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Developmental Biology

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

doi: 10.3791/57114 Published: June 17, 2018

Summary

이 문서에서는 소설 비켜생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

Abstract

조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.

여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, ) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.

설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.

Introduction

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조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.

기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.

첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등과 같은 메서드를 사용 하 여).

두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.

깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.

Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,14입니다.

이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.

클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.

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Protocol

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이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.

1. 수정된 메 추 라 기 계란의 부 화

  1. 품 어 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)와 닭고기 (갈 루스 갈 루스) 수정 된 달걀 3, 8 일, 각각.
    1. 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 향하도록 공기 챔버 (계란 무뚝뚝한 끝)와 계란 배치
    2. 약 20 메 추 라 기 계란과 40 닭 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하.
      참고:이 숫자는 처음으로이 절차를 설정할 때 배가 되어야 한다.

2. 절연 Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 메 추리 배아 영역의

참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.

  1. 에 대 한 큰 붕 규 산 유리 그릇을 준비 3/4 가득 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션.
  2. 껍질을 활용 하 여 원형 개통의 무뚝뚝한 끝의 반대 측에 곡선가 위 메 추 라 기 계란을 외피의 3 일 후 엽니다. 조심 스럽게 껍질 제거 하 고 차가운 PBS 가득 유리 그릇에 배아를 전송.
  3. E 3에서 메 추 라 기 (q) 배아를 잡고 (qE3) (메 추 라 기 단계에 해당 하는 닭의 HH 단계 21) 얇은 겸의 도움으로. 노 른 자 곡선된가 위를 사용 하 여 포함 하는 vitelline 막에 상처를 확인 합니다. 잘라 및 외부 여분의 배아 혈관의 둘레를 계속 합니다.
  4. 양도 작은에 배아 그릇 약 3/4 차가운 PBS 얇은 겸의 도움으로 가득. 나머지 연결 된 노 른 자에서 배아는 철저 하 게 세척.
  5. 스키 머를 사용 하 여 100 m m 유리 블랙 기본 페 트리 접시에 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하.
  6. 아래는 stereomicroscope 페 트리 접시를 놓습니다.
    참고:이 시점에서 앞으로, 진보적인 확대에 대 한 미세 절차는 stereomicroscope 아래를 수행 합니다. 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 조명을 사용 하는 것이 좋습니다.
  7. 얇은 곤충 핀 접시의 바닥에는 배아를 잡으십시오. 여분 미 발달 지역에 사각형 모양을 형성 하는 4 개의 핀을 배치 합니다.
  8. 얇은 겸의 도움으로 두 부 영역의 여분의 배아 세포 막을 제거 하 고 거기 5 핀을 배치.
    참고: 경우 태아는 올바르게, 다음 otic 소포, 심장 관 1, 2nd및 3rd 인 두 아치 (Pa) 표시 되어야 합니다.
  9. Wecker 눈이 위를 사용 하 여 관심, , 3 및 4 인 두 아치 지역 (3/4PAR)의 미 발달 지역의 해 부.
    1. 배아 축 somite/신경 튜브 영역과 파 사이 경도 평행을 절단 시작 합니다.
    2. 그것을 절단 하 여 ventrally 위치 심장 튜브를 제거 합니다. 같은 위치에 유지가 위, 컷의 방향으로 태아 위치를 페 트리 접시 회전.
    3. 2 및 3rd 파 사이 잘리고 실바 4번째 아래
    4. 얇은 포 셉의 도움으로 3/4PAR에서 나머지 막 분리 합니다.
  10. 격리 된 조직 (3/4PAR) 및 유리 접시 3/4에 그들 가득 차가운 PBS 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 전송 발음.
    참고:이 하, 조직 성장 생체 외에서 최대 48 h 또는 수 E8에서 닭 배아의 캠에 즉시 투입 될.
  11. 생체 외에서 시험 준비 하는 동안 얼음에 격리 된 3/4PAR를 포함 하는 유리 접시를 유지.

3. 생체 외에서 Organotypic 분석 결과: Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역의 문화

  1. 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
    참고: 약리 성 시 약은 매체 (예를 들어 LY-411.575 (정) 및 디-benzazepine 또는 cyclopamine 그리고 vismodegib, 노치 및 Hedgehog (Hh) 신호 경로 각각 하에 추가할 수 있습니다. 이 분석 결과 대 한 광의 50-200 nM 또는 디 benzazepine의 5-15 µ M를 사용 하 여 노치 3에 신호 억제/4PAR. 3/4PAR5에서 Hh 신호를 억제 하기 위해 cyclopamine의 20 µ M 또는 vismodegib의 10 µ M를 사용.
  2. 6 잘 플레이트에서 3/4PP explant의 생체 외에서 문화를 준비 합니다.
    1. 6 잘 플레이트에서 한 잘 문화 매체의 5 mL을 채우십시오. 24 m m 폴 리 카보 네이트 막 삽입 장소 ( 테이블의 자료를 참조)에 얇은 겸의 도움으로 잘.
    2. Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 막 표면에 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드럽게 밀어 넣어 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 막 삽입 당 최대 7 explants 추가 합니다. 3.4 단계로 진행 합니다.
  3. 또는, 문화 explants 부동 멤브레인 필터에.
    1. 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL을 준비 합니다. 얇은 포 셉, 멤브레인 필터 ( 재료의 표참조) 시키고 공기와 접촉 건조 표면 부동의 도움으로.
    2. Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 멤브레인 필터를 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩으로 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 멤브레인 필터 당 최대 8 explants 추가 합니다.
  4. 조심 스럽게 explants 3.2 및 3.3 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 단계에 놓습니다.
  5. 48 h 잠복기 후 인큐베이터에서 6 잘 플레이트와 35 mm 페 트리 접시를 제거 합니다.
    1. 6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.
      1. 실 온 (RT)에서 막 삽입 PBS를 추가 합니다.
      2. 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 활발 한 홍 조 explants는 막에서 분리 합니다.
      3. 주걱과 얇은 겸의 도움으로 실시간에 PBS를 가진 채워진 유리 접시 3/4에 교양된 explants 전송
    2. 마찬가지로, 35 mm 페 트리 접시에에서 떠 있는 멤브레인 필터에서 교양된 explants를 수집 합니다.
      1. 실시간에 PBS를 가진 채워진 새로운 35mm 페 트리 접시에 얇은 집게와 멤브레인 필터를 전송
      2. 활기찬 pipetting 사용 하 여 2 mL의 멸 균 플라스틱 피펫은 explants 멤브레인 필터에서 분리 합니다.
      3. 얇은 포 셉의 도움으로, 그것에 연결 된 아무 explants 남아 확인 후 explant 무료 멤브레인 필터를 방전.
      4. 주걱과 얇은 집게, 전송 explants 유리 접시에 담긴 실시간에서 PBS
  6. 총 RNA 격리에 대 한 시 약의 1 mL를 주걱으로 교양된 explants 전송 및 유전자 발현 연구에 대 한 사용.
    주의: 이 시 약에 노출 ( 재료의 표참조) 심각한 건강 위험 수 있습니다. 적절 한 보호 안경, 의류, 장갑 착용. 처리 지시 하 고 제조업체에서 제공 하는 안전 데이터 시트를 읽어.
  7. 또는, E8에서 닭 배아의 캠에 교양된 조직 이식. 4 단계를 따릅니다.

4입니다. 카메라의 준비

  1. 인큐베이터에서 배아 발달의 8 일 닭 계란을 제거 합니다.
    참고: 계란 습도 인큐베이터에서 38 ° C에서 위쪽으로 직면 하는 공기 챔버와 인 큐베이 팅 했다.
  2. 공기 챔버에 떨어지는 포탄의 조각을 방지 하기 위해 투명 한 플라스틱 테이프와 계란의 무뚝뚝한 끝을 커버. 셸을 누르고 곡선가 위 계란에 원형 개통을 잘라. 공기 챔버 표시 되어야 합니다.
  3. 제거 주의 공기 챔버의 흰색 막 얇은 집게와. 캠은 다음 볼 수 및 소성 조직 이식에 대 한 접근.
    참고: 이후 PBS 슬라이딩과 방치는 explants의 촉진이 이식, 전후 캠, 수 화를 PBS를 사용 하지 마십시오. 막 밖으로 건조, 계란을 폐기.

5. 교양된 Explants는 캠에의 접목

  1. 에 홀더 microscalpel와 카메라의 작은 혈관에서 작은 혈관 병 변/상처를 만듭니다.
    참고: 주입구 과잉 출혈의 경우에 의해 혈액을 제거 하는 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다.
  2. 주걱과 얇은 집게를 사용 하 여 카메라의 부상 영역 교양된 explant 전송.
  3. 필터 종이 explant 보다 약간 잘라내어는 explant 위에 그것을 배치.
    참고: 필터 종이 캠에 개발 후 explant 위치를 추적 도움이 됩니다. 또한, 그것은 매일 약 하 배달을 허용는 explant 비켜에서 개발 하는 동안 필요한 경우 (5.6 단계에서 설명).
  4. 투명 한 플라스틱 테이프와 계란 창 인감 및 목탄 연필을 사용 하 여 식별 합니다.
    참고: 플라스틱 테이프는 잠복기 동안 탈수에서 태아를 보호 한다.
  5. 38 ° c.에 습도 인큐베이터에서 10 일 동안 조작된 달걀을 품 어 6 단계를 따릅니다.
  6. 선택적 단계: 잠복기 동안 매일 약물 행정.
    1. 필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치
      참고:이 분석 결과 대 한 cyclopamine의 20 µ M의 복용량은 억제 비켜 개발5동안 Hh 신호.

6. 소성 기관 형성 카메라에 비켜에서 개발의 10 일 후

  1. 10 일 후 부 화, 인큐베이터에서 달걀을 제거 하 고 플라스틱 테이프를 신중 하 게 철회.
  2. 캠 곡선된가 위 및 작은 유리 필터 종이 캠 파생 explant 약 3/4 차가운 PBS 가득 그릇을 사용 하 여 필터 영역에 주위 잘라.
  3. 얇은 겸의 도움으로 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 캠 파생 explant 100 mm 페 트리 접시에 전송. 부드럽게 필터 종이 Wecker 눈이 위를 사용 하 여 집게를 얇은 막의 과잉을 제거 합니다.
  4. 캠-explant 통 솔루션에 전송 (3.7 %PBS PFA) 스키 머와 함께. 큰가 위의 도움으로 태아의 목 지역에 정확한 컷 하 여 난 자에서 그들을 제거 하지 않고 닭 배아를 안락사.
  5. 전통적인 조직학 및 immunohistochemistry 캠 파생 explants의 파라핀 섹션에서 기관 형성을 평가 합니다.

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Representative Results

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위의 설명 프로토콜 세부 사항을 조사의 두 초기-및-의 후기 종종 복잡 한 세포 및 분자 상호 작용에 의해 제한 organogenesis 허용 하는 방법.

이 방법은 이전 Figueiredo 에 고용 되었다 노치와 Hh 신호 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발에서의 역할을 해명 하기 5 .

여기, 새로운 결과 그림 1그림 2 organogenesis의 동일한 모델을 사용 하 여 표시 됩니다. 그림 1A thymus 및 부 갑 상선 형성의 초기 단계를 탐험 하는 데 사용 하는 실험 설계를 보여 줍니다. 잠재 장기 초보 (3/4PAR)으로 구성 된 메 추 라 기 배아 영토 organotypic 시스템에서 분리 되 고 재배 생체 외에서 48 h에 대 한 이었다.

Figure 1
그림 1 . Organotypic 문화 분석 결과 함께 얻은 대표 결과:의 유전자 발현 분석은 추정 영토를 포함 하는 미 발달 지역 thymus와 parathyroids (3/4PAR) 개발의 생체 외에서 48 h.에 대 한 관심과 실험 설계 (A)의 지역에서 태아의 횡단 섹션의 도식 적인 표현입니다. 간단히, qE3에서 3/4PAR 기계적으로 격리 하 고 성장 했다 생체 외에서 48 h에 대 한. 3/4PAR-관련 유전자, Tbx1, Six1, Bmp4의 식은 qRT-PCR 뇌관을 사용 하 여 테이블 (B)에 의해 시험 되었다. Tbx1, Six1, Bmp4의 식은 갓 절연된 (3/4PAR-0 h)에서 분석 하 고 교양 (3/4PAR-48 h) 조직 (C). 생체 외에서 48 h 200의 존재에 대 한 성장 하는 조직에 파 관련 유전자의 표현 분석 nM Ly411575 (D)와 노치 및 Hedgehog 신호 통로의 약리 억제제는 20 µ M cyclopamine (E) 각각. 각 증명서는 β-말라와 hypoxanthine guaninephosphoribosyltransferase 사본 식 레벨의 의미에 대 한 비율로 측정 표현과 임의의 단위로 표시 (컨트롤에 각 성적 = 1). 의미 및 표준 편차는 생물 통계학 분석 및 과학적인 그래픽 디자인 소프트웨어와 함께 결정 했다. 오차 막대는 뜻의 표준 편차를 나타냅니다. 홀 양측 스튜던트 t-테스트 사용 되 고 결과 여겨졌다 크게 다른 때 p-값이 0.05 (p < 0.05) 보다는 더 적은. Β-걸, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; 정-411.575, Ly; N, Notocord; NT, 신경 관; 파, 인 두 아치 지역; PP, 인 두 주머니 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

파 구조 (파 관련 유전자), , Tbx116,17,18, Six1 및 Bmp415,17의 형성에 관련 된 것으로 알려진 유전자의 식은 정상 중에 평가 했다 개발입니다. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 앞에서 설명한5 수행 되었다 (뇌관 같습니다 그림 1B). 갓 절연된 (3/4PAR-0 h)과 48 h 교양 조직 (3/4PAR-48 h) (그림 1C) 3 개의 유전자의 사본은 발견 했다. Bmp4 식 수준만 문화의 48 h 후 크게 감소 했다.

노치와 thymus 및 부 갑 상선 개발의 초기 단계에 있는 통로 신호 하는 Hh의 역할 평가, 약리 억제제 생체 외에서 개발 중 문화 매체에 추가 되었습니다. 억제제 복용 Figueiredo 에 설명 되어 있습니다. 5 3 개의 유전자 분석의 식 수준을 크게 3/4PAR (마약) 없이 제어 조건에 비해 노치 억제제의 성장에서 감소 되었다 (그림 1D). 반대로, 유일한 Bmp4 Hg 신호 때 성적표 크게 48 h 배양 조직에 감소 되었다 (그림 1E) 차단.

Thymus 및 부 갑 상선 동맥 organogenesis의 늦은 단계 공부, 교양된 조직 다음 카메라에 융합 되었고 (참조 그림 2A에서 실험 설계) 10 일에 대 한 추가 개발을 허용.

Figure 2
그림 2 . 대표 결과 얻은 비켜에서 분석 결과: chorioallantoic 막에 10 일 동안 성장 하는 이식의 형태소 분석. 48의 도식 표현 h 교양 파 캠에 융합 하 고 10 일 (A)에 대 한 개발. (B-) 캠 파생 explants 슬라이드의 직렬 섹션 물 H & E (B, C, FG), QCPN (DE)와 안티 팬 CK (H immunodetected ) 항 체, 그리고 길의 hematoxylin와 counterstained. 검은색 화살표 머리 QCPN (E)와 () 팬 CK에 대 한 강한 immunostaining를 나타냅니다. 호스트 기원의 림프 세포와 신호와 강한 QCPN+ (검은 화살표) thymic 상피 세포를 메 추 라 기-파생 된 공상 thymus의 횡 근 섹션 (전자). Thymus () 부 갑 상선 동맥의 epithelia에 강력한 팬 CK+ 신호 (검은 화살표). 카메라는 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 수집 ( 재료의 표참조). Ca, 연골; 캠, chorioallantoic 막; 피, 상피; 파, 인 두 아치 지역; PT, 부 갑 상선 동맥; 솜, 부드러운 근육; 10 d, 10 일입니다. 스케일 바, 50 µ m (B, D, F, 그리고 H)와 (C, E, G, 그리고 ) 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

캠 파생 explants에 개발 하는 장기의 형태소 분석은 앞에서 설명한5전통적인 조직학 및 immunohistochemistry (그림 2B-), 의해 수행 되었다. 캠 파생 explants 메 추 라 기 파생 (QCPN+) thymic 상피 림프 조상 세포 기증자 기원 (치킨) (그림 2D, E)에 의해 식민지로 완전히 형성된 공상 thymus (-그림 2BE)을 보여주었다. 캠 파생 explants의 직렬 섹션 immunocytochemistry 안티 팬에 대 한 추가 처리 cytokeratin (안티 팬 CK) 항 체 (상피 세포 마커) 정상 형태학 기능 (그림 2 H thymic 및 부 갑 상선 epithelia를 보였다 ). Thymic 상피 세포 클러스터에 배열 하 고 수많은 모세 혈관에 의해 둘러 쌓여 부 갑 상선 parenchymal 세포 구형, 동안으로 아키텍처를 표시. 또한, 호흡 장치에서 다른 파 파생 구조는 이식에 관찰 될 수 있었다. 연골, 호흡 상피, 그리고 부드러운 근육 점 막에 관련 된 쉽게 그림 2B에서 구별 했다.

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Discussion

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이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전을 제시 해야 합니다. 그것은 또한 각 인큐베이션 단계 끝에 진정한 대표 성과 신뢰성 보장을 재현할 수 동기 발달 단계를 제공 합니다 확인 하는 것이 중요. 달걀 껍질 다공성으로 인해 모든 계란 부 화 단계에 대 한 인큐베이터에서 습도 분위기를 유지 합니다. 환경 오염을 방지 하려면 항생제 절차 (선택 사항)에서 PBS 솔루션에 추가할 수 있습니다.

이 메서드는 메 추 라 기 기관 초보를 절연 하 고 48 h에 대 한 organotypic 시스템에 그들을 성장 하 고 시작 합니다. 분석 결과 제한 계정으로 이동 하는 경우이 첫-단계, 이미 흉 선, 부 갑 상선 초기 개발5, 공부 하는 데 사용 또한 다른 장기에 적용할 수 있습니다. 장기 초보 (3mm 미만)의 작은 explants 및 짧은 기간 (48 h) 최대 에 체 외 배양의 영양분의 비효율적인 확산 및 explants는 더 큰 크기를 도달 하는 때 일반적으로 발생 하는 조직의 건조를 방지 하도록 조언 된다.

이 메서드는 또한 약리 억제제5,7등 성 시 약의 사용에 의해 복잡 한 유전자 조작 우회 신호 통로의 변조를 수 있습니다. 이 절차에 대 한 약물의 복용량을 증가 생리 적/독성 문화 조건을 식별 하기 위해 시험 되어야 한다. 금지 작업 신호 통로 대상 유전자의 유전자 표정 분석 하 여 측정할 수 있습니다.

이 절차의 단계 2에서 교양된 조직 기관 형성의 후반 단계를 공부 하는 캠에 융합 된다. 캠 분석 결과 캠9,,1011에 장기 초보의 직접 접목 하 여 골격 개발 및 깃털 형성 같은 organogenesis의 다른 문맥에서 사용 되었습니다. 또한, 캠 engraftment 쥐에 치킨 xenografts testes 성숙19공부에 성공적으로 적용 되었습니다. 캠 분석 결과 기관 형성의 늦은 단계를 공부 하는 강력한 연구 도구 이지만, 그것은 그 한계를 인식 하는 것이 중요. 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 접목에 대 한 캠 준비 합니다. 혈관 병 변에 대 한 작은 혈관만을 대상으로 중요 하다. 그러나, 경우에 그 중 몇 가지는 lesioned, 이후 신생 응답 캠에서 발생 하는 새로운 배에 의해 이식할된 조직의 침공을 홍보 하기에 충분 한 않을 수 있습니다. 따라서, 충분 한 영양분 이나 성장을 유지 하기 위해 가스 교환 이식된 조직이 없습니다. 부상된 영역을 준비할 때 큰 혈관의 무결성이 손상 된 경우 다른 한편으로, 태아는 삭제 됩니다 있다.

비켜 개발 카메라를 사용 하 여 중요 한 제한 성장 explants의 3 차원 제약 조건으로 인해 형성된 된 장기의 해 부 변위 이다. 종종 thymus (그림 2F-), 부 갑 상선 동맥의 불완전 한 분리 그리고 부적당 한 thymic 세분화, 기관 형성된5의 정상 수의 감소와 함께 발생합니다.

CAM 시스템의 또 다른 제약 약리 약5도 따라서 explant 단계의 개발의 분석을 제한 매일 약국의 최적의 접근 있을 수 있습니다. 예를 들어, 이전 학문은 보여주었다 그 cyclopamine 성공적으로 Hh에서 비켜에서억제 물, Ly411575, 보여주었다 아무 금지 속성 비켜5신호 노치 동안 신호를 억제.

이러한 한계를 넘어이 방법은 조사 그리고 늦은-의 초기 단계 기관 형성 조류 모델을 사용 하 여 중요 한 실험적인 접근을 제공 합니다. 또한, 조직 개발 수 조작 되며 organogenesis 경도 연구를 위해 또한 적당 한 방법을 만들기 비켜체 외에서 개발의 어떤 시간대에 수확.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Polycarbonate Membrane Insert  Corning 3412 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert 
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
6-well culture plates Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
Pyrex bowls from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette normax 5426015
Whatman qualitative filter paper Sigma-Aldrich WHA1001090 Filter paper
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Cyclopamine hydrate Sigma-Aldrich C4116 Pharmacological inhibitor of Hh signalling
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Stemolecule LY411575 Stemgent 04-0054 Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15596026 Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80
Microscope Leica Microsystems  DM2500

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References

  1. Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49, (2-3), 85-103 (2005).
  2. Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
  3. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117, (1-4), 231-239 (2007).
  4. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17, (4), 779-804 (2014).
  5. Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418, (2), 268-282 (2016).
  6. National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
  7. Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6, (3), e17660 (2011).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10, (9), 2387-2393 (1991).
  10. Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32, (1), 27-34 (2003).
  11. Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58, (3), 303-314 (2016).
  12. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
  13. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
  14. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
  15. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361, (2), 208-219 (2012).
  16. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27, (3), 286-291 (2001).
  17. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193, (6), 393-403 (2011).
  18. Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293, (2), 499-512 (2006).
  19. Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64, (4), 264-269 (2014).
2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임
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Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).More

Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).

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