Summary
Nous présentons ici un protocole pour manipulation spécifique cardiaque génétique chez la souris. Sous anesthésie, le coeur de souris ont été externalisé par le quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus, codage de gènes spécifiques ont été injectés avec une seringue dans le myocarde, suivi par mesure d’expression de protéines via l’imagerie in vivo et Western blot analyse.
Abstract
Manipulation génétique spécifiquement au coeur potentialisent considérablement l’enquête de cardiopathie pathomécanismes et leur potentiel thérapeutique. In vivo la livraison gène spécifique cardiaque est généralement obtenue par livraison locale ou systémique. L’injection systémique via la veine caudale est simple et efficace pour manipuler l’expression des gènes cardiaques à l’aide de virus recombinant adéno-associés 9 (AAV9). Toutefois, cette méthode requiert une quantité relativement élevée de vecteur pour la transduction efficace et peut entraîner dans la transduction du gène orgue non ciblés. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et gagner du temps d’injection intramyocardique pour la manipulation spécifique cardiaque gène in vivo chez la souris. Sous anesthésie (sans ventilation), les muscles pectoraux de majeurs et mineurs ont été disséqués sans ménagement, et le coeur de souris a été rapidement exposé par externalisation manuelle par une petite incision à la quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus encodage luciférase (Luc) et récepteur de la vitamine D (VDR) ou l’ARN en épingle à cheveux courts (shARN) ciblant les VDR, a été injecté avec une seringue de Hamilton dans le myocarde. Subséquent en vivo imagerie démontré que luciférase a été avec succès surexprimée spécifiquement au cœur. En outre, analyse par Western blot a confirmé la surexpression réussie ou silencieux du VDR dans le coeur de souris. Une fois maîtrisé, cette technique peut servir pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux tels que nanogels dans le coeur de souris.
Introduction
La maladie cardiaque est la principale cause de morbidité et mortalité dans le monde1,2. L’absence de stratégies thérapeutiques efficaces pour troubles cardiaques mortelles, y compris l’infarctus du myocarde et insuffisance cardiaque attire une exploration intensive des pathomécanismes sous-jacente et l’identification de nouvelles options thérapeutiques3. Pour ces explorations scientifiques, manipulation génétique spécifique cardiaque est largement utilisé4,5. Manipulation génétique cardiaque peut être réalisée par génome édition utilisant la nucléase effecteur comme activateur de transcription puissant (TALEN) et groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) outils, ou par livraison des matériaux génétiques ectopique (p. ex., vecteurs de virus porteurs de gènes codant des protéines d’intérêt)6. Même si génome édition permet les modifications précises et spatio-temporelle du génome chez les souris vivantes, c’est encore une pratique de longues et fastidieuses no6. Alternativement, manipulation de gène spécifique cardiaque par vecteur du virus ou à un petite gêne livraison complexe ARN (siRNA) sont systématiquement effectuée6.
Livraison de vecteur de virus au coeur de souris adulte est réalisée par environ deux stratégies : injection locale ou systémique. L’injection systémique de sérotype cardiotropic de AAVs tels que AAV9 est non invasive pour de manipulation génétique cardiaque7. Toutefois, cette méthode nécessite une quantité relativement élevée de vecteur nécessaire à la transduction efficace et l’expression des gènes et transduction significative des organes ciblés tels que les muscles et le foie7peut entraîner. Injection locale de virus est réalisée par injection intramyocardique ou intracoronaire livraison7. Livraison intracoronaire conduit à une répartition plus égale de virus dans le cœur par rapport à l’injection d’intramyocardique. Toutefois, les inconvénients de cette technique sont le lavage rapid sur des vecteurs viraux pour la circulation systémique et la transduction des organes8, et son exigence de dispositifs de mesure de la pression lors de l’opération. En revanche, permet d’injection intramyocardique meilleure rétention de virus dans le myocarde ainsi que livraison de site spécifique, mais il ne parvient pas à répartir viral vector7. Pour petits animaux, livraison intracoronaire est techniquement difficile à réaliser, alors que l’injection systémique de AAV9 et d’intramyocardique sont plus communément pratiqué4,5,7. Si injection systémique est facile à réaliser, injection conventionnelle intramyocardique exige thoracotomie et ventilation mécanique, provoque des lésions tissulaires vaste et prend du temps.
Dans ce rapport, nous avons décrit une méthode facile, rapide et hautement efficace pour intramyocardique injection. Adénovirus codage luciférase et VDR ou shARN ciblant les VDR, a été injecté pour manipuler l’expression des gènes cardiaques. Une fois maîtrisé, cette méthode peut être utilisée pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux dans le coeur de souris.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été effectués selon le National Institutes of Health Guidelines sur l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Institut. Les souris C57BL/6J mâles (âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences. Souris ont été logés dans des conditions à 24 ° C ± 4 ° C, suivant un cycle de lumière/obscurité de 12 h, libre accès à l’eau et les aliments exempts de micro-organismes pathogènes.
1. préparation de la Solution de l’adénovirus
- À l’arrivée de la solution purifiée adénovirus, conserver la solution dans un congélateur à-80 ° C.
Remarque : L’injection de l’adénovirus a été réalisée chez les souris viables. Pour garantir la stérilité du vecteur adénovirus, l’adénovirus (encodage luciférase, VDR ou shARN ciblant les VDR) ont été préparés et purifiées commercialement9,10. - Le jour de l’opération, retirez la solution purifiée adénovirus (3 x 1010 plaque formant unités [pfu] / ml) du congélateur à-80 ° C et décongeler solution vecteurs adénovirus sur la glace.
- Mettre sur un masque facial, des gants stériles et robe stérile.
- Préparer un 50 µL seringue de Hamilton qui a été stérilisé le jour avant l’opération.
Remarque : Pour la stérilisation, la seringue de Hamilton était enveloppée dans de la gaze et placée dans un stérilisateur à pression haute température/haute. Le mode de la « Stérilisation pour le solide » a été sélectionné et stérilisation a été introduite en appuyant sur le bouton « Démarrer ». - Après décongélation complète de la solution purifiée adénovirus, vaporiser le tube contenant la solution de l’adénovirus avec 75 % d’éthanol et mettez la solution adénovirus dans une hotte à flux laminaire stérile.
- Dans une hotte à flux laminaire stérile, aspirer 50 µL de solution d’adénovirus en utilisant la seringue sans aiguille, suivie par la fixation d’une aiguille de 30 G à la seringue de Hamilton de Hamilton.
- Tenir la seringue avec l’aiguille 30 G vers le haut et poussez doucement le piston de la seringue jusqu'à ce que l’aiguille est rempli de solution d’adénovirus (confirmée par l’apparition des premières gouttes de la solution de pointe de l’aiguille).
Remarque : Il faut environ 45 µL de solution pour combler l’aiguille 30 G, alors maintenant presque aucune solution n’est visible dans la seringue. - Utilisez la seringue préparée ci-dessus pour aspirer soigneusement un autre 30 µL de solution d’adénovirus et placez la seringue vaguement plafonnée sur la glace pour une utilisation ultérieure.
2. anesthésie et préparation du dispositif
- Ajouter 20 mL isoflurane dans un vaporisateur isoflurane et connecter le vaporisateur isoflurane à un réservoir d’oxygène.
- Ouvrez le robinet et laisser l’oxygène écoulement du réservoir d’oxygène pour le vaporisateur isoflurane. Maintenir le débit d’oxygène à 2 L/min via un moniteur de flux d’oxygène dans le vaporisateur isoflurane.
- Induire l’anesthésie de la souris à l’isoflurane de 4 % à 100 % d’oxygène (2 L/min) pendant 2 min dans une cage en plastique reliée à l’isoflurane vaporisateur.
- Sortez la souris anesthésiée de la cage en plastique et fixez-le sur une plate-forme en plastique en position couchée sous une hotte à flux laminaire stérile et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane de 2 % à 100 % d’oxygène (2 L/min) via un cône de nez.
- Confirmer l’anesthésie adéquate par l’absence de réponse de pincement orteil.
- Appliquez la crème ophtalmique stérile à chaque œil pour protéger les cornées de l’évaporation.
- Raser la poitrine et l’abdomen supérieur. Appliquez une crème dépilatoire commercialement disponible sur le site rasé pour 1 min. Retirer la crème dépilatoire et restant de fourrure avec des gazes humides.
- Stériliser le site chirurgical (partie inférieure gauche de la poitrine) avec 3 gommages d’iode-chlorhexidine fondé antiseptique (par exemple entoiodine). Couvrir le champ opératoire avec un drap stérile.
3. intramyocardique Injection d’adénovirus dans le coeur de souris
- Enlever les gants et les mettre sur une nouvelle paire de gants stériles.
- Stériliser des forceps, une pince hémostatique micro-moustiques, une paire de ciseaux chirurgicaux, et un porte-aiguille la veille de l’opération à une haute température/haute pression stérilisateur (voir étape 1.4 note).
- Faire une incision de la peau de 0,5 cm le long de la ligne reliant la pointe et l’aisselle. Carrément disséquer pectorales grands et petits pectoraux avec forceps et une pince hémostatique micro-moustique.
- Exposer les espaces intercostaux en rétractant pectorales majeur et mineur pectoraux. Percer et ouvrir le quatrième espace intercostal (ou le plus vaste espace intercostal par observation) avec une pince hémostatique micro-moustique.
- Poussez le cœur vers l’incision d’externaliser le cœur avec l’index de la main non dominante en appuyant doucement contre le côté droit de la paroi thoracique.
- Doucement Fixez le coeur externalisé avec l’index et le pouce de la main non dominante.
- Injecter un total de 30 µL de solution d’adénovirus dans le myocarde du ventricule gauche dans trois sites (paroi ventrale, dorsale et latérale du ventricule gauche) par l’intermédiaire de la seringue de Hamilton rempli d’adénovirus (Figure 1) avec la main dominante.
- Après injection, placer immédiatement le coeur dans l’espace intrathoracique.
- Manuellement, évacuer l’air dans l’espace intrathoracique en appuyant doucement sur la paroi thoracique vers l’incision de la peau.
Remarque : Évacuation de l’air réussie peut être attestée par le battement des pectorales majeur et mineur pectoraux causée par l’air expulsé. - Fermer la peau par suture de matelas horizontal avec une suture de soie de 5-0.
Remarque : Pectorales majeur et mineur pectoraux ne doit pas être suturés, parce qu’ils sont seulement carrément disséqués et leurs structures anatomiques sont intacts tout au long de l’opération.
4. postopératoire gestion
- Administrer la buprénorphine (3 mg/kg) deux fois par jour par injection sous-cutanée pour réduire les douleurs postopératoires pour les premières 48 h après l’opération11.
- Après opération, immédiatement maintenir les souris sur une bouillote (37 ° C) jusqu'à ce que complètement guéri. Placez votre souris vers la cage après qu’il récupère complètement.
- Stériliser la seringue usagée de Hamilton et l’aiguille de seringue de 30 G dans un stérilisateur à haute température/haute pression (voir la note d’étape 1.4). Recueillir l’aiguille stérilisée de seringue de 30 G dans un conteneur d’objets coupants.
5. l’imagerie in Vivo pour mesurer l’Expression de la luciférase cardiaque
- Jour 5 après l’injection de l’adénovirus, préparer une solution fraîche de luciférine à 15 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD). Filtrer la solution sur un filtre de 0,2 µm.
- Intra-peritoneally, injecter les souris éveillés avec la solution de la luciférine à 150 mg/kg de poids corporel.
- Allumez le système d’imagerie.
- Après automatique self-test du système d’imagerie, sélectionnez le mode d’imagerie comme « Luminescents » et effectuer les réglages suivants : exposition : Auto ; Binning : 8 ; FStop : 1 ; Excitation : Bloc ; Émission : ouvert.
- À 10 min après l’injection de la luciférine, anesthésier les souris par injection de l’hydrate de chloral (300 mg/kg de poids corporel). Confirmer l’anesthésie adéquate par l’absence de réponse de pincement orteil.
- Fixer les souris anesthésiés sur une platine chauffante d’imagerie en décubitus ventral, avec la poitrine dirigée vers la caméra.
- Recueillir les images (1 image pour chaque souris) et de quantifier l’intensité des signaux en dessinant des régions mesure circulaire identique d’intérêt (ROI) autour de sa poitrine.
- Après la collection d’images, sacrifier les souris et recueillir les tissus comme mentionné dans la section suivante.
6. récolte des tissus
- À des moments différents après l’injection de virus (Figure 1 b), anesthésier les souris avec 4 % isoflurane et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 2 % via une extrémité conique et le fixer sur une plate-forme en plastique en position couchée.
- Faire une incision ventrale médiane du cou antérieur. Exposer l’artère carotide commune droite en rétractant les muscles omohyoid et du sternocléidomastoïdien.
- Sacrifier les souris en sectionnant l’artère carotide commune droite et drainant le sang.
- Faire une incision ventrale médiane dans l’abdomen. Couper les côtes des deux côtés de la cage thoracique, le long de la ligne claviculaire et le diaphragme du transect.
- Exposer le cœur en soulevant la xiphoïde. Trouver l’aorte ascendante et retirer doucement le tissu adipeux périvasculaires.
- Canule dans l’aorte et marqués perfuse le cœur avec une aiguille de 30 G, attachée à une seringue de 1 mL contenant 0,5 mL de 4 ° C du tampon phosphate (PBS).
- Après la perfusion, le cœur de l’accise et divisez-le en les ventricules gauche et droit. L’accise du foie, des poumons et rate.
- Après deux lavages en PBS froid (4 ° C), rangez tous les tissus collectés séparément dans des flacons dans l’azote liquide cryogéniques.
7. détermination de l’Expression des protéines
- Préparer, tampon d’homogénéisation en ajoutant cocktail inhibiteur de protéase dans le tampon de lyse disponibles dans le commerce à un ratio de 1/100. Calcule le volume total basé sur le nombre d’échantillons à traiter. Garder la mémoire tampon d’homogénéisation préparés à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Retirer les tissus de la cuve d’azote liquide. Peser le tissu sur les balances de haute précision (environ 60 mg de chaque morceau de tissu).
- Transférer le tissu dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Immédiatement ajouter 200 µL de tampon d’homogénéisation et rafraîchies boules en acier de 1,5 mm (4 ° C) dans le tube de microcentrifuge.
- Fixer les tubes de microcentrifuge rafraîchies (4 ° c) détenteurs de métal dans un tissu automatique machine de meulage et commencer l’homogénéisation en démarrant la machine avec les paramètres suivants : fréquence : 70 Hz ; temps : 120 s.
- Après homogénéisation, centrifuger l’homogénat (16 000 × g, 4 ° C) et transvaser avec soin le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL avec une pipette 100 µL.
- Ajouter chargement solution (x 5) à la protéine surnageante de la mémoire tampon à un ratio de 1:4 et dénaturer les protéines à 100 ° C pendant 5 min.
- Les niveaux d’expression de protéine dans le cœur et les autres tissus de l’organe sont également surveillés par analyse par Western blot (représentant résultats sont illustrés dans la Figure 2 et Figure 3) selon le protocole décrit précédemment12.
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Representative Results
Le protocole de l’expérience et certaines des étapes clés de la méthode signalée sont indiquées à la Figure 1. À 5 jours après l’injection intramyocardique de la luciférase encodage adénovirus (Adv-luc), in vivo d’imagerie chez les souris adv-luc injecté a indiqué robuste surexpression de la luciférase spécifiquement dans le cœur (Figure 2 a, B), qui a été confirmé par analyse par Western blot (Figure 2), ce qui suggère l’absence de la transduction de l’orgue non ciblés. En revanche, aucune expression de la luciférase a été détectée chez les souris témoins. Conformément à la surexpression réussie de la luciférase, Western blot analyse suggère une augmentation significative expression VDR dans le ventricule gauche de souris injectées avec adénovirus encodage VDR (adv-VDR) (Figure 3 a). En outre, adv-shVDR injection a considérablement réduit l’expression VDR dans le ventricule gauche (Figure 3 b). En revanche, expression VDR significativement ne varia pas dans les ventricules droit ni chez les souris de l’adv-VDR injecté ou adv-shVDR injecté souris (Figure 3, D), parce que l’adénovirus a seulement injecté dans le myocarde ventriculaire gauche.
Figure 1 . Schéma pour souris intramyocardique injection et gene expression détection protocole. (A) Illustration montrant trois sites d’injection dans le myocarde du ventricule gauche. Protocole (B) pour la détection d’expression de gène dans le coeur de souris après injection de virus indiqués. ADV-luciférase : adénovirus, encodage luciférase ; AdVDR : adénovirus, encodage VDR ; AdshVDR, adénovirus encodage shARN ciblant les VDR. (C) les images représentatives montrant de multiples étapes de la méthode modifiée pour injection intramyocardique souris. a. retrait de la fourrure par crème dépilatoire disponible dans le commerce. b. stérilisation du site chirurgical avec 3 gommages de povidone-iode. c. couvrant le champ opératoire avec un drap stérile. d. incision de la peau de 0,5 cm le long de la ligne reliant xiphoïde et aisselle. e. Blunt dissection des pectorales grands et petits pectoraux avec forceps et une pince hémostatique micro-moustique. f. externalisation du cœur. g. l’Injection de 30 µL de solution d’adénovirus dans le myocarde du ventricule gauche par l’intermédiaire de la seringue de Hamilton. h - i. fermeture de la peau par une suture de sac à main-chaîne avec une suture de soie de 5-0. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Détection de l’expression de la luciférase dans cœur. (A) des Images recueillies par le système d’imagerie montrant le signal luminescent du coeur de souris témoins et souris injectées avec des adénovirus encodage luciférase sur 5 jours après l’injection. (B) des intensités de signal Luminescent dans différents groupes (n = 3) sont soumis à l’analyse statistique de test t . p < 0,01 par rapport aux souris témoins. (C) immunobuvardage résultats luciférase taux de protéines dans le coeur, poumon, foie et la rate en indiquent groupes à 5 jours après l’injection de l’adénovirus (n = 3). Étant donné que l’expression de la luciférase a été détectée seulement dans le coeur de souris Adv-luc injecté, l’analyse statistique ne se faisait pas. ADV-luc : adénovirus de codage luciférase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Détection d’expression VDR cœur. Panneau supérieur (A) : Western blot bandes montrant des niveaux VDR dans le ventricule gauche (où l’adénovirus est injecté) à 0, 5 jours, 7 jours et 14 jours après l’injection de l’adv-VDR. Panneau inférieur : analyse semi-quantitative des niveaux d’expression de VDR dans différents groupes (n = 4 par point dans le temps). Résultats ont été normalisés contre GAPDH et transformés pour plier les changements par rapport au jour 0. Aller simple analyse de variance (ANOVA) suivie par le post-test de Bonferroni (variances égales supposés) ou Tati post-test (variances égales non assumées) a été réalisée pour l’analyse statistique. p < 0,05 ou **p < 0,01 par rapport à 0 jours. Panneau supérieur (B) : Western blot bandes montrant des niveaux VDR dans le ventricule gauche à 0 et 3 jours, 5 jours et 7 jours après l’injection de l’adv-shVDR. Panneau inférieur : analyse semi-quantitative des niveaux d’expression de VDR dans différents groupes (n = 4 par point dans le temps). p < 0,05 versus 0 jours. Panneau supérieur (C) : Western blot bandes montrant des niveaux VDR dans le ventricule droit (où l’adénovirus n’est pas injecté) à 0, 5 jours, 7 jours et 14 jours après l’injection de l’adv-VDR. Panneau inférieur : analyse semi-quantitative des niveaux d’expression de VDR dans différents groupes (n = 4 par point dans le temps). Panneau supérieur (D) : Western blot bandes montrant des niveaux VDR dans le ventricule droit à 0, 3 jours, 5 jours et 7 jours après l’injection de l’adv-shVDR. Panneau inférieur : analyse semi-quantitative des niveaux d’expression de VDR dans différents groupes (n = 4 par point dans le temps). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le présent rapport illustre une technique modifiée pour injection intramyocardique de vecteurs viraux pour manipulation génétique cardiaque, ce qui a été modifié à partir d’une méthode d’induction de l’infarctus du myocarde par Gao et al. 13 actuellement, en vivo caractérisation des fonctions des gènes spécifiques plus souvent impliquent la génération de masquage ou de souris transgéniques3,14,15,16,17 , qui est coûteux, longues et fastidieuses. Sinon, livraison de vecteurs de gènes ou de siARN par injection locale ou systémique est aussi largement pratiquée pour les manipulations génétiques en recherche cardiovasculaire4,5,7. En particulier, intramyocardique injection ne peut être substituée pour la manipulation du gène cardiaque dans certaines circonstances : quelle site réalisé injection est nécessaire (p. ex., injection de zone frontalière dans le modèle de l’infarctus du myocarde)11; quelle manipulation génétique durée restreinte est requis (p. ex., injection de l’adénovirus). Ici, nous avons montré que la méthode d’injection modifiée intramyocardique est simple, rapide et très efficace.
Étapes critiques au sein du protocole et de dépannage :
Pour le bon fonctionnement du présent protocole, on notera plusieurs étapes cruciales. Avant aspiration de virus, de l’air dans la seringue de Hamilton et l’aiguille doit être évacué, sinon l’air injecté dans le myocarde peut causer une lésion cardiaque topique ou même la mort. Pour éviter ce problème, la seringue de Hamilton prêt-à-utiliser remplie d’un volume suffisant de virus ne doit pas être placée avec l’extrémité du piston vers le bas, car cela peut aspirer spontanément aérien par la gravité du plongeur métal. L’anesthésie doit être surveillée attentivement, comme une anesthésie profonde peut retarder la récupération postopératoire, et une anesthésie profonde sévèrement peut causer la mort. Après l’anesthésie adéquate, le coeur ne devrait pas être externalisées ou non hors de la cavité thoracique par la force, car cela peut entraîner des lésions pulmonaires graves. En effet, externalisation de bon cœur exige seulement une faible pression du coeur, et toute résistance peut indiquer en poussant dans la mauvaise direction.
Limites de la Technique :
L’élimination de l’intubation selon cette technique, ce qui réduit le temps requis pour le mode opératoire, suggère que la procédure d’injection intramyocardique devrait être terminée dans une fenêtre de temps relativement limité pour éviter la mort. Selon notre expérience, le cœur ne doit pas être externalisé pour plus de 30 s, car cela augmente le taux de mortalité et ralentit la récupération post-opératoire. Par conséquent, l’utilisation de l’intubation est recommandée pour les premiers essais du protocole décrit ici. Une autre limitation est la répartition inégale des vecteurs viraux envoyées par cette méthode, qui existe aussi dans les méthodes classiques d’intramyocardique injection7. En outre, la méthode décrite ici est plus utile pour la manipulation du gène spécifique cardiaque dans les cœurs blessés, qui peuvent être suivies par la mise en place de différentes maladies cardiaques modèles18,19,20, 21,22,23. Cependant, l’utilisation de la méthode actuelle à administrer des agents aux cœurs blessés comme les cœurs infarci peut être limitée, parce que ces souris ne peuvent pas tolérer la procédure.
Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :
Intramyocardique classiques injection nécessite intubation et ventilation mécanique24et il est difficile de localiser le point d’injection en raison de la fréquence cardiaque rapide souris. Ces questions prolongent sensiblement l’opération temps13, augmentant ainsi les variations posées par le temps de retard. La technique modifiée présentée ici est rapide et permet de l’emplacement des sites précis injection en fixant manuellement le cœur externalisé ; dans l’ensemble, sensiblement potentialisant étude ultérieure. En outre, l’élimination de l’intubation et ventilation mécanique faire la méthode modifiée accessible à presque n’importe quel laboratoire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Fonds National de la Science d’éminents savants de Young (81625002), Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81470389, 81270282, 81601238), programme de Shanghai recherche académique Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Le soutien de Grant Education Commission Gaofeng médecine clinique (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 et 14XJ10019), Programme de voile de Shanghai (18YF1413000) et le programme de troisième cycle de l’Innovation de Bengbu Medical College (Byycx1722). Nous remercions le Dr Erhe Gao pour son aide précédente dans notre laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
References
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