें ।
7. प्रोटीन एक्सप्रेशन का निर्धारण
- 1:100 के अनुपात में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lysis बफर में चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल जोड़ने के द्वारा homogenization बफर तैयार करें । संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के आधार पर कुल वॉल्यूम की गणना करें. तैयार homogenization बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए रखें ।
- बाहर तरल नाइट्रोजन टैंक से ऊतकों ले लो । उच्च परिशुद्धता तराजू पर ऊतक वजन (ऊतक के प्रत्येक टुकड़े के लिए लगभग ६० मिलीग्राम).
- ऊतक एक नया १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण । तुरंत microcentrifuge ट्यूब में २०० µ एल homogenization बफर और १.५ मिमी इस्पात गेंदों (4 डिग्री सेल्सियस) ठंडा जोड़ें ।
- एक स्वचालित ऊतक पीसने की मशीन में (4 डिग्री सेल्सियस) में microcentrifuge ट्यूबों सुरक्षित धातु धारकों, और निंनलिखित सेटिंग्स के साथ मशीन शुरू करने से homogenization शुरू: आवृत्ति: ७० हर्ट्ज; समय: १२० s ।
- homogenization के बाद, homogenate (१६,००० × जी, 4 डिग्री सेल्सियस), और ध्यान से एक १०० µ एल पिपेट के साथ एक नया १.५ एमएल ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
- 1:4 के अनुपात में प्रोटीन supernatant के लिए लोड हो रहा बफर समाधान (5x) जोड़ें, और 5 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन स्वभाव ।
- हृदय और अन्य अंगों के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर आगे पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा निगरानी कर रहे हैं (प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2c और चित्रा 3में दिखाया गया है) पहले वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार12.
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Representative Results
प्रयोग प्रोटोकॉल और रिपोर्ट की गई विधि के लिए कुछ मुख्य चरण चित्र 1में दिखाए जाते हैं । एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase (अभिभाषक-ल्यूक) के intramyocardial इंजेक्शन के 5 दिन बाद, vivo इमेजिंग में-ल्यूक इंजेक्शन चूहों में विशेष रूप से दिल (चित्रा 2a, बी), जो था में luciferase के मजबूत एक्सप्रेस संकेत दिया पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 2c) द्वारा पुष्टि की, निशाना अंग transduction के अभाव का सुझाव दे । इसके विपरीत, नियंत्रण चूहों में कोई luciferase अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था । luciferase के सफल प्रएक्सप्रेस के अनुरूप, पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण काफी एडीनोवायरस एंकोडिंग VDR (अभिभाषक-VDR) (चित्रा 3) के साथ इंजेक्शन चूहों के बाईं निलय में VDR अभिव्यक्ति वृद्धि का सुझाव दिया । इसके अलावा, अभिभाषक-shVDR इंजेक्शन काफी बाईं निलय में VDR अभिव्यक्ति कम (चित्र बी) । इसके विपरीत, VDR अभिव्यक्ति काफी नहीं बदल गया था सही निलय में न तो अभिभाषक में VDR इंजेक्शन चूहों या अभिभाषक-shVDR इंजेक्शन चूहों (चित्रा 3सी, डी), क्योंकि एडीनोवायरस केवल बाईं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम में इंजेक्शन था.
चित्र 1 . माउस intramyocardial इंजेक्शन और जीन एक्सप्रेशन डिटेक्शन प्रोटोकॉल के लिए स्कीमा । (क) बाईं निलय के मायोकार्डियम में तीन इंजेक्शन साइटों को दिखा चित्रण. (ख) संकेत वायरस के इंजेक्शन के बाद माउस दिल में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल । अभिभाषक-luciferase: एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase; AdVDR: एडीनोवायरस एंकोडिंग VDR; AdshVDR, एडीनोवायरस एन्कोडिंग shRNA टार्गेटिंग VDR. (C) माउस intramyocardial इंजेक्शन के लिए संशोधित विधि के अनेक चरण दर्शाते हुए प्रतिनिधि छवियां । a. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोमनाशक क्रीम द्वारा फर से निकालना. ख. povidone-आयोडीन की 3 सफ़ाई के साथ शल्य स्थल की नसबंदी । c. एक बाँझ कपड़ा के साथ शल्य साइट को कवर. d. ०.५-असिरूप और axilla को जोड़ने वाली लाइन के साथ सेमी स्किन चीरा । संदंश और एक सूक्ष्म मच्छर hemostat के साथ कवच प्रमुख और कवच माइनर की मांसपेशियों के ई. कुंद विच्छेदन । दिल की च. Externalization. हैमिल्टन सिरिंज के माध्यम से बाईं निलय के मायोकार्डियम में 30 µ l एडीनोवायरस समाधान का छ. injection. ज - i. 5-0 रेशम सीवन के साथ एक बटुआ-स्ट्रिंग suturing द्वारा त्वचा के बंद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . दिल में luciferase अभिव्यक्ति का पता लगाने । (A) छवि नियंत्रण चूहों और चूहों में इंजेक्शन के बाद 5 दिनों पर एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase के साथ इंजेक्शन में दिल के luminescent संकेत दिखा इमेजिंग प्रणाली द्वारा एकत्र की । (ख) Luminescent संकेत विभिंन समूहों (n = 3) में तीव्रता टी परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण के अधीन हैं । * *p < 0.01 बनाम नियंत्रण चूहे । (ग) पश्चिमी दाग विश्लेषण एडीनोवायरस इंजेक्शन (n = 3) के बाद 5 दिनों में संकेत समूहों में दिल, फेफड़े, जिगर, और तिल्ली में luciferase प्रोटीन का स्तर दिखा परिणाम । चूंकि luciferase अभिव्यक्ति केवल अभिभाषक के दिल में पता चला था-ल्यूक इंजेक्शन चूहों, सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन नहीं किया गया था. अभिभाषक-ल्यूक: एडीनोवायरस एन्कोडिंग luciferase. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . दिल में VDR अभिव्यक्ति का पता लगाना. (A) शीर्ष पैनल: पश्चिमी दाग वाम निलय में VDR स्तर दिखा बैंड (जहां एडीनोवायरस इंजेक्शन है) 0 दिन, 5 दिन, 7 दिन, और 14 दिनों के बाद अभिभाषक-VDR इंजेक्शन । नीचे पैनल: अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण VDR अभिव्यक्ति के स्तर के विभिंन समूहों में (n = 4 प्रति समय बिंदु) । परिणाम GAPDH के खिलाफ सामान्यीकृत थे और 0 दिन के सापेक्ष परिवर्तन गुना करने के लिए परिवर्तित । Bonferroni पद-परीक्षण (समान प्रसरण मान लिया गया) के बाद प्रसरण (ANOVA) का एक-तरफा विश्लेषण या ताम्हाणे के बाद परीक्षण (समान प्रसरण नहीं मान लिया गया) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था । *p < 0.05 या * *p < 0.01 बनाम 0 दिन । (B) शीर्ष पैनल: पश्चिमी दाग बैंड छोड़ निलय में 0 दिन, 3 दिन, 5 दिन, और 7 दिनों के बाद अभिभाषक-shVDR इंजेक्शन में VDR स्तर दिखा । नीचे पैनल: अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण VDR अभिव्यक्ति के स्तर के विभिंन समूहों में (n = 4 प्रति समय बिंदु) । *p < 0.05 बनाम 0 दिन । (ग) शीर्ष पैनल: पश्चिमी दाग बैंड सही निलय में VDR स्तर दिखा (जहां एडीनोवायरस इंजेक्शन नहीं है) 0 दिन, 5 दिन, 7 दिन, और 14 दिनों के बाद अभिभाषक-VDR इंजेक्शन । नीचे पैनल: अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण VDR अभिव्यक्ति के स्तर के विभिंन समूहों में (n = 4 प्रति समय बिंदु) । (D) शीर्ष पैनल: पश्चिमी दाग बैंड सही निलय में 0 दिन, 3 दिन, 5 दिन, और 7 दिनों के बाद अभिभाषक-shVDR इंजेक्शन में VDR स्तर दिखा । नीचे पैनल: अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण VDR अभिव्यक्ति के स्तर के विभिंन समूहों में (n = 4 प्रति समय बिंदु) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
वर्तमान रिपोर्ट हृदय जीन हेरफेर के लिए वायरल वैक्टर के intramyocardial इंजेक्शन के लिए एक संशोधित तकनीक को दर्शाता है, जो एक विधि से गाओ एट अल द्वारा रोधगलन प्रेरण के लिए संशोधित किया गया था । 13 वर्तमान में, विशिष्ट जीन कार्यों के vivo लक्षण वर्णन में सबसे अधिक बार पीटा या ट्रांसजेनिक चूहों3,14,15,16,17 की पीढ़ी शामिल , जो महंगा है, समय लेने वाली है, और श्रम गहन । वैकल्पिक रूप से, प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन द्वारा जीन वैक्टर या सिरना की डिलिवरी भी व्यापक रूप से हृदय अनुसंधान4में जीन हेरफेर के लिए अभ्यास किया है,5,7। विशेष रूप से, intramyocardial इंजेक्शन कार्डियक जीन हेरफेर के लिए कुछ परिस्थितियों के तहत प्रतिस्थापित किया जा सकता: जब साइट निर्देशित इंजेक्शन (उदा., रोधगलन मॉडल में सीमा क्षेत्र इंजेक्शन) की आवश्यकता है11; जब अवधि-प्रतिबंधित जीन हेरफेर की आवश्यकता है (उदा., एडीनोवायरस इंजेक्शन) । यहां, हमने दिखाया है कि संशोधित intramyocardial इंजेक्शन विधि सरल, समय की बचत है, और अत्यधिक कुशल है ।
प्रोटोकॉल और समस्या निवारण के भीतर महत्वपूर्ण चरण:
इस प्रोटोकॉल के सफल संचालन के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम ध्यान दिया जाना चाहिए । aspirating वायरस से पहले, हैमिल्टन सिरिंज और संलग्न सुई के भीतर हवा खाली किया जाना चाहिए, अन्यथा मायोकार्डियम में इंजेक्शन हवा सामयिक कार्डियक चोट या यहां तक कि मौत का कारण हो सकता है. आगे इस मुद्दे से बचने के लिए, के लिए तैयार उपयोग हैमिल्टन एक पर्याप्त वायरस की मात्रा से भरा सिरिंज गोताख़ोर अंत नीचे के साथ नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह सहज महाप्राण धातु गोताख़ोर के गुरुत्वाकर्षण द्वारा हवा हो सकता है. संज्ञाहरण सावधानी से निगरानी की जानी चाहिए, के रूप में गहरी संज्ञाहरण के बाद आपरेशन वसूली में देरी हो सकती है, और गंभीर रूप से गहरी संज्ञाहरण मौत का कारण हो सकता पर्याप्त संज्ञाहरण के बाद, दिल से बाहर नहीं किया जाना चाहिए छाती गुहा के बल से, क्योंकि यह गंभीर फेफड़ों की चोट में परिणाम हो सकता है । वास्तव में, उचित दिल externalization केवल दिल की एक कोमल धक्का की आवश्यकता है, और किसी भी प्रतिरोध अनुचित दिशा की ओर धकेलने का संकेत हो सकता है ।
तकनीक की सीमाएं:
इस तकनीक में इंटुबैषेण के उंमूलन, जो प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय कम कर देता है, पता चलता है कि intramyocardial इंजेक्शन प्रक्रिया एक अपेक्षाकृत सीमित समय के भीतर समाप्त किया जाना चाहिए मौत से बचने के लिए खिड़की । हमारे अनुभव के अनुसार, दिल को 30 से अधिक एस के लिए बाहरी नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह मृत्यु दर को बढ़ाता है और पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी को धीमा कर देता है । इसलिए, इंटुबैषेण का उपयोग यहां वर्णित प्रोटोकॉल के पहले प्रयास के लिए सिफारिश की है । एक और सीमा वायरल इस पद्धति है, जो भी intramyocardial इंजेक्शन7के पारंपरिक तरीकों में मौजूद है द्वारा दिया वैक्टर के असमान वितरण है । इसके अलावा, यहां वर्णित विधि में कार्डियक-विशिष्ट जीन हेरफेर के लिए अधिक उपयोगी है, जो विभिन्न हृदय रोग मॉडल की स्थापना के बाद किया जा सकताहै18,19,20, घायल दिलों में, 21,22,23. हालांकि, infarcted दिल जैसे घायल दिलों को एजेंटों पहुंचाने में मौजूदा पद्धति का उपयोग सीमित हो सकता है, क्योंकि इन चूहों प्रक्रिया को बर्दाश्त नहीं कर सकता ।
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:
पारंपरिक intramyocardial इंजेक्शन इंटुबैषेण और यांत्रिक वेंटिलेशन24की आवश्यकता है, और यह मुश्किल तेजी से माउस की धड़कन के कारण इंजेक्शन साइट का पता लगाने के लिए बनाता है । इन मुद्दों में काफी कार्रवाई समय13, इस प्रकार समय देरी से उत्पंन परिवर्तनों को बढ़ाना । संशोधित तकनीक यहाँ प्रस्तुत जल्दी है और मैन्युअल रूप से बाहरी दिल हासिल करके सटीक इंजेक्शन साइट स्थान की अनुमति देता है; कुल मिलाकर, काफी potentiating बाद अध्ययन । इसके अलावा, इंटुबैषेण और यांत्रिक वेंटिलेशन के उंमूलन के लगभग किसी भी प्रयोगशाला के लिए सुलभ संशोधित विधि बनाते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान कोष के प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (८१६२५००२), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१४७०३८९, ८१२७०२८२, ८१६०१२३८), शंघाई अकादमिक अनुसंधान नेता (18XD1402400), शंघाई नगर निगम के कार्यक्रम के लिए समर्थन किया गया शिक्षा आयोग Gaofeng क्लिनिकल मेडिसिन ग्रांट सहायता (२०१५२२०९), शंघाई Shenkang हॉस्पिटल डेवलपमेंट सेंटर (16CR3034A), शंघाई Jiao टोंग यूनिवर्सिटी (YG2013MS42), शंघाई Jiao टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (15ZH1003 और 14XJ10019), शंघाई नौकायन कार्यक्रम (18YF1413000), और Bengbu मेडिकल कॉलेज (Byycx1722) के स्नातकोत्तर नवाचार कार्यक्रम । हम अपनी प्रयोगशाला में अपनी पिछली मदद के लिए Dr. Erhe गाओ धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
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