Summary
Här presenterar vi ett protokoll för manipulering av hjärt-specifika genen i möss. Under anestesi, var mus hjärtan externalized via den fjärde interkostalrummet. Därefter blot adenoviruses kodning specifika gener skulle injiceras med en spruta i myokardiet, följt av protein uttryck mätning via i vivo imaging och Western analys.
Abstract
Gen manipulation specifikt i hjärtat potentiera betydligt utredning av hjärtsjukdom patomekanism och deras terapeutiska potential. In vivo hjärt-specifik gen leverans uppnås vanligen genom antingen systemiska eller lokala leverans. Systemisk injektion via svans ven är enkel och effektiv i att manipulera hjärt genuttryck med hjälp av rekombinant adeno-associerade virus 9 (AAV9). Men denna metod kräver en relativt hög mängd vektor för effektiv transduktion och kan resultera i ickemålorganismer orgel gen transduktion. Här beskriver vi en enkel, effektiv och tidsbesparande metod för intramyocardial injektion av i vivo hjärt-specifik gen manipulation hos möss. Under anestesi (utan ventilation), större och mindre bröstmusklerna var rakt på sak dissekeras och mus hjärtat utsattes snabbt av manuell externalisering genom ett litet snitt på den fjärde interkostalrummet. Därefter, injicerades adenovirus kodning luciferas (Luc) och vitamin D-receptorn (VDR), eller kort hårnål RNA (shRNA) inriktning VDR, med en Hamilton spruta i myokardiet. Efterföljande i vivo imaging visade att luciferas var framgångsrikt överuttryckt specifikt i hjärtat. Dessutom bekräftade Western blot analys den framgångsrika överuttryck eller Tystande av VDR i mus hjärtat. När behärskar, kan denna teknik användas för genen manipulation, liksom injektion av celler eller andra material, såsom nanogels i mus hjärtat.
Introduction
Hjärtsjukdom är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet i hela världen1,2. Bristen på effektiva behandlingsstrategier för livshotande hjärtproblem inklusive hjärtinfarkt och hjärtsvikt lockar intensiv utforskning av underliggande patomekanism och identifiering av nya terapeutiska alternativ3. För dessa vetenskapliga expeditioner är hjärt-specifik gen manipulation utbredda4,5. Hjärt gen manipulation kan uppnås genom gen editering med hjälp av den kraftfulla transkription aktivator-liknande effektor nuclease (TALEN) och klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR associerade protein 9 (Cas9) verktyg, eller genom leverans av ektopisk genetiska material (t.ex., virusvektorer bära gener som kodar för proteiner av intresse)6. Om gen editering tillåter exakt och spatiotemporal genomet ändringar i levande möss, är det fortfarande en tidskrävande och arbetsintensiva praktiken6. Hjärt-specifik gen manipulation av viruset vektor- eller små störande RNA (siRNA) komplex leverans är rutinmässigt utförs alternativt6.
Viruset vektor leverans till vuxen mus hjärtat uppnås genom ungefär två strategier: systemisk eller lokal injektion. Systemisk injektion av medel serotyp av AAVs såsom AAV9 är noninvasiv för hjärt specifik gen manipulation7. Denna metod kräver en relativt hög mängd vektor nödvändig för effektiv transduktion och genuttryck, vilket kan resultera i betydande transduktion i ickemålorganismer organ såsom muskler och levern7. Lokala virus injektion uppnås genom intramyocardial injektion eller intracoronary leverans7. Intracoronary leverans leder till en jämnare fördelning av virus inom hjärtat jämfört med intramyocardial injektion. Nackdelarna med denna teknik är dock den snabba wash-out av virala vektorer till systemcirkulationen och transduktion i ickemålorganismer organ8och dess krav på anordningar för mätning under operationen. Däremot vektor intramyocardial injektion möjliggör bättre virus lagring i hjärtmuskeln samt platsspecifika leverans, men det misslyckas att jämnt fördela viral7. För små djur är intracoronary leverans tekniskt svåra att utföra, medan systemisk AAV9 injektering och intramyocardial är mer allmänt praktiseras4,5,7. Även systemisk injektion är enkelt att utföra, konventionella intramyocardial injektion kräver mekanisk ventilation och torakotomi, orsakar omfattande vävnadsskada, och är tidskrävande.
I denna rapport beskrev vi en lätt, sparar tid och mycket effektiv metod för intramyocardial injektion. Adenovirus kodning luciferas och VDR eller shRNA inriktning VDR, injicerades för att manipulera hjärt genuttryck. När behärskar, kan denna metod användas för genen manipulation, liksom injektion av celler eller andra material i mus hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök genomfördes enligt de nationella institut för hälsa riktlinjer om användning av laboratoriedjur, och godkändes av institutets djur etikkommittén. C57BL/6J hanmöss (i åldern 8-10 veckor) användes för alla experiment. Möss inkvarterades patogenfria villkor vid 24 ° C ± 4 ° C, under en 12-h ljus/mörk cykel, med fri tillgång till vatten och mat.
1. beredning av Adenovirus lösning
- Vid ankomsten av renat adenovirus lösningen förvaras lösningen i-80 ° C frys.
Obs: Adenovirus injektionen utfördes i livskraftiga möss. För att säkerställa steriliteten hos den adenovirus-vektorn, adenovirus (kodning luciferas, VDR eller shRNA inriktning VDR) var beredda och renat kommersiellt9,10. - På dagen för drift, ta ut renat adenovirus lösningen (3 x 1010 plack bildar enheter [pfu] / ml) från-80 ° C frysen och Tina adenovirus vektor lösning på is.
- Lägga på en ansiktsmask, sterila handskar och sterila klänning.
- Förbereda en 50-µL Hamilton spruta som har steriliserats dagen före operationen.
Obs: För sterilisering, Hamilton sprutan var insvept i gasväv och placeras i en hög temperatur/hög press sterilizer. Funktionsläget av ”sterilisering för fast” valdes och sterilisering inleddes genom att trycka på ”start”-knappen. - Efter fullständig upptining av renat adenovirus lösningen, spraya röret som innehåller adenovirus lösning med 75% etanol, och flytta adenovirus lösningen i en steril LAF.
- I en steril LAF, aspirera 50 µL adenovirus lösning Använd Hamilton spruta utan nål, följt av tillbehöret av en 30 G nål till Hamilton sprutan.
- Håll sprutan med 30 G nålen uppåt och tryck försiktigt kolven i sprutan tills nålen är fylld med adenovirus lösning (bekräftat av uppkomsten av den första lösning droppar från kanylspetsen).
Obs: Det tar ca 45 µL lösning att fylla 30 G nålen, så nu nästan ingen lösning är synliga i sprutan. - Använd ovan förberedda sprutan till sug noga ut en annan 30 µL adenovirus lösning och placera den löst utjämnade sprutan på is för senare användning.
2. anestesi och operativa förberedelser
- Tillsätt 20 mL isofluran i en isofluran spridare och Anslut den isofluran spridare till ett syre tank.
- Öppna ventilen och låta syre flöde från syre tanken till den isofluran spridare. Underhåll av syre flöde 2 L/min via en syre flödesvakt i den isofluran spridare.
- Inducera anestesi av musen med 4% isofluran i 100% syre (2 L/min) i 2 min i en plast bur ansluten till den isofluran spridare.
- Ta ut den sövda musen från plast buren, och fäst den på en plast plattform i liggande position i en steril LAF och underhålla anestesi med 2% isofluran i 100% syre (2 L/min) via en Kona.
- Bekräfta adekvat anestesi genom avsaknad av tå nypa svar.
- Tillämpa sterila oftalmologiska kräm på varje öga att skydda hornhinna från torkning.
- Raka bröstet och övre delen av buken. Tillämpas kommersiellt tillgängliga hårborttagningsprodukter grädde på webbplatsen rakad för 1 min. ta bort hårborttagningsprodukter krämen och resterande päls med våta Flor.
- Sterilisera operationsområdet (vänstra nedre delen av bröstet) med 3 scrubs av jod-klorhexidin baserat antiseptisk (t.ex. entoiodine). Täcka den kirurgiska platsen med en steril draperi.
3. Intramyocardial injektion av Adenovirus i mus hjärtat
- Ta av handskarna och sätta på ett nytt par sterila handskar.
- Sterilisera pincett, en mikro-mygga hemostat, ett par kirurgisk sax och en nålförare dagen före operation i en hög temperatur/hög tryck autoklaven (se steg 1.4 anmärkning).
- Gör en 0,5 cm huden snitt längs den linje som förbinder xiphoid och axill. Rakt på sak dissekera Pektoral större- och mindre bröstmusklerna med pincett och en mikro-mygga hemostat.
- Exponera de interkostal utrymmena av Upprullningskraften Pektoral större- och mindre bröstmusklerna. Hål genom och öppna den fjärde interkostalrummet (eller den bredaste interkostalrummet genom observation) med en mikro-mygga hemostat.
- Tryck hjärtat mot snittet att yttre hjärtat med pekfingret av den icke-dominanta handen genom att försiktigt trycka mot höger sida av bröstkorgen.
- Försiktigt säkra externalized hjärtat med pekfingret och tummen på den icke-dominanta handen.
- Injicera sammanlagt 30 µL adenovirus lösning i myokardiet i vänster kammare i tre platser (ventrala, dorsala och laterala väggen av vänster kammare) via den Hamilton spruta fylld med adenovirus (figur 1 c) med den dominerande handen.
- Efter avslutad injektion, placera omedelbart hjärtat tillbaka in i intratorakalt utrymme.
- Manuellt evakuera luften i intratorakalt utrymmet genom att försiktigt trycka på bröstkorgen mot huden snitt platsen.
Obs: Framgångsrika luft evakuering kan styrkas genom att flaxa med större och mindre bröstmusklerna orsakas av utvisade luften. - Huden i närheten horisontella madrass sutur med en 5-0 silk sutur.
Obs: Pektoral större- och mindre bröstmusklerna bör inte vara sys, eftersom de är bara rakt på sak dissekeras och deras anatomiska strukturer är intakt under hela operationen.
4. postoperativ Management
- Administrera buprenorfin (3 mg/kg) två gånger dagligen via subkutan injektion för att minska postoperativ smärta för första 48 h efter operationen11.
- Efter operation, omedelbart upprätthålla mössen på en värme pad (37 ° C) tills återhämtat sig helt. Placera musen tillbaka till buren efter det fullt återhämtar sig.
- Sterilisera begagnade Hamilton sprutan och 30 G sprutans nål i en hög temperatur/hög press sterilizer (se steg 1.4 anmärkning). Samla steriliserad 30 G sprutans nål i en behållare.
5. in Vivo Imaging för att mäta hjärtats luciferas uttryck
- Dag 5 efter adenovirus injektion, förbereda färska stamlösning av luciferin vid 15 mg/mL i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm filter.
- Inom peritoneally injicera vaken mössen luciferin lösningen vid 150 mg/kg kroppsvikt.
- Slå på bildsystem.
- Efter automatisk självtest av bildgivande systemet, Välj imaging läget som ”självlysande” och gör följande inställningar: exponering: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Excitation: Blockera; Utsläpp: öppen.
- På 10 min efter luciferin injektion, söva möss genom chloral hydrat injektion (300 mg/kg kroppsvikt). Bekräfta adekvat anestesi genom avsaknad av tå nypa svar.
- Säkra de sövda möss på en uppvärmd imaging scen i liggande position, med bröstkorgen riktad mot kameran.
- Samla bilder (1 bild varje mus) och kvantifiera intensiteten av signaler genom att rita identiska cirkulär mätning regioner av intresse (ROI) runt bröstet.
- Efter en samling av bilder, offra möss och samla vävnader som nämns i följande avsnitt.
6. skörda vävnader
- Vid olika tidpunkter efter virus injektion (figur 1B), söva möss med 4% isofluran, och underhålla anestesi med 2% isofluran via en Kona, och fäst den på en plast plattform i liggande position.
- Göra en mittlinjen ventrala snitt i främre halsen. Exponera rätt gemensamma halspulsådern av Upprullningskraften omohyoid och sternocleidomastoideus musklerna.
- Offra möss genom transecting den rätt gemensamma halspulsådern och dränera blodet.
- Göra en mittlinjen ventrala snitt i buken. Skär revbenen från båda sidor av bröstkorgen längs midclavicular, och transekt membranet.
- Exponera hjärtat genom att lyfta xiphoid. Hitta aorta ascendens och ta försiktigt bort perivaskulär fettvävnad.
- Cannulate aorta och retrogradely BEGJUTA hjärtat med 30 G nål bifogas en 1 mL spruta fylld med 0,5 mL 4 ° C fosfatbuffertlösning (PBS).
- Efter perfusion, punktskatter hjärtat och dela upp det i vänster och höger ventriklarna. Punktskatt lever, lunga och mjälte.
- Efter två tvättar i kalla PBS (4 ° C), lagra alla vävnader som samlas in separat i kryogena injektionsflaskor i flytande kväve.
7. bestämning av proteinuttryck
- Förbereda homogenisering buffert genom att lägga proteas hämmare cocktail i kommersiellt tillgängliga lyseringsbuffert i förhållandet 1: 100. Beräkna den totala volymen baserat på antalet prover som skall bearbetas. Hålla den beredda homogenisering buffert vid 4 ° C för senare användning.
- Ta ut vävnaderna från flytande kväve tanken. Väga in vävnaden på hög precision skalor (cirka 60 mg för varje bit vävnad).
- Överföra vävnad till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 200 µL homogenisering buffert och förhandskyld 1,5 mm stålkulor (4 ° C) omedelbart i mikrocentrifug röret.
- Säkra mikrocentrifugrör i förhandskyld (4 ° C) metall hållare i en automatisk vävnad slipmaskin och inleda homogenisering genom att starta maskinen med följande inställningar: frekvens: 70 Hz; tid: 120 s.
- Efter homogenisering, Centrifugera Homogenatet (16.000 × g, 4 ° C) och noggrant överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub med 100 µL pipett.
- Lägg till lastning buffert lösning (5 x) proteinet supernatanten i förhållandet 1:4 och denaturera proteinet vid 100 ° C i 5 min.
- Protein uttrycksnivåerna i hjärtat och andra organ vävnader övervakas ytterligare genom Western blot analys (representant resultaten visas i figur 2 c och figur 3) enligt protokollet tidigare beskrivits12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet experiment och några av de viktigaste stegen för metoden rapporterade visas i figur 1. 5 dagar efter intramyocardial injektion av adenovirus kodning luciferas (Adv-luc) anges in-vivo imaging i adv-luc injiceras möss robust överuttryck av luciferas specifikt i hjärtat (figur 2A, B), som var bekräftade genom Western blot analys (figur 2 c), vilket tyder på avsaknad av ickemålorganismer orgel transduktion. Däremot upptäcktes inget luciferas uttryck i kontroll möss. Överensstämmer med den framgångsrika överuttryck av luciferas, Western blot analys föreslås avsevärt ökat VDR uttryck i vänster kammare av möss injiceras med adenovirus kodning VDR (adv-VDR) (figur 3A). Dessutom betydligt adv-shVDR injektion VDR uttryck i den vänstra ventrikeln (figur 3B). Däremot var VDR uttryck inte signifikant i rätt ventriklarna varken i adv-VDR injiceras möss eller adv-shVDR injiceras möss (figur 3 c, D), eftersom adenovirus injicerades endast i den vänstra ventrikulära hjärtmuskeln.
Figur 1 . Schemat för mus intramyocardial injektion och gen uttryck detection protocol. (A) Illustration visar tre injektionsställen i myokardiet i vänster kammare. (B) protokoll för gen uttryck detektion i mus hjärtat efter injektion av angivna virus. ADV-luciferas: adenovirus kodning luciferas; AdVDR: adenovirus kodning VDR; AdshVDR, adenovirus kodning shRNA inriktning VDR. (C) representativa bilder visar flera steg av modifierade metoden för mus intramyocardial injektion. a. avlägsnande av päls av kommersiellt tillgängliga hårborttagningsprodukter grädde. b. sterilisering av operationsområdet med 3 scrubs av povidonjod. c. som täcker den kirurgiska platsen med en steril draperi. d. 0,5 cm huden snitt längs den linje som förbinder xiphoid och axill. e. trubbig dissektion större och mindre bröstmusklerna med pincett och en mikro-mygga hemostat. f. externalisering av hjärtat. g. injektion 30 µL adenovirus lösning i myokardiet i vänster kammare via Hamilton sprutan. h - i. nedläggning av huden genom en handväska-sträng suturering med en 5-0 silk sutur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Detektering av luciferas uttryck i hjärtat. (A) bilder som samlats in av bildgivande systemet visar självlysande signalen av hjärtat i kontroll möss och möss som injicerats med adenovirus kodning luciferas på 5 dagar efter injektion. (B) självlysande signal intensiteter i olika grupper (n = 3) utsätts för statistisk analys av t -test. p < 0,01 kontra kontroll möss. (C) Western blot analys resultat visar luciferas proteinnivåer i hjärtat, lungorna, levern och mjälten i anges grupper 5 dagar efter adenovirus injektionen (n = 3). Statistisk analys utfördes inte eftersom luciferas uttryck upptäcktes endast i hjärtat av Adv-luc injiceras möss. ADV-luc: adenovirus kodning luciferas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Påvisande av VDR uttryck i hjärtat. (A) övre panelen: Western blot band visar VDR nivåer i vänster hjärtkammare (där adenovirus sprutas) vid 0 dag, 5 dagar, 7 dagar och 14 dagar efter adv-VDR injektion. Nedre panelen: semikvantitativ analys av VDR uttryck nivåer i olika grupper (n = 4 per tidpunkt). Resultaten var normaliserade mot GAPDH och omvandlas till vik förändring i förhållande till 0 day. Envägs variansanalys (ANOVA) följt av den Bonferroni post-test (lika varians antas) eller Tamhane efter provningen (lika varians inte antas) utfördes för statistisk analys. p < 0,05 eller **p < 0,01 kontra 0 day. (B) övre panelen: Western blot band visar VDR nivåer i vänster hjärtkammare vid 0 dag, 3 dagar, 5, och 7 dagar efter adv-shVDR injektion. Nedre panelen: semikvantitativ analys av VDR uttryck nivåer i olika grupper (n = 4 per tidpunkt). p < 0,05 kontra 0 day. (C) övre panelen: Western blot band visar VDR nivåer i höger kammare (där adenovirus inte injiceras) vid 0 dag, 5 dagar, 7 dagar och 14 dagar efter adv-VDR injektion. Nedre panelen: semikvantitativ analys av VDR uttryck nivåer i olika grupper (n = 4 per tidpunkt). (D) övre panelen: Western blot band visar VDR nivåer i höger kammare vid 0 dag, 3 dagar, 5, och 7 dagar efter adv-shVDR injektion. Nedre panelen: semikvantitativ analys av VDR uttryck nivåer i olika grupper (n = 4 per tidpunkt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella rapporten visar en modifierad teknik för intramyocardial injektion av virala vektorer för hjärt gen manipulation, som ändrades från en metod för hjärtinfarkt induktion av Gao et al. 13 för närvarande i vivo karakterisering av specifik gen funktioner oftast innebär framtagning av knockout eller transgena möss3,14,15,16,17 , vilket är dyrt, tidskrävande och arbetsintensiva. Alternativt är leverans av genen vektorer eller siRNA av systemisk eller lokal injektion också allmänt praktiseras för genen manipulation i kardiovaskulär forskning4,5,7. I synnerhet intramyocardial injektion kan inte ersättas med hjärt gen manipulation under vissa omständigheter: när webbplats riktad injektion är nödvändig (t.ex., gränsen zon injektion i hjärtinfarkt modellen)11. När varaktighet begränsad gen manipulation är nödvändig (t.ex., adenovirus injektion). Här, visade vi att den modifierade intramyocardial injektion metoden är enkel, tidsbesparande och mycket effektiv.
Kritiska steg inom protokollet och felsökning:
För framgångsrika driften av detta protokoll, bör flera kritiska steg noteras. Innan utvärderingsenheten virus, luften inom Hamilton sprutan och Fäst nålen måste evakueras, kan annars luften injiceras i myokardiet orsaka aktuell hjärt personskador eller t.o.m. döden. För att ytterligare undvika problemet, bör ready-to-use Hamilton sprutan fylld med en adekvat virus volym inte placeras med kolven slutet nedåt, eftersom detta kan spontant sug ut luften av allvaret i metall kolven. Anestesi bör övervakas noggrant, eftersom djup anestesi kan försena återhämtningen efter operationen, och allvarligt djup anestesi kan leda till döden. Efter adekvat anestesi, bör hjärtat inte vara externalized ur brösthålan av kraft, eftersom detta kan resultera i allvarlig lungskada. Faktiskt rätt hjärtat externalisering kräver bara en mild push av hjärtat, och något motstånd kan tyda på att trycka mot felaktig riktning.
Begränsningar av tekniken:
Eliminering av intubation med denna teknik, vilket minskar den tid som behövs för förfarandet, antyder att intramyocardial injektionsproceduren ska vara klar inom ett relativt begränsat tidsfönster att undvika döden. Enligt vår erfarenhet, hjärtat bör inte vara externalized för mer än 30 s, eftersom detta ökar dödligheten och saktar postoperativ återhämtning. Därför rekommenderas användning av intubation för de första försöken av det protokoll som beskrivs här. En annan begränsning är den ojämna fördelningen av virala vektorer levereras av denna metod, som också finns i konventionella metoder för intramyocardial injektion7. Dessutom, den metod som beskrivs här är mer användbar för hjärt-specifik gen manipulation i oskadd hjärtan, som kan följas genom inrättandet av olika hjärtsjukdom modeller18,19,20, 21,22,23. Användningen av den nuvarande metoden att leverera agenter till skadade hjärtan såsom infarcted hjärtan kan dock begränsas, eftersom dessa möss inte kan tolerera förfarandet.
Betydelse med avseende på befintliga metoder:
Konventionella intramyocardial injektion kräver intubation och mekanisk ventilation24, och gör det svårt att lokalisera injektionsstället på grund av snabb mus hjärtslag. Dessa frågor avsevärt förlänga den drift tid13, vilket ökar variationer som orsakas av tidsfördröjningen. Den modifierade teknik som presenteras här är snabb och gör exakta injektion plats genom att manuellt säkra externalized hjärtat; Sammantaget betydligt potentierande senare studie. Dessutom avskaffandet av intubation och mekanisk ventilation göra modifierade metoden tillgänglig för nästan alla laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Fund för framstående unga forskare (81625002), National Natural Science Foundation Kina (81470389, 81270282, 81601238), Program för Shanghai akademiska forskningsledare (18XD1402400), Shanghai Municipal Utbildning kommissionen Gaofeng klinisk medicin bidragsstöd (20152209), Shanghai Shenkang sjukhus Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 och 14XJ10019), Shanghai segling Program (18YF1413000), och forskarutbildning innovationsprogram av Bengbu Medical College (Byycx1722). Vi tackar Dr. Erhe Gao för hans tidigare hjälp i vårt labb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
