Tvåstegsstrategi att utforska och sen-början av Organ kan bildas i aviär modellen: den brässen och bisköldkörtlarna organogenesen Paradigm
Summary
Denna artikel innehåller en uppdaterad metod till klassiskt vaktel-kyckling chimera systemet att studera organ kan bildas, genom att kombinera roman i vitro och ovo experimentella rutiner.
Abstract
Aviär embryot, har som en experimentell modell, varit av yttersta vikt för banbrytande upptäckter i utvecklingsbiologi. Bland flera metoder, bildandet av vaktel-kyckling chimärer och användning av chorioallantoic membran (CAM) att stödja utvecklingen av ektopisk vävnad har anor från förra seklet. Kombinationen av dessa klassiska tekniker med nyligen in vitro- metoder erbjuder numera Roman framtidsutsikter för att ytterligare utforska organ kan bildas.
Här beskriver vi en tvåstegsstrategi för att studera tidig – och sena-stadier av organogenes. Kort, regionen embryonala innehållande presumtiva territorium av orgeln är isolerad från vaktel embryon och odlade i vitro i ett organotypic system (upp till 48 timmar). Odlade vävnader ympas därefter på CAM en chicken embryo. Efter 10 dagar i ovo utveckling erhålls fullt bildade organ från ympade vävnader. Denna metod kan också moduleringen av signalering vägar genom regelbunden administrering av farmakologiska agenter och vävnad genmanipulation i hela i vitro och ovo utvecklings steg. Dessutom kan utveckla vävnader samlas på några tidsfönster att analysera deras genuttryck profil (med kvantitativ PCR (qPCR), microarrays, etc.) och morfologi (bedömd med konventionella histologi och immunkemi).
Det beskrivna experimentell förfarandet kan användas som ett verktyg för att följa organ kan bildas utanför aviär embryot, från de tidiga stadierna av organogenes fullt bildas och funktionella organ.
Introduction
Aviär embryon har använts i nyskapande utvecklingsbiologi studier. De främsta fördelarna av aviär modell inkludera möjligheten att öppna ägget, relativt enkel tillgång till embryot och förmågan att utföra mikromanipulation. Några exempel utgör det klassiska vaktel-kyckling chimera systemet för att studera cell öde1, tillämpningen av specifika tillväxtfaktorer i embryot2och tillväxten av ektopisk cellulära strukturer i CAM1,3, 4.
För att få nya insikter i olika faser av organ kan bildas, har vi nyligen utvecklat en metod som kombinerar ympning tekniker med in vitro- manipulering av embryonala vävnader5. Tvåstegsstrategi möjliggör diskriminering och utforskning av båda – och sen-början av organogenes, som ofta är begränsad på grund av mycket dynamisk och komplex vävnad interaktion2. Bristen på lämpliga vävnadsspecifika markörer ofta begränsar dessutom användningen av genetiskt modifierade djur modeller6. Denna nya metod för tvåstegsstrategi övervinner i stor utsträckning sådana begränsningar.
För att studera tidiga-stadierna av organ kan bildas, i det första steget, vaktel embryonala territoriet som omfattar den blivande orgel rudiment isoleras och odlas i ett in vitro- organotypic system för 48 h. Under denna period kan farmakologisk modulering av specifika signalvägar utföras genom att lägga till droger till odlingsmediet5,7. Dessutom odlade vävnader kan samlas i något skede av in vitro- tillväxt och utforskad för gen-uttryck (med metoder såsom qPCR, microarrays, etc.).
I det andra steget, 48 h-odlade vävnader ympas sedan på CAM för en kyckling (c) embryo embryonala dag (E) 8 (cE8) (hamburgare och Hamilton (HH)-arrangerar 33-35)8. CAM beter sig som en vaskulär leverantör av näringsämnen och tillåter gas utbyte1,3,4 till ympade vävnader aktivera dess utveckling i ovo för längre tidsperioder. Detta experimentella steg är särskilt väl lämpad för att studera sena-stadier av organogenes, som fullt bildade organ kan erhållas efter 10 dagar i ovo utveckling5,9,10,11 . Morfologisk analys utförs enkelt av konventionella histologi bekräfta korrekt organ kan bildas och givare ursprung av celler kan identifieras av immunhistokemi med artspecifika antikroppar (dvsMAb vaktel perinukleära (QCPN)). Under inkubationstiden CAM kan ympkvistar även odlas i närvaro av farmakologiska agenter och samlas in i något skede av utveckling för att utvärdera utvecklingen av organogenes.
Den tvåstegsstrategi, beskrivs här på djupet, har redan varit anställd i Figueiredo m.fl. 5 att utforska aviär bisköldkörteln/bräss gemensam primordium utveckling. Följaktligen kommer de inneboende särdrag av embryonala territorierna och stadier av utveckling som är inblandade i organogenesen av brässen och bisköldkörtlarna att presenteras nedan.
I brässen och bisköldkörtlarna epitel, härleda men funktionellt distinkta, från endoderm av faryngeal påsarna (PP)12. Fåglar, epitel av dessa organ har sitt ursprung från tredje och fjärde PP endoderm (3/4PP)12, medan hos däggdjur thymic epitelet härrör från 3PP och epitelet i bisköldkörtlarna härrör från 3PP och 3/4PP i mus och människa, respektive13,14.
En av de tidigaste stadierna i bildandet av dessa organ är uppkomsten av diskreta bräss och bisköldkörtel domäner i den gemensamma primordium. I kyckling, kan dessa domäner identifieras genom i situ hybridisering, med specifika molekylära markörer, E4.515. Allteftersom utveckling fortskrider, dessa organ fragment individualisera och separera från svalget, medan en tunn mesenkymala kapsel, bildas av neural crest-derived celler, omger dem (på E5; HH-stage 27). Senare är thymic epitelet koloniserade av hematopoetiska stamceller (vid E6.5; HH-stage 30)12.
Som i klassiska vaktel-kyckling studier1,12är tvåstegsstrategi särskilt användbart för att studera bildandet av hematopoetiska/lymfoida organ, nämligen den thymus5. Som vaktel explant, med den orgel rudiment, ympas i kyckling embryot innan hematopoetiska stamceller cell koloniseringen, en chimär brässen bildas med kyckling blodburna stamceller infiltrera en vaktel thymic epitelial motsvarighet. Denna metod är, därför, ett användbart verktyg för att utforska bidraget av hematopoetiska celler i utvecklingen av aviär hemato/lymfsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
En avgörande aspekt för att lyckas med denna metod är kvaliteten på både kyckling och vaktel ägg. Med tanke på de långa inkubationstider perioderna, särskilt i ovo analysen, en god kvalitet på hönsägg förbättrar priser lönsamheten (upp till 90%) i slutet av förfarandet. För att uppnå detta, testa ägg från olika leverantörer. Inkubera omanipulerat ägg under långa perioder (upp till 16-17 dagar) och kontrollera deras utveckling. För att betraktas som en god kvalitet batch, bör mer än 80% …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma att António Cidadão, Isabel Alcobia och Leonor Parreira för den kritiska behandlingen av manuskriptet, till Padma Akkapeddi för video berättande, och att Vitor Proa från tjänsten histologi av Instituto de Histologia e Biologia göra Skattemyndigheten, Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, för teknisk support. Vi är särskilt tacksamhetsskuld till Paulo Caeiro och Hugo Silva från det Unidade de audiovisuais (audiovisuella enheten), Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa för deras enastående engagemang för produktionen av denna video. Vi erkänner Leica Microsystems för vänligt att ge ett stereoskop utrustad med video-system och Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A för att bidra med vaktel befruktade ägg. Detta arbete stöds av Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
