Summary
Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.
Abstract
Gene manipülasyon özellikle kalbinde önemli ölçüde soruşturma kalp hastalığı pathomechanisms ve tedavi potansiyellerini artırmak. Vivo kalp özel gen teslim sık sistemik veya yerel teslim tarafından elde edilir. Kuyruk ven yoluyla sistemik enjeksiyon kolay ve verimli kardiyak gen ekspresyonu rekombinant adeno ilişkili virüs 9 (AAV9) kullanarak işleme. Ancak, bu yöntem için verimli iletim vektör nispeten yüksek miktarda gerektirir ve nontarget organ gen iletim neden olabilir. Burada, intramyocardial enjeksiyon vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde için bir basit, etkili ve zaman kazandıran yöntemi açıklanmaktadır. Anestezi (havalandırma) olmadan altında göğüs birincil ve ikincil kasları açık açık disseke ve fare kalp hızlı bir şekilde dördüncü interkostal alan küçük bir kesi yoluyla el ile dışa tarafından maruz kalmış. Daha sonra luciferase (Luc) ve vitamin D reseptör (VDR) veya VDR, hedefleme kısa saç tokası RNA (shRNA) kodlama adenovirus Hamilton şırınga Miyokardiyum enjekte ettiler. Sonraki vivo içinde görüntüleme bu luciferase özellikle kalbinden başarılı bir şekilde overexpressed gösterdi. Ayrıca, Western blot analizi başarılı overexpression veya fare kalbinde VDR susturmak doğruladı. Kez hakim, bu teknik gen manipülasyon yanı sıra enjeksiyon hücreleri veya fare kalbinde nanogels gibi diğer malzemeler için kullanılabilir.
Introduction
Kalp hastalığı morbidite ve mortalite dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Miyokard İnfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi ölümcül kalp sorunları için etkili tedavi stratejileri eksikliği temel pathomechanisms yoğun keşfi ve kimliği roman tedavi olanakları3çekiyor. Bu bilimsel keşifler için yaygın olarak kullanılan4,5kalp özel gen manipülasyon olduğunu. Kardiyak gen manipülasyon güçlü transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz (TALEN) kullanarak genom düzenleyerek elde edilebilir ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş / CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) araçları, ya da Ektopik genetik malzemelerin (örneğin, virüs vektörel çizimler proteinler ilgi kodlama genleri taşıyan) teslim edilmesi6. Genom düzenleme kesin ve kronolojik zamanmekansal genom değişiklikler yaşayan fareler sağlar rağmen hala bir zaman alıcı ve emek yoğun pratik6olduğunu. Alternatif olarak,6kalp özel gen manipülasyon virüs vektör veya küçük müdahale RNA (siRNA) karmaşık teslim rutin tarafından gerçekleştirilen.
Virüs vektör teslim yetişkin fare kalp için kabaca iki stratejileri ile elde edilir: sistemik veya yerel enjeksiyon. AAVs AAV9 gibi cardiotropic serotip sistemik enjeksiyon noninvaziv kardiyak belirli bir gen manipülasyon7için. Ancak, bu yöntem vektör verimli iletim ve gen ekspresyonu için gerekli nispeten yüksek miktarda gerektirir ve kas ve karaciğer7gibi nontarget organların önemli iletim neden olabilir. Yerel virüs enjeksiyon intramyocardial enjeksiyon veya intrakoroner teslim7tarafından sağlanır. İntrakoroner teslim virüs intramyocardial enjeksiyon için karşılaştırıldığında kalp içinde daha eşit dağılımı yol açar. Ancak, bu teknik dezavantajları sistemik dolaşım ve iletim nontarget organları8ve onun gereksinimi için basınç ölçüm işlemi sırasında aygıt için viral vektörler dışarı hızlı yıkama vardır. Buna karşılık, viral olarak dağıtabilmenizi daha iyi virüs saklama Miyokardiyum yanı sıra site belirli teslim, ama başarısız intramyocardial enjeksiyon sağlar7vektör. Küçük hayvanlar için intrakoroner teslimat sistemik AAV9 enjeksiyon ve intramyocardial enjeksiyon daha yaygın olarak uygulanan4,5,7iken yapmak teknik olarak zor olur. Sistemik enjeksiyon gerçekleştirmek kolay olsa da, geleneksel intramyocardial enjeksiyon mekanik havalandırma ve Torakotomi gerektiren, geniş doku hasarına neden olur ve zaman alır.
Bu raporda, intramyocardial enjeksiyon için bir kolay, zaman tasarrufu ve yüksek verimli yöntemi açıklanmıştır. Luciferase ve VDR veya VDR, hedefleme shRNA kodlama adenovirus kardiyak gen ekspresyonu işlemek için enjekte ettiler. Hakim sonra gene manipülasyon, aynı zamanda hücreleri ve fare kalp diğer maddeleri enjeksiyonu için bu yöntem kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık kurallarına Enstitüleri kullanım laboratuvar hayvanları üzerinde göre yapılmıştır ve Enstitü nün hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Erkek C57BL/6J fareler (8-10 hafta yaşındaki) tüm deneyler için kullanılmıştır. Fareler 24 ° C ± 4 ° C, bir 12-h ışık/karanlık döngü, su ve gıda ücretsiz erişim altında patojen-Alerjik koşullarda muhafaza.
1. Adenovirus çözüm hazırlanması
- Arıtılmış adenovirus çözüm gelişinden sonra çözüm-80 ° C dondurucuda saklayın.
Not: Adenovirus enjeksiyon uygulanabilir farelerde gerçekleştirildi. Adenovirus vektör kısırlık emin olmak için adenovirus (kodlama luciferase, VDR veya VDR hedefleme shRNA) hazırlanmıştır ve ticari olarak9,10saf. - İşlem gününde,-80 ° C dondurucudan arıtılmış adenovirus çözüm (3 x 1010 plak oluşturan birimler [pfu] /mL) almak ve adenovirus vektör çözüm buz çözme.
- Bir sağlamlılık, steril eldiven ve steril elbise giy.
- 50 µL hazırlamak gün operasyon öncesi sterilize Hamilton şırınga.
Not: sterilizasyon için Hamilton şırınga gazlı bez içinde sarılmış ve bir yüksek sıcaklık/yüksek basınç sterilizasyon yerleştirilir. "Sterilizasyon masif" modu seçildi ve sterilizasyon "Başlat" düğmesine basarak başladı. - Tam saf adenovirus çözümü çözdürme sonra % 75 etanol ile adenovirus solüsyon içeren tüp sprey ve adenovirus çözüm laminar akış steril kukuIeta taşıyın.
- Laminar akış steril başlık, Hamilton şırınga 30 G iğne eki tarafından takip bir iğne olmadan Hamilton şırınga kullanarak 50 µL adenovirus çözüm Aspire edin.
- Şırınga 30 G iğne ile yukarı doğru tutun ve iğne (iğne ucu ilk çözüm Damlalar görünümünü tarafından teyit) adenovirus Çözümle doldurulana kadar şırınga pistonu yavaşça itin.
Not: Bu 30 G iğne doldurmak için yaklaşık 45 µL çözüm alır hemen hemen hiçbir çözüm şırıngada görünür şimdi. - Dikkatli bir şekilde başka bir 30 µL adenovirus çözüm Aspire için yukarıdaki hazır şırınga kullanın ve sonraki kullanım için buz üzerinde gevşek kepli şırınga yerleştirin.
2. anestezi ve ameliyat hazırlığı
- 20 mL isoflurane isoflurane Buharlaştırıcı ekleyin ve bir oksijen tankı isoflurane Buharlaştırıcı bağlanın.
- Vana açacağız ve oksijen isoflurane Buharlaştırıcı oksijen tankı akış. Oksijen akış hızı 2 L/dk bir oksijen akışını monitörde isoflurane Buharlaştırıcı üzerinden korumak.
- Fare ile % 4 isoflurane % 100 oksijen (2 L/dak) anestezi isoflurane Buharlaştırıcı bağlı bir plastik kafes 2 min için ikna etmek.
- Plastik kafes imzalat fareden çıkar ve yüzükoyun bir laminar akış steril başlıklı plastik bir platform üzerinde güvenli ve anestezi % 2 isoflurane % 100 oksijen (2 L/dak) ile bir burun konisi korumak.
- Yeterli anestezi ayak çimdik yanıt yokluğunda tarafından onaylayın.
- Steril oftalmik krem kurumasını kornealar korumak için her göz için geçerlidir.
- Göğüs ve üst karın tıraş. 1 dk. kaldırmak için depilatory krem piyasada bulunan depilatory krem traş siteye uygulamak ve kürk ile ıslak gauzes kalan.
- Cerrahi sitesi (sol alt kısmında göğüs) iyot-klorheksidin dayalı antiseptik (örneğin entoiodine) 3 scrubs ile sterilize. Steril örtü ile cerrahi sitesi kapak.
3. Intramyocardial enjeksiyon Adenovirus fare kalbinde
- Eldivenleri çıkarma ve steril eldiven yenisini koymak.
- Sterilize forseps, bir mikro-sivrisinek hemostat, Cerrahi makas ve bir gün yüksek bir operasyonda önce iğne bağı sıcaklık/yüksek basınç Sterilizatör (Adım 1.4 nota bakın).
- 0,5 cm cilt kesi xiphoid ve koltuk altı bağlanma hattı boyunca olun. Açık açık göğüs büyük ve küçük göğüs kasları forseps ve bir mikro-sivrisinek hemostat ile incelemek.
- İnterkostal alanlarda ortaya çıkarmak büyük göğüs ve göğüs küçük kasları geri çeker. Aracılığıyla işlemek ve dördüncü interkostal boşluk (veya geniş interkostal boşluk gözlem ile) bir mikro-sivrisinek hemostat ile açın.
- Kalp kalp sigara dominant el parmağı ile hafifçe göğüs duvarında sağ tarafına basarak yansıtmak için belgili tanımlık kesme doğru itin.
- Yavaşça externalized kalp sigara dominant el başparmak ve işaret parmağı ile güvenli.
- Toplam 30 µL adenovirus çözeltinin dominant el ile üç siteleri (ventral, dorsal ve lateral duvarına sol ventrikül) adenovirus (şekil 1 c) ile dolu Hamilton şırınga üzerinden sol ventrikül Miyokardiyum içine enjekte et.
- Enjeksiyon tamamlanmasından sonra hemen geri İntratorasik uzaya kalp yerleştirin.
- El ile göğüs duvarı cilt kesi site doğru yavaşça basarak İntratorasik uzayda hava tahliye edin.
Not: Başarılı hava tahliye büyük göğüs ve göğüs küçük kasları tarafından sınırdışı hava neden çırparak tarafından kanıtlanan. - Deri yatay Dikiş dikiş 5-0 ipek sütür ile yakın.
Not: Büyük göğüs ve göğüs küçük kasları, onlar sadece açık açık disseke ve onların anatomik yapıları işlemi arada olmadığından sütüre değil.
4. ameliyat sonrası yönetim
- Buprenorfin (3 mg/kg) iki kez günlük işlem11' den sonra ilk 48 saat için operatif ağrı azaltmak için subkutan enjeksiyon yoluyla yönetmek.
- İşlemden sonra hemen tamamen iyileşti kadar fareler bir ısı yastık (37 ° C) üzerinde korumak. Tamamen kurtarır sonra fareyi kafese geri getirin.
- Sterilize kullanılan Hamilton şırınga ve bir yüksek sıcaklık/yüksek basınç sterilizasyon içinde 30 G şırınga iğne (Adım 1.4 nota bakın). Sterilize 30 G şırınga iğne "Sharps" kap içinde toplamak.
5. kardiyak Luciferase ifade ölçmek için in Vivo görüntüleme
- Gün 5 adenovirus enjeksiyon sonra biyoluminesans 15 mg/mL Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS), taze stok çözeltisi hazırlamak. Çözüm 0.2 µm filtreden filtre.
- İntra peritoneally uyanık fareler biyoluminesans eriyik vasıl 150 mg/kg vücut ağırlığı ile enjekte.
- Görüntüleme sistemi açın.
- Otomatik görüntüleme sistemi kendi kendini sınama sonra "Işıklı" olarak görüntüleme modunu seçin ve aşağıdaki ayarları yapın: pozlama: otomatik; Binning: 8; FStop: 1; Uyarma: Blok; Emisyon: açık.
- Biyoluminesans enjeksiyon sonra 10 dk, fareler kloral hidrat enjeksiyon (300 mg/kg vücut ağırlığı) anestezi. Yeterli anestezi ayak çimdik yanıt yokluğunda tarafından onaylayın.
- İmzalat fareler bir ısıtmalı görüntüleme sahnede kamera doğru yönetmen göğüs ile yüzükoyun sígara güvenli.
- Görüntüleri (her fare için 1 resim) toplamak ve göğüs aynı dairesel ölçüm bölgeleri (ROI) ilgi çizerek sinyalleri yoğunluğunu ölçmek.
- Fotoğraf topluluğu sonra farelerin kurban ve aşağıdaki bölümünde belirtildiği gibi dokularda toplamak.
6. hasat dokular
- Noktalarda farklı zaman virüs enjeksiyon (şekil 1B) sonra fare ile % 4 isoflurane, anestezi ve anestezi ile % 2 isoflurane burun konisi üzerinden korumak ve yüzükoyun plastik bir platform üzerinde güvenli.
- Ventral Ensizyon ön boyun olun. Şu ortak Karotid arter omohyoid ve boyun kasları geri çeker tarafından maruz.
- Fareler şu ortak Karotid arter transecting ve kan boşaltılmasına kurban.
- Ventral Ensizyon karın içinde olun. Göğüs kafesi midclavicular hattı boyunca her iki kaburga kesme ve diyafram transect.
- Kalp xiphoid kaldırarak maruz. Artan aort bulmak ve Perivasküler yağ dokusu yavaşça çıkarın.
- Aort cannulate ve retrogradely 0.5 mL 4 ° C fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile dolu bir 1 mL şırınga bağlı 30 G iğne ile kalp sıvı.
- Perfüzyon sonra kalp tüketim ve sol ve sağ ventrikül bölmek. Karaciğer, akciğer ve dalak tüketim.
- Soğuk PBS (4 ° C) olarak iki yıkamadan sonra toplanan dokulara sıvı azot kriyojenik şişeleri ayrı ayrı saklayın.
7. Protein ifade tespiti
- Homojenizasyon arabellek piyasada bulunan lizis arabellek 1: 100 oranında içine proteaz inhibitörü kokteyl ekleyerek hazırlayın. İşlenecek örnekleri sayısına göre Toplam hacim hesaplamak. Hazırlanan homojenizasyon arabellek sonraki kullanım için 4 ° C'de tutun.
- Sıvı azot tankı dokulardan dışarı çıkar. Yüksek hassasiyetli ölçeklerde (yaklaşık 60 mg doku her parça için) doku tartın.
- Doku için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Hemen 200 µL homojenizasyon tampon ve precooled 1.5 mm çelik bilyalar (4 ° C) microcentrifuge tüp içine ekleyin.
- Precooled (4 ° C) microcentrifuge tüplerde otomatik bir doku Bileme Makinası metal sahipleri güvenli ve aşağıdaki ayarlarla makine başlatarak homojenizasyon başlamak: frekans: 70 Hz; süre: 120 s.
- Homojenizasyon sonra homogenate (16.000 × g, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant yeni 1.5 mL tüp 100 µL pipet ile aktarın.
- Yükleme eklemek tampon çözüm (5 x) süpernatant protein oranı 1:4 ve 5 min için 100 ° C'de protein denatüre.
- Kalp ve diğer organ dokulara protein ifade seviyelerinde daha da Western blot analizi (-den sonuçlanmak göstermek şekil 2C ve şekil 3temsilcisi) tarafından izlenen protokole göre daha önce12açıklanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney Protokolü ve bazı önemli adımlar bildirilen yöntemi için şekil 1' de gösterilmiştir. İntramyocardial enjeksiyon adenovirus kodlama luciferase (Adv-luc) sonra 5 gün, adv-luc enjekte farelerde Imaging vivo içinde kalbinde olan özellikle (şekil 2A, B), luciferase sağlam overexpression belirtti. nontarget organ iletim yokluğu düşündüren Western blot analizi ile (şekil 2C), doğruladı. Buna karşılık, herhangi bir luciferase ifade denetim farelerde algılandı. Luciferase başarılı overexpression ile tutarlı, Western blot analizi önerilen önemli ölçüde artış VDR ifadede sol ventrikül farelerin VDR (adv-VDR) (şekil 3A) kodlama adenovirus ile enjekte. Ayrıca, adv-shVDR enjeksiyon sol ventrikül (şekil 3B) ifadesinde VDR azaltılacağını. Adenovirus sadece sol ventrikül Miyokardiyum enjekte edildi çünkü aksine, VDR ifade önemli ölçüde ne adv-VDR enjekte fareler veya adv-shVDR enjekte fareler (şekil 3 c, D), sağ ventrikül içinde değiştirilmedi.
Resim 1 . Şema için fare intramyocardial enjeksiyon ve gen ifade Algılama Protokolü. (A)sol ventrikül Miyokardiyum içinde üç enjeksiyon siteleri gösteren çizim. (B) protokolü enjeksiyon belirtilen virüslerin sonra fare kalbinde gen ifade algılama için. Adv-luciferase: adenovirus luciferase kodlama; AdVDR: Adenovirus VDR kodlama; AdshVDR, adenovirus kodlama shRNA VDR hedefleme. (C) temsilcisi görüntüler fare intramyocardial enjeksiyon için değiştirilmiş yönteminin birden çok adımı gösterilen. a. kürk piyasada bulunan depilatory krem tarafından kaldırılması. b. sterilizasyon povidone-iyot 3 scrubs ile cerrahi sitesi. c. steril örtü ile cerrahi sitesi kapsayan. ö. 0,5 cm cilt kesi xiphoid ve koltuk altı bağlanma hattı boyunca. e. büyük göğüs ve göğüs küçük kasları forseps ve bir mikro-sivrisinek hemostat ile diseksiyon künt. f. dışa kalp. Hamilton şırınga ile sol ventrikül Miyokardiyum içine g. enjeksiyon 30 µL adenovirus çözüm. h - bir çanta-dize ile 5-0 ipek Dikiş dikiş tarafından cilt ı. kapanış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . 'Kalbinde luciferase ifade tespiti. (A)görüntüleri kontrol fareler ve fareler adenovirus luciferase 5 gün sonra enjeksiyon kodlama ile enjekte kalp ışıklı sinyal gösterilen görüntüleme sistemi tarafından toplanan. (B) ışıklı sinyal yoğunluklarda farklı gruplar (n = 3) t testi ile istatistiksel analize tabi. p < 0,01 karşı kontrol fareler. (C) Western blot analizi luciferase'kalbinde protein düzeyleri gösterilen sonuçları, akciğer, karaciğer ve dalak, 5 gün sonra adenovirus enjeksiyon grupları gösterilir (n = 3). Bu yana luciferase ifade sadece Adv-luc enjekte fareler kalbinde algılandı, istatistiksel Çözümleme gerçekleştirilmedi. Adv-luc: adenovirus luciferase kodlama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Kalp VDR ifade tespiti. (A)üst panel: Western blot 0 gün, 5 gün, 7 gün ve 14 gün sonra adv-VDR enjeksiyon gösteren VDR (nerede adenovirus enjekte edilir) sol ventrikül seviyelerinde bantları. Alt paneli: VDR ifade düzeyi farklı gruplar halinde yarı kantitatif analiz (n = 4 her zaman noktası). Sonuçları GAPDH karşı normalleştirilmiş ve 0 gün değişim göreli kat dönüştürülür. Tek yönlü Bonferroni sonrası test (eşit Varyanslar kabul) tarafından takip Varyans analizi (ANOVA) veya Tamhane sonrası test (eşit Varyanslar değil kabul) istatistiksel analiz için gerçekleştirildi. p < 0,05 veya **p < 0,01 0 gün karşı. (B) üst panel: Western blot sol ventrikül gösteren VDR düzeyleri 0 gün, 3 gün, 5 gün ve 7 gün sonra adv-shVDR enjeksiyon bantları. Alt paneli: VDR ifade düzeyi farklı gruplar halinde yarı kantitatif analiz (n = 4 her zaman noktası). p < 0.05 0 gün karşı. (C) üst panel: Western blot 0 gün, 5 gün, 7 gün ve 14 gün sonra adv-VDR enjeksiyon gösteren VDR (nerede adenovirus değil enjekte edilir) sağ ventrikül seviyelerinde bantları. Alt paneli: VDR ifade düzeyi farklı gruplar halinde yarı kantitatif analiz (n = 4 her zaman noktası). (D) üst panel: Western blot sağ ventrikül gösteren VDR düzeyleri 0 gün, 3 gün, 5 gün ve 7 gün sonra adv-shVDR enjeksiyon bantları. Alt paneli: VDR ifade düzeyi farklı gruplar halinde yarı kantitatif analiz (n = 4 her zaman noktası). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçerli raporu miyokard infarktüsü indüksiyon bir yönteminden Gao vd tarafından güncellenmiştir kardiyak gen manipülasyon için viral vektörler intramyocardial enjeksiyon için değiştirilmiş bir teknik gösterir 13 şu anda, karakterizasyonu vivo içinde belirli bir gen fonksiyonları en sık dahil nakavt veya transgenik fareler3,14,15,16,17 nesil , pahalı, zaman alıcı ve emek yoğun. Alternatif olarak, gen vektörel çizimler veya sistemik veya yerel enjeksiyonla siRNA teslimini gen manipülasyon kardiyovasküler araştırma4,5,7için de yaygın olarak uygulanmaktadır. Özellikle, intramyocardial enjeksiyon belirli koşullar altında kalp gen manipülasyon için yerine değil: ne zaman site yönlendirilir enjeksiyon gerekli (örneğin, sınır bölgesi enjeksiyon miyokard infarktüsü modelindeki)11; Ne zaman süresi sınırlanmış gen manipülasyon gerekli (örneğin, adenovirus enjeksiyon) olduğunu. Burada, değiştirilmiş intramyocardial enjeksiyon yöntemi basit, zaman tasarrufu ve yüksek verimli olduğunu gösterdi.
Protokol içindeki kritik adımlar ve sorun giderme:
Bu protokolü başarılı çalışması için birkaç önemli adımlar olması gerekmektedir. Aksi takdirde alıyorum virüs, Hamilton şırınga ve ekli iğne içinde hava tahliye gerekir önce Miyokardiyum enjekte hava topikal kalp zedelenmesini veya hatta ölüme neden olabilir. Bu kendiliğinden metal pistonu yerçekimi tarafından hava Aspire çünkü daha da bu sorunu önlemek için yeterli virüs birimlere ile dolu kullanıma hazır Hamilton şırınga dalgıç ucu aşağıya doğru yer. Anestezi dikkatle, derin anestezi sonrası işlemi kurtarma gecikme olabilir ve ciddi bir şekilde derin anestezi ölüme neden takip edilmelidir. Bu şiddetli akciğer yaralanmalara neden olabilir beri yeterli anestezi sonra kalp göğüs boşluğu dışında kuvvet, externalized değil. Gerçekten de, sadece hafif bir itme kalp uygun kalp dışa gerektirir ve yanlış yöne doğru iterek herhangi bir direnç gösterebilir.
Teknik sınırlamaları:
Entübasyon yordamı için gereken süreyi azaltır, Bu teknikte ortadan kaldırılması intramyocardial enjeksiyon yordamı ölümü önlemek için göreceli olarak sınırlı zaman penceresi içinde bitmiş olmalıdır öneriyor. Bizim deneyim göre kalp için daha--dan 30 externalized değil s, çünkü bu ölüm oranı artar ve ameliyat sonrası kurtarma yavaşlatır. Bu nedenle, burada açıklanan protokolü ilk denemeleri için entübasyon kullanılması tavsiye edilir. Viral vektörler de intramyocardial enjeksiyon7geleneksel yöntemlerle var bu yöntem tarafından teslim düzensiz dağılımı başka bir kısıtlamadır. Ayrıca, burada açıklanan yöntemi daha farklı kalp hastalığı modelleri18,19,20kuruluşu tarafından takip edilebilir yaralı Kalpler, kalp özel gen manipülasyon için yararlıdır, 21,22,23. Ancak, bu fareler yordamı tahammül değil çünkü hazır kalpler gibi yaralı kalpler için aracıları teslim geçerli yöntem kullanımı sınırlı, olabilir.
Önemi ile ilgili mevcut yöntemler:
Geleneksel intramyocardial enjeksiyon entübasyon ve mekanik havalandırma24gerektirir ve hızlı fare kalp atışı nedeniyle enjeksiyon yeri bulmaya zorlaştırır. Bu sorunları önemli ölçüde işlem saat13böylece gecikme süresini tarafından yöneltilen varyasyonları artan, uzatmak. Burada sunulan değiştirilmiş tekniği hızlı ve hassas enjeksiyon sitesi konumu el ile externalized kalp güvence tarafından sağlar; Genel olarak, önemli ölçüde sonraki çalışma potentiating. Ayrıca, entübasyon ve mekanik havalandırma kaldırılması yapmak değiştirilmiş yöntemi hemen hemen her laboratuvar için erişilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal Bilim Fonu tarafından desteklenen ayırt edici genç akademisyenler (81625002), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81470389, 81270282, 81601238), Program Shanghai akademik araştırma, lider (18XD1402400), Şangay belediye için Eğitim Komisyonu Gaofeng klinik tıp hibe desteği (20152209), Shanghai Shenkang hastane Geliştirme Merkezi (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp (15ZH1003 ve 14XJ10019), Shanghai yelken programı (18YF1413000) ve Bengbu Tıp Fakültesi (Byycx1722) yüksek lisans yenilik programı. Dr. Erhe Gao bizim laboratuarımızda onun önceki yardım için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
