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Developmental Biology

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

doi: 10.3791/57114 Published: June 17, 2018

Summary

Questo articolo fornisce un approccio aggiornato al sistema classico pollo quaglia chimera di studiare la formazione di organo, combinando romanzo procedure sperimentali in vitro e in ovo .

Abstract

L'embrione aviaria, come modello sperimentale, è stato di fondamentale importanza per le scoperte seminale in biologia dello sviluppo. Tra i diversi approcci, la formazione di quaglia-pollo chimere e l'uso della membrana corio-allantoidea (CAM) per sostenere lo sviluppo di tessuti ectopici risalgono al secolo scorso. Al giorno d'oggi, la combinazione di queste tecniche classiche con recenti metodologie in vitro offre nuove prospettive per esplorare ulteriormente la formazione dell'organo.

Qui descriviamo un approccio in due fasi per studiare e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi. Brevemente, la regione embrionale che contiene il territorio presuntivo dell'organo è isolata da embrioni di quaglia e coltivati in vitro in un sistema organotipiche (fino a 48 ore). Tessuti coltivati vengono innestate sulla CAM di un embrione di pollo. Dopo 10 giorni di sviluppo in ovo , organi completamente formati sono ottenuti da tessuti innestati. Questo metodo consente anche la modulazione delle vie di segnalazione dell'amministrazione regolare di agenti farmacologici e manipolazione genetica dei tessuti durante fasi inerenti allo sviluppo in vitro e in ovo . Inoltre, lo sviluppo di tessuti possa essere raccolti presso qualsiasi intervallo di tempo per analizzare il loro profilo di espressione genica (mediante PCR quantitativa (qPCR), microarrays, ecc.) e la morfologia (valutato con immunochimica e istologia convenzionale).

La procedura sperimentale descritta utilizzabile come strumento per seguire la formazione dell'organo di fuori dell'embrione aviaria, dalle prime fasi dell'organogenesi a completamente formate di organi funzionali.

Introduction

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Embrioni aviari sono stati ampiamente utilizzati negli studi di biologia dello sviluppo seminale. I principali vantaggi del modello aviaria includono la possibilità di aprire l'uovo, l'accesso relativamente facile per l'embrione e la possibilità di eseguire micromanipolazione. Alcuni esempi comprendono il sistema classico pollo quaglia chimera per lo studio delle cellule destino1, applicazione di specifici fattori di crescita per l' embrione2e la crescita di strutture cellulari ectopici in CAM1,3, 4.

Per ottenere nuove intuizioni distinte fasi di formazione dell'organo, recentemente abbiamo sviluppato un metodo che combina le tecniche di innesto con la manipolazione in vitro di tessuti embrionali5. L'approccio in due fasi consente la discriminazione e l'esplorazione di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, che spesso sono limitate a causa di interazioni altamente dinamico e complesso tessuto2. Inoltre, la mancanza di idonei indicatori di tessuto-specifici spesso limita l'uso di organismi geneticamente modificati6modelli animali. Questo nuovo metodo dell'approccio in due fasi supera di gran lunga tali limitazioni.

Per studiare le prime fasi di formazione di organo, nel primo passaggio, territorio embrionali quaglia comprendente il rudimento di organo prospettico è isolato e coltivato in un sistema in vitro organotipiche per 48 h. Durante questo periodo, la modulazione farmacologica di specifiche vie di segnalazione può essere eseguita con l'aggiunta di farmaci per il terreno di coltura5,7. Inoltre, i tessuti coltivati possono essere raccolti in qualsiasi fase della crescita in vitro e sondati per espressione genica (utilizzando metodi quali qPCR, microarrays, ecc.).

Nel secondo passaggio, 48 h-coltivati tessuti sono poi innestate sulla CAM di un embrione di pollo (c) al giorno embrionale (E) 8 (cE8) (Hamburger e Hamilton (HH)-fasi 33-35)8. La camma si comporta come un fornitore vascolare di sostanze nutritive e permette gas scambi1,3,4 ai tessuti innestati abilitazione relativo sviluppo in ovo per lunghi periodi di tempo. Questa fase sperimentale è particolarmente adatta per studiare fasi ritardate di organogenesi, come organi completamente formati possono essere ottenuti dopo 10 giorni di ovo sviluppo5,9,10,11 . Analisi morfologica viene facilmente eseguita dall'istologia convenzionale per confermare formazione adeguato organo e origine del donatore di cellule possa essere identificati mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, MAb Quaglia perinucleare (QCPN)). Durante il periodo di incubazione di CAM, innesti possono anche essere sviluppati in presenza di agenti farmacologici e raccolti in qualsiasi fase di sviluppo per valutare la progressione dell'organogenesi.

L'approccio in due fasi, descritta qui in profondità, è già stata impiegata in Figueiredo et al. 5 per esplorare lo sviluppo di primordio aviaria paratiroidale/timo comune. Di conseguenza, di seguito saranno presentate le peculiarità intrinseche dei territori embrionali e fasi di sviluppo partecipano l'organogenesi del timo e le ghiandole paratiroidali.

Il timo e le ghiandole paratiroidali epiteli, anche se funzionalmente distinte, derivano dall'endoderma dei sacchetti pharyngeal (PP)12. In aviaria, gli epiteli di questi organi provengono dal terzo e quarto PP endoderma (3/4PP)12, mentre nei mammiferi l'epitelio timico deriva dal 3PP e l'epitelio delle ghiandole paratiroidali deriva dal 3PP e 3/4PP nel topo e umano, rispettivamente di13,14.

Una delle prime fasi nella formazione di questi organi è l'emergere di timo discreto e paratiroidale domini nel primordio comune. In pollo, questi domini possono essere identificati di ibridazione in situ , con marcatori molecolari specifici, E4.515. Come procede lo sviluppo, questi rudimenti di organo individuare e separano dalla faringe, mentre una sottile capsula mesenchymal, formata da cellule derivate dalla cresta neurale, li circonda (a E5; HH-stage 27). In seguito l'epitelio timico è colonizzato da cellule progenitrici ematopoietiche (presso E6.5; HH-stage 30)12.

Come in studi classici di quaglia-pollo1,12, l'approccio in due fasi è particolarmente utile per studiare la formazione degli organi ematopoietici/linfoidi, vale a dire il timo5. Come la quaglia explant, con il rudimento dell'organo, si innesta nell'embrione di pollo prima della colonizzazione delle cellule progenitrici ematopoietiche, timo chimerico è formata con pollo ematica del progenitor una controparte epiteliali timiche quaglia di infiltrazione. Questo metodo è, pertanto, uno strumento utile per esplorare il contributo delle cellule ematopoietiche nello sviluppo del sistema emato/linfoide aviaria.

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Protocol

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Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. l'incubazione di quaglia fertilizzato e uova di gallina

  1. Incubare uova di pollo (Gallus gallus) fertilizzato e quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) per 3 e 8 giorni, rispettivamente.
    1. Sistemare le uova intere con camera d'aria (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto in un incubatore a 38 ° C.
    2. Per eseguire questo esperimento, utilizzare uova di quaglia circa 20 e 40 uova di gallina.
      Nota: Questi numeri dovrebbero essere raddoppiati quando si stabilisce la procedura per la prima volta.

2. isolamento di quaglia embrionale regione contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali

Nota: Eseguire uovo procedure di manipolazione in condizioni sterili, utilizzando materiali e strumenti sterilizzati e cappa a flusso laminare orizzontale.

  1. Preparare una ciotola di vetro di borosilicato grande circa 3/4 riempito con soluzione fredda tampone fosfato salino (PBS).
  2. Aprire un uovo di quaglia dopo 3 giorni di incubazione toccando la shell e taglio di un'apertura circolare sul lato opposto della sua estremità smussata con forbici curve. Con attenzione rimuovere i pezzi di guscio e trasferimento dell'embrione nella ciotola di vetro riempita con PBS freddo.
  3. Tenere l'embrione di quaglia (q) all'E3 (qE3) (la fase di quaglia corrispondono alla HH-fase 21 del pollo) con l'aiuto di pinzette sottili. Fare un taglio nella membrana vitellina avvolgente il tuorlo utilizzando forbici curve. Continuare a tagliare intorno ed esternamente alla circonferenza dei vasi extra-embrionali.
  4. Trasferimento dell'embrione ad una piccola ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo con l'aiuto di pinzette sottili. Lavare accuratamente l'embrione dal restante tuorlo allegato.
  5. Utilizzare una schiumarola per trasferire l'embrione in un bicchiere di 100mm di Petri con base nera (Vedi Tabella materiali) contenente 10 mL di PBS freddo.
  6. Posto di Petri sotto un microscopio stereoscopico.
    Nota: Da questo punto in avanti, eseguire le procedure di microchirurgia sotto un microscopio stereoscopico per ingrandimento progressivo. Come fonte di illuminazione, si consiglia di utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.
  7. Tenere l'embrione alla parte inferiore della piastra con spilli entomologici sottili. Posizionare i quattro perni formando una forma quadrata della regione extra-embrionali.
  8. Rimuovere le membrane extra-embrionali della regione cefalica con l'aiuto di pinze sottili e mettete un perno di quinto ci.
    Nota: Se l'embrione è correttamente posizionato, quindi la vescicola otica, il tubo di cuore e 1st, 2nde archi pharyngeal 3rd (PAs) dovrebbero essere visibili.
  9. Sezionare la regione embrionale di interesse, vale a dire, il 3rd e regione di Arco faringeo 4th (3/4PAR), usando le forbici Wecker occhio.
    1. Iniziare a tagliare longitudinalmente e parallelamente all'asse dell'embrione, tra la zona di tubo somite/neurale e la PAs.
    2. Rimuovere il tubo posizionato ventralmente cuore tagliandolo. Tenendo le forbici nella stessa posizione, ruotare la piastra di Petri per riposizionare l'embrione secondo la direzione del taglio.
    3. Taglio tra la 2nd e 3rd PAs e sotto il 4th PA
    4. Staccare le membrane rimanenti dal 3/4PAR con l'aiuto di pinzette sottili.
  10. Aspirare l'organi isolati (il 3/4PAR) e trasferire loro di un piatto di vetro 3/4 riempita con PBS freddo utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
    Nota: D'ora in avanti, tessuti possono essere coltivato in vitro fino a 48 ore o immediatamente essere innestati la CAM di un embrione di pollo a E8.
  11. Tenere il piatto di vetro contenente l'isolato 3/4PAR sul ghiaccio durante la preparazione del test in vitro .

3. in Vitro organotipiche Assay: cultura della regione embrionale contenente il territorio presuntivo di rudimenti timiche e paratiroidali

  1. Preparare il terreno di coltura con RPMI-1640 supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
    Nota: Solubili farmacologici reagenti possono essere aggiunti al supporto (ad esempio, LY-411.575 (Ly) e di-benzazepine o cyclopamine e vismodegib, per inibire la tacca e segnalazione percorsi, rispettivamente di Hedgehog (Hh). Per questo test, utilizzare 50-200 nM di Ly o 5-15 µM di-benzazepine per inibire la tacca di segnalazione in 3 / 4PAR. uso 20 µM di cyclopamine o 10 µM di vismodegib per inibire signaling di Hh in 3/4PAR5.
  2. Preparare la coltura in vitro del explant 3/4PP in una piastra a 6 pozzetti.
    1. Riempire un pozzo dalla piastra 6-pozzetti con 5 mL di terreno di coltura. Posizionare un 24 mm inserto di membrana in policarbonato (Vedi Tabella materiali) sul bene con l'aiuto di pinzette sottili.
    2. Sotto lo stereomicroscopio, trasferire l'espianto 3/4PAR dal piatto di vetro alla superficie della membrana facendo scorrere delicatamente con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungi fino a sette espianti per inserto di membrana. Procedere al punto 3.4.
  3. In alternativa, cultura espianti in filtri a membrana di galleggiamento.
    1. Preparare una capsula di Petri con 5 mL di terreno di coltura da 35 mm. Con l'aiuto di pinze sottili, float una membrana filtro (Vedi Tabella materiali) e mantenere una superficie asciutta a contatto con l'aria.
    2. Sotto lo stereomicroscopio, trasferimento explant 3/4PAR dal piatto di vetro per la membrana filtrante in scorrimento delicato con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Posizionare gli espianti con il lato ventrale verso l'alto e il lato dorsale a contatto con la membrana. Aggiungere fino a 8 espianti per filtro a membrana.
  4. Posizionare con attenzione gli espianti preparati ai punti 3.2 e 3.3 in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  5. Dopo un periodo di incubazione di 48 h, rimuovere la piastra a 6 pozzetti e il 35mm di Petri dall'incubatrice.
    1. Raccogliere gli espianti coltivati dall'inserto di membrana della piastra 6 pozzetti.
      1. Consente di aggiungere l'inserto di membrana PBS a temperatura ambiente (TA).
      2. Staccare gli espianti dalla membrana irrigando vigoroso utilizzando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
      3. Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti coltivati per un piatto di vetro 3/4 pieni di PBS a TA.
    2. Allo stesso modo, è possibile raccogliere gli espianti coltivati dal filtro membrana galleggiante nella capsula di Petri in 35 mm.
      1. Trasferire la membrana filtrante con una pinza sottile per un nuovo piatto di Petri 35 mm riempito con PBS a TA.
      2. Staccare gli espianti della membrana filtrante vigoroso pipettaggio usando una pipetta di plastica sterile di 2 mL.
      3. Con l'aiuto di pinzette sottili, scarico del filtro a membrana privo di espianto dopo conferma che nessun espianti è rimasto collegato ad esso.
      4. Con una spatola e sottile forcipe, trasferire gli espianti a un piatto di vetro riempito con PBS a TA.
  6. Trasferire 1 mL di un reagente per isolamento di RNA totale gli espianti coltivati con una spatola e utilizzare per gli studi di espressione genica.
    Attenzione: L'esposizione a questo reagente (Vedi Tabella materiali) può essere un pericolo per la salute gravi. Indossare guanti, indumenti e occhiali protettivi appropriati. Seguire le istruzioni di manipolazione e leggere le schede di sicurezza fornite dal produttore.
  7. In alternativa, dell'innesto di tessuti coltivati sul CAM di embrioni di pollo a E8. Seguire al passaggio 4.

4. preparazione della camma

  1. Rimuovere le uova di pollo con 8 giorni di sviluppo embrionale dall'incubatrice.
    Nota: Le uova sono state incubate con camera d'aria rivolto verso l'alto a 38 ° C in un incubatore.
  2. Coprire l'estremità smussata dell'uovo con nastro in plastica trasparente per impedire la caduta nella camera d'aria di pezzi del guscio. Toccare la shell e tagliare un'apertura circolare nell'uovo con forbici curve. La camera d'aria deve essere visibile.
  3. Rimuovere con cautela la membrana bianca della camera d'aria con le pinzette sottili. CAM è quindi visibile e accessibile per il trapianto di tessuto ectopico.
    Nota: Non utilizzare PBS per idratare la CAM, prima o dopo il trapianto, poiché promuove la PBS scorrevole e smarrimento degli espianti. Se la membrana si asciuga, scartare l'uovo.

5. l'innesto degli espianti coltivati sul CAM

  1. Creare piccole lesioni vascolari/ferite nei vasi più piccoli della camma con un microscalpel in un supporto.
    Nota: Utilizzare la punta di una pipetta di Pasteur per rimuovere il sangue per capillarità in caso di sanguinamento in eccesso.
  2. Utilizzare una spatola e sottile forcipe per trasferire explant coltivate per l'area ferita della camma.
  3. Tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente più grande l'espianto e posizionarlo sulla parte superiore l'espianto.
    Nota: La carta da filtro consente di tracciamento della posizione di espianto dopo il suo sviluppo nel CAM. Inoltre, permette una consegna giornaliera del farmaco per l'espianto durante in ovo lo sviluppo, se necessario (descritto al punto 5.6).
  4. Sigillare la finestra uovo con nastro in plastica trasparente e identificarlo con una matita di carbone di legna.
    Nota: Il nastro di plastica protegge l'embrione dalla disidratazione durante il periodo di incubazione.
  5. Incubare l'uovo manipolato per 10 giorni in un incubatore a 38 ° C. Seguire al passaggio 6.
  6. Passaggio facoltativo: Amministrazione della droga quotidiana durante il periodo di incubazione.
    1. Per accedere al filtro, sollevare parzialmente il nastro di plastica. Aggiungere 100 µ l di soluzione della droga, goccia a goccia, in cima alla carta. Richiudere e sigillare la finestra e inserire l'uovo indietro nell'incubatore umidificato a 38 ° C.
      Nota: Per questa analisi, la dose di 20 µM di cyclopamine inibirà signaling di Hh durante in ovo sviluppo5.

6. ectopica organo formazione nel CAM dopo 10 giorni di sviluppo In Ovo

  1. Dopo 10 giorni di incubazione, rimuovere l'uovo dall'incubatrice ed estrarre delicatamente il nastro di plastica.
  2. Tagliare il CAM intorno alla regione di filtro utilizzando forbici curve e trasferimento explant CAM-derivati con carta da filtro per un piccolo bicchiere ciotola circa 3/4 pieno di PBS freddo.
  3. Con l'aiuto del forcipe sottile trasferire explant CAM-derivato a un 100 mm di Petri con base nera contenente 10 mL di PBS. Rimuovere delicatamente la carta da filtro e l'eccesso di membrana utilizzando Wecker occhio forbici e pinzette sottili.
  4. Trasferimento CAM-explant a soluzione fissante (3,7% PFA in PBS) con una schiumarola. Eutanasia gli embrioni di pollo senza rimuoverli dall'uovo facendo un taglio preciso nella regione del collo dell'embrione con l'aiuto di forbici grandi.
  5. Valutare l'insorgenza di organo nelle sezioni della paraffina di espianti di CAM-derivato dall'esame immuno-istochimico e dall'istologia convenzionale.

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Representative Results

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Quanto sopra descritto dettagli del protocollo un metodo che permette la ricerca di entrambi - e tardo-fasi iniziali dell'organogenesi, spesso limitata da complesse interazioni cellulari e molecolari.

Questo metodo è stato precedentemente impiegato in Figueiredo et al. 5 per svelare il ruolo della tacca e Hh segnalazione nello sviluppo paratiroidale aviaria/timo comune primordio.

Nel presente documento, nuovi risultati sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2 utilizzando lo stesso modello dell'organogenesi. Figura 1A raffigura il disegno sperimentale usato per esplorare le fasi iniziali di timo e formazione paratiroidale. Il territorio di embrionali di quaglia comprendente i rudimenti di organo prospettico (3/4PAR) era isolate e coltivate in vitro per 48 h in un sistema organotipiche.

Figure 1
Figura 1 . Risultati rappresentativi ottengono con il dosaggio di coltura organotypic: analisi di espressione genica del embrionale regione contenente i territori presuntivi del timo e delle paratiroidi (3/4PAR) sviluppate in vitro per 48 h. Rappresentazione schematica della sezione trasversale dell'embrione alla regione di interesse e il disegno sperimentale (A). Brevemente, il 3/4PAR al qE3 era meccanicamente isolate e coltivate in vitro per 48 h. L'espressione di geni correlati a 3/4PAR, Tbx1, Six1 e Bmp4, è stato esaminato mediante qRT-PCR utilizzando i primer nella tabella (B). L'espressione di Tbx1, Six1 e Bmp4 è stato analizzato in recente isolate (3/4PAR-0 h) e tessuti (3/4PAR-48 h) (C) in coltura. L'espressione di geni correlati PAR è stata analizzata in tessuti coltivati in vitro per 48 h in presenza di 200 nM Ly411575 (D) e 20 µM cyclopamine (E), che sono inibitori farmacologici della tacca e Hedgehog vie di segnalazione, rispettivamente. Espressione di ogni trascrizione è stata misurata come rapporto contro la media dei livelli di espressione di trascrizione β-actina e ipoxantina-guaninephosphoribosyltransferase ed espressa in unità arbitrarie (ogni trascrizione nel controllo = 1). Medie e deviazioni standard sono state determinate con un software per l'analisi biostatistica e disegno grafico scientifico. Barre di errore rappresentano deviazioni standard della media. Due code spaiati di Student t-test è stato utilizzato e risultati sono stati considerati significativamente differenti quando il p-valore era minore di 0,05 (p < 0,05). Β-actina, Actb; Cyclopamine, Cyc; Deficit di ipoxantina-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, notocorda; NT, tubo neurale; PAR, regione Arco faringeo; PP, sacchetto pharyngeal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'espressione di geni noti per essere coinvolti nella formazione di strutture PAR (geni legati al PAR), vale a dire, Tbx116,17, Six118e Bmp415,17, è stata valutata durante il normale sviluppo. Quantitativa real time PCR (qRT-PCR) è stata eseguita come descritto in precedenza5 (primer sono elencati in Figura 1B). Trascrizioni dei tre geni sono state rilevate di recente isolate (3/4PAR-0 h) e in 48 h-coltivati tessuti (3/4PAR-48 h) (Figura 1). Solo i livelli di espressione di Bmp4 sono stati diminuiti significativamente dopo 48 h di cultura.

Per valutare il ruolo di Notch e Hh vie di segnalazione nelle prime fasi di sviluppo paratiroidale e timo, inibitori farmacologici sono stati aggiunti al terreno di coltura durante lo sviluppo in vitro . Dosi di inibitore sono descritti in Figueiredo et al. 5 i livelli di espressione dei tre geni analizzati sono stati ridotti significativamente nel 3/4PAR sviluppate in presenza di inibitore di Notch, rispetto alle condizioni di controllo (senza farmaco) (Figura 1). Al contrario, solo Bmp4 trascrizioni sono stati ridotti significativamente nei 48 tessuti h-coltivati quando Hg segnalazione fosse bloccato (Figura 1E).

Per studiare le fasi del timo e della ghiandola paratiroide organogenesi, tessuti coltivati erano quindi innestate su CAM e ha permesso di sviluppare ulteriormente per 10 giorni (Vedi il disegno sperimentale in Figura 2A).

Figure 2
Figura 2 . Risultati rappresentativi ottengono con il in ovo test: analisi morfologica degli innesti coltivati per 10 giorni nella membrana corio-allantoidea. Rappresentazione schematica di 48 h-coltivati PAR innestato il CAM e sviluppato per 10 giorni (A). Le sezioni di serie di diapositive di espianti CAM-derivato (Bio) macchiato con H & E (B, C, Fe G), immunodetected con QCPN (D ed E) e anti-Pan CK (H ed io) gli anticorpi e counterstained con ematossilina di Gill. Teste di freccia nera indicano forte immunostaining per QCPN (E) e Pan CK (io). Una sezione trasversa di un timo chimerico con cellule linfoidi dell'origine ospite e cellule epiteliali timiche quaglia-derivato con segnali forti QCPN+ (punte di freccia nere) (E). Segnali di forte Pan CK+ (punte di freccia nere) negli epiteli di timo e le ghiandole paratiroidali (io). Immagini sono state raccolte utilizzando software di imaging e un microscopio con una macchina fotografica (Vedi Tabella materiali). CA, cartilagine; CAM, membrana corio-allantoidea; Epi, epitelio; PAR, regione Arco faringeo; PT, ghiandole paratiroidi; SoM, muscolo liscio; 10d, dieci giorni. Barre della scala, 50 µm (B, D, Fe H) e 100 µm (C, E, Ge io). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi morfologica degli organi che si sviluppano su espianti CAM-derivato è stato effettuato dall'istologia convenzionale e immunohistochemistry (Figura 2Bio), come descritto in precedenza5. CAM-derivato espianti ha mostrato completamente formato chimerico timo (Figura 2BE) con Quaglia-derivato (QCPN+) epitelio timico colonizzato da cellule progenitrici linfoidi dell'origine erogatrice (pollo) (figure 2D, E). Sezioni seriali di espianti CAM-derivato ulteriormente trattati per immunocitochimica con anti-pan citocheratina (anti-padella CK) anticorpo (un marcatore delle cellule epiteliali), hanno mostrato epitelio timico e paratiroidali con normali caratteristiche morfologiche (Figura 2 H Io). Le cellule epiteliali timiche visualizzata un'architettura reticolare mentre cellule parenchimatiche paratiroidale erano globulare, disposti in gruppi e circondata da numerosi vasi capillari. Inoltre, altre strutture PAR-derivato dall'apparato respiratorio potrebbero essere osservati in innesti. Cartilagine, epitelio respiratorio e muscolo liscio associato alla mucosa erano facilmente distinguibili in Figura 2B.

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Discussion

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Un aspetto cruciale per il successo di questo metodo è la qualità del pollo e quaglia uova. Considerando i periodi di incubazione lungo, particolarmente durante il dosaggio in ovo , una buona qualità di uova di gallina migliora la redditività prezzi (fino al 90%) entro la fine della procedura. Per raggiungere questo obiettivo, test di uova provenienti da fornitori diversi. Incubare uova unmanipulated per lunghi periodi (fino a 16-17 giorni) e controllare il loro sviluppo. Per essere considerato un batch di buona qualità, più dell'80% degli embrioni dovrebbe presentare uno sviluppo normale. È anche importante garantire che ogni fase di incubazione fornisce riproducibile fasi inerenti allo sviluppo sincroni per garantire affidabilità e risultati veramente rappresentativi alla fine. A causa della porosità di guscio di uovo, mantengono un'atmosfera umidificata nell'incubatrice per tutte le fasi di incubazione di uova. Per evitare l'inquinamento ambientale, gli antibiotici possono essere aggiunti alle soluzioni PBS nella procedura (passaggio facoltativo).

Questo metodo avvia isolando i rudimenti di organo di quaglia e coltivarle in un sistema organotipiche per 48 h. Questo primo passo, già usato per studiare il timo e paratiroidale sviluppo iniziale5, può essere applicato anche ad altri organi se i limiti di dosaggio sono presi in considerazione. Piccoli espianti di rudimenti di organo (meno di 3 mm) e brevi periodi di incubazione in vitro (fino a 48 ore) si consiglia di impedire diffusione inefficiente delle sostanze nutrienti e asciugatura dei tessuti, che si verifica in genere quando espianti di raggiungono dimensioni maggiori.

Questo metodo consente anche la modulazione delle vie di segnalazione, che bypassa complesse manipolazioni genetiche mediante l'uso di reagenti solubili, quali inibitori farmacologici5,7. Per questa procedura, l'aumento delle dosi del farmaco deve essere testato per identificare le condizioni fisiologiche/tossico cultura. Le azioni inibitorie possono essere misurate dall'analisi di espressione genica dei signaling pathway-geni bersaglio.

Nel passaggio-due di questa procedura, tessuti coltivati sono innestati la CAM per studiare le fine-tappe della formazione dell'organo. Il dosaggio di CAM è stato utilizzato in altri contesti dell'organogenesi come sviluppo scheletrico e piuma formazione mediante innesto diretto dei rudimenti dell'organo su CAM9,10,11. Inoltre, il engraftment CAM è stato applicato con successo anche negli xenotrapianti di topi in pollo per studiare testicoli maturazione19. Anche se il dosaggio di CAM è un potente strumento di ricerca per studiare le ultime fasi della formazione dell'organo, è importante essere consapevoli dei suoi limiti. Una delle fasi più critiche del protocollo è la preparazione di CAM per l'innesto. È importante indirizzare solo le navi più piccole per le lesioni vascolari. Tuttavia, se solo alcuni di quelli sono lesi, la risposta angiogenica successive può non essere sufficiente per promuovere l'invasione dei tessuti innestati di neovasi provenienti dalla camma. Di conseguenza, i tessuti trapiantati non avrà abbastanza sostanze nutrienti o scambi di gas per sostenere la crescita. D'altra parte, se l'integrità dei grandi vasi è compromessa quando si prepara l'area ferita, l'embrione deve essere scartato.

Una limitazione importante di sviluppo in ovo utilizzando la CAM è la cilindrata anatomica degli organi formati, a causa del vincolo tridimensionale di espianti in crescita. Questo si traduce spesso nella separazione incompleta di timo e le ghiandole paratiroidali (Figura 2Fio) e nella segmentazione timica inadeguata, con riduzione del numero normale di organi formato5.

Un altro vincolo del sistema CAM può essere una sub-ottimale accessibilità dei reagenti farmacologico5, anche con somministrazione giornaliera di droga, limitando così l'analisi di espianto fase avanzata di sviluppo. Ad esempio, gli studi precedenti hanno mostrato che cyclopamine correttamente inibire Hh segnalazione in ovo, mentre Notch segnalazione inibitore, Ly411575, ha mostrato alcuna proprietà inibitorie in ovo5.

Di là di queste limitazioni, questo metodo fornisce importanti approcci sperimentali per studiare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo utilizzando il modello di aviaria. Inoltre, lo sviluppo di tessuti possa essere manipolato e raccolte a qualsiasi intervallo di tempo dello sviluppo in vitro e in ovo rendendo il metodo adatto anche per studi longitudinali nell'organogenesi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono grati a António Cidadão, Isabel Alcobia e Leonor Parreira per la lettura critica del manoscritto, a Padma Akkapeddi per video narrazione, e a Vitor Proa dal servizio istologia dell'Instituto de Histologia e fare Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con sistema video e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Polycarbonate Membrane Insert  Corning 3412 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert 
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
6-well culture plates Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
Pyrex bowls from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette normax 5426015
Whatman qualitative filter paper Sigma-Aldrich WHA1001090 Filter paper
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Cyclopamine hydrate Sigma-Aldrich C4116 Pharmacological inhibitor of Hh signalling
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Stemolecule LY411575 Stemgent 04-0054 Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15596026 Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80
Microscope Leica Microsystems  DM2500

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References

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Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma
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Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).More

Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).

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