To-trins tilgang til at udforske tidlige - og sene-stadier af orgel dannelse i den aviær Model: Thymus og Biskjoldbruskkirtlerne Organogenesis paradigme
Summary
Denne artikel indeholder en opdateret tilgang til den klassiske vagtler-kylling chimera system at studere orgel dannelse, ved at kombinere roman i in vitro og i ovo eksperimentelle procedurer.
Abstract
Aviær embryoet har som en eksperimentel model, været af største betydning for skelsættende opdagelser i i udviklingsmæssige biologi. Blandt flere tilgange, dannelsen af vagtler-kylling kimærer og brugen af den chorioallantoic membran (CAM) til at fastholde udviklingen af ektopiske væv kan dateres tilbage til sidste århundrede. I dag er tilbyder kombinationen af disse klassiske teknikker med de seneste in vitro- metoder nye perspektiver for at yderligere udforske orgel dannelse.
Her beskriver vi en totrinsstrategi for at studere tidlige – og sene-stadier af organogenesis. Kort, den embryonale region indeholdende den formodede område af orglet er isoleret fra vagtler embryoner og dyrkes in vitro- i et organotypic system (op til 48 h). Kulturperler væv er efterfølgende podet på CAM af en kylling embryo. Efter 10 dage i ovo udvikling, er fuldt dannet organer fremstillet af podede væv. Denne metode giver også mulighed for modulering af signalering veje af den almindelige administration af farmakologiske midler og væv genmanipulation i hele i in vitro og i ovo udviklingsmæssige trin. Derudover kan udvikle væv afhentes på enhver tidsvindue til at analysere deres genekspression profil (ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR), microarrays, etc.) og morfologi (vurderet med konventionelle histologi og immunochemistry).
Beskrevet forsøgsmetoden kan bruges som et redskab til at følge orgel dannelse uden for aviær embryo, fra de tidlige stadier af organogenesis til fuldt dannet og funktionelle organer.
Introduction
Aviær embryoner har været udbredt i skelsættende udviklingsmæssige biologi undersøgelser. De vigtigste fordele ved den aviær model omfatter muligheden for at åbne ægget, den relativt let adgang til fosteret, og evnen til at udføre micromanipulation. Nogle eksempler omfatter klassiske vagtler-kylling chimera system for at studere cellen skæbne1, anvendelse af bestemte vækstfaktorer til embryo2, og væksten af ektopiske cellulære strukturer i CAM1,3, 4.
For at få ny indsigt i forskellige stadier af orgel dannelse, har vi for nylig udviklet en metode, som kombinerer podning teknikker med in vitro- manipulation af embryonale væv5. Totrinsløsning muliggør forskelsbehandling og udforskning af begge tidlige – og sene-stadier af organogenesis, som ofte er begrænset på grund af stærkt dynamiske og komplekse væv interaktioner2. Desuden, manglen på egnet væv-specifikke markører ofte begrænser brugen af genetisk modificerede dyr modeller6. Denne nye metode af totrinsløsning overvinder stort set sådanne begrænsninger.
For at studere tidlige stadier af orgel dannelse, i det første trin, er vagtler embryonale område bestående af potentielle orgel rudiment isoleret og dyrkes i en in vitro- organotypic system for 48 h. I denne periode, kan farmakologiske graduering af specifikke signaling veje udføres ved at tilføje narkotika til næringssubstratet5,7. Derudover kulturperler væv kan indsamles på ethvert stadium af in vitro- vækst og probed for genekspression (ved hjælp af metoder som qPCR, microarrays, osv.).
I andet trin af 48 h-kulturperler væv er derefter podet på CAM af en kylling (c) embryon på embryonale dag (E) 8 (cE8) (Hamburger og Hamilton (HH)-stadier 33-35)8. CAM opfører sig som en vaskulær leverandør af næringsstoffer og giver mulighed for gas udveksling1,3,4 til podede væv at aktivere sin udvikling i ovo for længere perioder. Denne eksperimentelle skridt er specielt godt egnet til at studere sene stadier af organogenesis, som fuldt ud-dannet organer kan opnås efter 10 dage i ovo udvikling5,9,10,11 . Morfologisk analyse udføres nemt ved konventionelle histologi at bekræfte korrekte orgel dannelse og donor oprindelsen af celler kan identificeres ved hjælp af Immunhistokemi bruger artsspecifikke antistoffer (dvs., MAb vagtler PeriNuclear (QCPN)). Under inkubationstiden CAM kan grafts også vokset i overværelse af farmakologiske midler og indsamlet på ethvert stadium af udviklingen at vurdere udviklingen af organogenesis.
Totrinsløsning, beskrevet her i dybden, har allerede været ansat i Figueiredo et al. 5 at udforske aviær parathyroidea/thymus fælles primordium udvikling. Derfor, de iboende særpræg af de embryonale territorier og stadier af udvikling, der er involveret i organogenesis af thymus og Biskjoldbruskkirtlerne vil blive præsenteret nedenfor.
Den thymus og Biskjoldbruskkirtlerne epitheler, stammer selvom funktionelt adskilte, fra endoderm af svælg poser (PP)12. I aviær, epitheler af disse organer stammer fra den tredje og fjerde PP endoderm (3/4PP)12, mens i pattedyr thymic epitel stammer fra 3PP og epitel af biskjoldbruskkirtlerne stammer fra 3PP og 3/4PP i mus og mennesker, henholdsvis13,14.
En af de tidligste stadier i dannelsen af disse organer er fremkomsten af diskrete thymus og parathyroid domæner i den fælles primordium. I kylling, kan disse domæner identificeres ved i situ hybridisering, med specifikke molekylære markører på E4.515. Efterhånden som udviklingen skrider frem, disse orgel ansatser individualisere og adskilt fra svælget, mens en tynd mesenchymale kapsel, dannet af neural crest-afledte celler, omgiver dem (på E5; HH-stage 27). Senere er thymic epitel koloniseret af hæmatopoietisk stamceller (på E6.5; HH-stage 30)12.
Som i oldtidskundskab vagtler-kylling1,12er totrinsløsning især nyttig til at studere dannelsen af hæmatopoietisk/lymfoide organer, nemlig thymus5. Da vagtler explant med rudiment orgel er podet i kylling embryo før hæmatopoietisk stamfader celle kolonisering, en kimære thymus dannes med kylling blodbårne stamceller infiltrerer en vagtel thymic epitelial modstykke. Denne metode er derfor et nyttigt redskab til at udforske bidrag af hæmatopoietisk celler i udviklingen af den aviær hemato/lymfoide system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et afgørende aspekt for succes af denne metode er kvaliteten af både kylling og vagtler æg. Overvejer lang inkubationstid perioder, navnlig under in ovo assay, en god kvalitet af hønseæg forbedrer satser levedygtighed (op til 90%) ved udgangen af proceduren. For at opnå dette, skal du teste æg fra forskellige leverandører. Inkubér unmanipulated æg i lange perioder (op til 16-17 dage) og kontrollere deres udvikling. For at blive betragtet som en god kvalitet batch, bør mere end 80% af embryonerne freml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for António Cidadão, Isabel Alcobia og Leonor Parreira kritisk læsning af manuskript til Padma Akkapeddi for video fortælling, og at Vitor Proa fra tjenesten histologi af Instituto de Histologia e Biologia gøre Desenvolvimento, humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, for teknisk support. Vi er især gæld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (enheden for audiovisuelle medier), humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres fremragende indsats for produktionen af denne video. Vi anerkender Leica Microsystems venligst give en Stereoskopet udstyret med video system og Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A for at bidrage med vagtler befrugtede æg. Dette arbejde blev støttet af humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
