Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

To-trinns tilnærming til utforske tidlig og sent-etappene Organ-formasjonen i Avian modellen: Thymus og Parathyroid Glands organogenesen paradigme

doi: 10.3791/57114 Published: June 17, 2018

Summary

Denne artikkelen inneholder en oppdatert tilnærming til klassisk vaktel-kylling chimera systemet å studere orgel formasjon, ved å kombinere romanen i vitro og ovo eksperimentelle prosedyrer.

Abstract

Avian embryoet, er som en eksperimentell modell, av største betydning for banebrytende funn i utviklingsbiologi. Flere tilnærminger, dannelsen av vaktel-kylling chimeras og bruk av chorioallantoic membranen (CAM) for å opprettholde utviklingen av ektopisk vev går tilbake til forrige århundre. I dag, tilbyr kombinasjonen av disse klassiske teknikker med siste i vitro metoder romanen utsiktene videre utforsking orgel formasjon.

Her beskriver vi en to-trinns tilnærming for å studere tidlig og sent-etappene av organogenesen. Kort, embryonale regionen presumptive territorium av orgelet er isolert fra vaktel embryoer og dyrket i vitro i et organotypic system (opp til 48 h). Kultivert vev er senere podet på CAM på en kylling fosteret. Etter 10 dager i ovo utvikling, er fullt dannet organer Hentet fra podet vev. Denne metoden tillater også modulering av signalnettverk trasé av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter og vev genetisk manipulasjon gjennom i vitro og ovo utviklingsmessige trinnene. I tillegg kan utvikler vev samles på noen gang-vinduet til å analysere sine genuttrykk profil (med kvantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) og morfologi (vurdert med konvensjonelle histologi og immunochemistry).

Beskrevet eksperimentelle prosedyren kan brukes som et verktøy for å følge orgel formasjon utenfor avian embryoet, fra tidlige stadier av organogenesen til fullt dannet og funksjonelle organer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Avian embryoer har vært mye brukt i banebrytende utviklingsbiologi studier. De viktigste fordelene med avian modellen inkluderer muligheten til å åpne egg, relativt lett tilgang til fosteret, og utføre micromanipulation. Eksempler omfatter klassiske vaktel-kylling chimera systemet for å studere celle skjebne1, bruk av bestemte vekstfaktorer til fosteret2, og veksten av ektopisk cellulære strukturer på CAM1,3, 4.

For å få ny innsikt i forskjellige stadier av orgel formasjon, har vi nylig utviklet en metode som kombinerer pode teknikker med i vitro manipulering av embryonale vev5. To-trinns tilnærming aktiverer diskriminering og utforskning av både tidlig - og sen-stadier av organogenesen, som ofte er begrenset på grunn av svært dynamisk og komplekse vev interaksjoner2. Videre mangel på passende vev-spesifikke indikatorer ofte begrenser bruken av genmodifiserte dyr modeller6. Denne romanen metoden i two-step tilnærming seirer stort sett slike begrensninger.

For å studere tidlige stadier av orgel formasjon, i det første trinnet, er vaktel embryonale territoriet bestående av potensielle organ rudiment isolert og dyrket i et i vitro organotypic system for 48 timer. I denne perioden kan farmakologiske modulering av bestemte signalveier utføres ved å legge til narkotika kultur medium5,7. I tillegg kulturperler vev kan samles inn av i vitro vekst og analysert for genuttrykk (med metoder som qPCR, microarrays, osv.).

I det andre trinnet, 48 h-kulturperler vev er deretter podet på CAM på en kylling (c) fosteret på embryonale dag (E) 8 (cE8) (Hamburger og Hamilton (HH)-stadier 33-35)8. CAM fungerer vaskulær leverandør av næringsstoffer og lar gass utveksling1,3,4 podet vev aktivere sin utvikling i ovo for lengre perioder. Dette eksperimentelle trinnet er spesielt godt egnet for å studere slutten stadier av organogenesen, som fullt dannet organer kan oppnås etter 10 dager i ovo utvikling5,9,10,11 . Morfologisk analyse utføres enkelt av konvensjonelle histology å bekrefte riktig orgel dannelse og donor opprinnelsen til cellene kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (i.e.MAb vaktel PeriNuclear (QCPN)). Under inkubasjonstid CAM kan grafts også vokst i nærvær av farmakologiske agenter og samlet inn av utviklingen å evaluere utviklingen av organogenesen.

To-trinns tilnærming, beskrevet her i dybden, har allerede vært ansatt i Figueiredo et al. 5 å utforske avian parathyroid/thymus primordium utbygging. Følgelig vil iboende særegenheter på embryonale territorier og stadier av utviklingen i organogenesen av thymus og parathyroid glands bli presentert nedenfor.

Thymus og parathyroid glands epithelia, avledet men funksjonelt tydelig, fra endoderm av pharyngeal poser (PP)12. I avian, epithelia av disse organene kommer fra den tredje og fjerde PP endoderm (3/4PP)12, mens i pattedyr thymic epitel stammer fra 3PP og epitel i parathyroid glands stammer fra 3PP og 3/4PP musen og menneskelige, henholdsvis13,14.

En av de tidligste stadiene i dannelsen av disse organene er diskret thymus og parathyroid domener i den vanlige primordium. I kylling, kan disse domenene identifiseres ved i situ hybridisering, med bestemte molekylære markører, E4.515. Som utviklingen fortsetter, disse orgel barnelærdom individualisere og separat fra pharynx, mens en tynn mesenchymal kapsel, dannet av neural crest-avledet celler, omgir dem (på E5; HH-stage 27). Senere er thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (på E6.5; HH-stage 30)12.

Som vaktel-kylling Realencyclopädie1,12er i two-step tilnærming spesielt nyttig å studere dannelsen av blodkreft/lymfoide organer, nemlig thymus5. Som vaktel explant, med orgel-rudiment er podet i kylling embryo før blodkreft stamfar celle kolonisering, dannes en chimeric thymus med kylling blodbårne progenitor celler infiltrere vaktel thymic epitel motpart. Denne metoden er derfor en nyttig verktøyet å utforske bidrag av blodkreft cellene i utviklingen av avian hemato/lymfoide systemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer på Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. inkubering av befruktet vaktel og kylling egg

  1. Inkuber japanske vaktel (Coturnix coturnix japonica) og kylling (Gallus gallus) befruktet egg i 3 og 8 dager, respectively.
    1. Legg eggene med i luftkammer (egg sløv slutten) vender i en fuktet inkubator på 38 ° C.
    2. Bruke rundt 20 vaktelegg og 40 kylling egg til å utføre dette eksperimentet.
      Merk: Disse tallene bør dobles når etablere denne prosedyren for første gang.

2. isolering av vaktel embryonale regionen Presumptive territoriet til Thymic og Parathyroid barnelærdom

Merk: Utføre egg manipulasjon prosedyrer i sterile forhold med vannrett laminær strømning hette og steriliserte instrumenter og materialer.

  1. Forberede en stor Borosilikatglass bolle om 3/4 fylt med kaldt fosfat-bufret (PBS) saltløsning.
  2. Åpne en vaktelegg etter 3 dager med inkubering ved å trykke skallet og kutte en sirkulær åpning på motsatt side av butte enden med buet saks. Nøye fjerne stykker av skall og overføre embryoet til glassbolle med kaldt PBS.
  3. Hold vaktel (q) embryoet på E3 (qE3) (vaktel scenen tilsvarer HH-scenen 21 av kylling) ved hjelp av tynne tang. Lage et kutt i eggeplomme membranen innhyllende eggeplomme med buet saks. Fortsette å klippe rundt og eksternt til omkretsen av ekstra-embryonale fartøy.
  4. Overføring embryoet til en liten bolle med 3/4 fylt med kaldt PBS med hjelp av tynne tang. Grundig vask embryoet fra gjenværende festet eggeplomme.
  5. Bruke en skimmer for å overføre embryoet til et 100 mm glass Petriskål med sort base (se Tabell for materiale) som inneholder 10 mL kaldt PBS.
  6. Plass Petriskål under en stereomicroscope.
    Merk: Fra dette punktet fremover, utføre mikrokirurgi fremgangsmåtene under en stereomicroscope for progressiv forstørrelse. Som en belysning, er det anbefales å bruke lys innlemmet i stereomicroscope eller i optisk fiber, vurderer begrenset varme belastningen.
  7. Hold embryoet til bunnen av platen med tynne insekt pinner. Plass fire pinner som danner en firkantet form i ekstra-embryonale regionen.
  8. Fjern de ekstra-embryonale membranene av regionen cephalic ved hjelp av tynne tang og sted en femte pin der.
    Merk: Hvis embryoet er riktig plassert, deretter otic vesicle, hjertet røret, og 1st, 2ndog 3rd pharyngeal buer (PAs) skal vises.
  9. Dissekere embryonale regionen av interesse, dvs, 3rd og 4th pharyngeal arch regionen (3/4PAR), med Wecker øye saks.
    1. Begynne å klippe langs- og parallell embryoet aksen, mellom somite/nevrale rør og PAs.
    2. Fjern ventrally plassert hjertet røret ved å kutte den. Holde saksen i samme posisjon, rotere Petriskål hvis du vil omplassere embryoet i henhold til retningen på kuttet.
    3. Kutt mellom 2nd og 3rd PAs og under de 4th PA.
    4. Koble gjenværende membraner fra 3/4PAR ved hjelp av tynne tang.
  10. Sug opp isolert vev (3/4PAR) og overføre dem til et glass rett 3/4 fylt med kaldt PBS med en 2 mL steril plast pipette.
    Merk: Heretter, vev kan være dyrket i vitro opptil 48 h eller være umiddelbart podet på CAM på en kylling fosteret på E8.
  11. Holde glass parabolen som inneholder den isolerte 3/4PAR på is under utarbeidelsen av i vitro analysen.

3. in Vitro Organotypic analysen: kultur av embryonale regionen Presumptive territoriet til Thymic og Parathyroid barnelærdom

  1. Forberede kultur medium med RPMI-1640 Medium med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin.
    Merk: Løselig farmakologiske reagenser kan legges til mediet (for eksempel LY-411.575 (Ly) og di-benzazepine eller cyclopamine og vismodegib, å hemme hakk og pinnsvin (Hh) signalnettverk trasé, henholdsvis. For denne analysen, bruker 50-200 nM i Ly eller 5-15 µM av Di-benzazepine for å hemme hakk signalering i 3 / 4PAR. Bruk 20 µM av cyclopamine eller 10 µM av vismodegib for å hemme Hh signalering i 3/4PAR5.
  2. Forberede kultur i vitro 3/4PP-explant i en 6-vel plate.
    1. Fyll en brønn fra 6-vel plate med 5 mL av kultur medium. Plasser en 24 mm polykarbonat membran sett inn (se Tabell for materiale) på godt med hjelp av tynne tang.
    2. Under stereomicroscope, overføre 3/4PAR explant fra glass rett til membran overflaten ved å skyve forsiktig med hjelp av en transplantasjon skje (eller spatula) og tynn tang. Plass explants på ventral side opp og dorsal side i kontakt med membranen. Legg opptil sju explants per membran sett inn. Fortsett med trinn 3.4.
  3. Eventuelt explants kultur i flytende membran filtre.
    1. Forberede en 35 mm Petriskål med 5 mL kultur medium. Med hjelp av tynne tang, flyte en membran filter (se Tabell for materiale) og holde tørt underlag med luft.
    2. Under stereomicroscope, overføre 3/4PAR explant fra glass rett til membran filteret ved å forsiktig skyve ved hjelp av en transplantasjon skje (eller spatula) og tynn tang. Plass explants på ventral side opp og dorsal side i kontakt med membranen. Legge til opptil 8 explants per membran filter.
  4. Forsiktig plassere explants i trinn 3.2 og 3.3 i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO2.
  5. Etter en 48t inkubasjonstiden, kan du fjerne 6-vel platen og 35 mm Petriskål settefiskanlegg.
    1. Samle helstøpt explants fra membran innsatsen av 6-vel plate.
      1. Legge til PBS ved romtemperatur (RT) membran innsatsen.
      2. Koble explants fra membranen av energisk rødme med en 2 mL steril plast pipette.
      3. Med hjelp av spatel og tynn tang, overføre de kultiverte explants til et glass rett 3/4 fylt med PBS på RT.
    2. Tilsvarende samle helstøpt explants fra flytende membran filteret i 35 mm Petriskål.
      1. Overføre membran filteret med tynne tang til en ny 35 mm Petriskål fylt med PBS på RT.
      2. Koble explants fra membranen filteret av energisk pipettering benytter en 2 mL steril plast pipette.
      3. Med hjelp av tynne tang, utslipp explant-fri membran filteret etter bekrefter at ingen explants forble knyttet til den.
      4. Med en spatula og tynn tang, overføre explants til et glass rett fylt med PBS på RT.
  6. Overføre kulturperler explants med en slikkepott til 1 mL av en reagens for total RNA isolasjon og bruke for genuttrykk studier.
    Forsiktig: Eksponering for denne reagensen kan (se Tabell for materiale) være en alvorlig helsefare. Bruk passende vernebriller, klær og hansker. Følg instruksjonene for håndtering og lese HMS-Datablad som leveres av produsenten.
  7. Alternativt pode kulturperler vev på CAM av kylling embryoer på E8. Følg til trinn 4.

4. forberedelse av CAM

  1. Fjern kylling egg med 8 dager av embryonale utvikling fra inkubator.
    Merk: Egg ble inkubert med luftkammer vender oppover på 38 ° C i en fuktet inkubator.
  2. Dekk sløv slutten av egg klar plast tape for å unngå stykker av skallet fra å falle inn i luftkammer. Tapp skallet og klippe en sirkulær åpning i egget med buet saks. I luftkammer skal vises.
  3. Fjern forsiktig med den hvite membranen av i luftkammer med tynne tang. CAM er synlig og tilgjengelig for ektopisk vev transplantasjon.
    Merk: Ikke bruk PBS til hydrat ca-før eller etter transplantasjon, siden PBS fremmer skyve og misplacement av explants. Hvis membranen tørker ut, kaste egg.

5. pode av kultivert Explants på CAM

  1. Opprette små vaskulær lesjoner/sår i mindre fartøyer av CAM med en microscalpel i en holder.
    Merk: Bruk spissen av en Pasteur pipette for å fjerne blod av capillarity ved overflødig blødning.
  2. Bruk en slikkepott og tynn tang overføre kulturperler explant til såret området av CAM.
  3. Skjær et filter papir litt større enn explant og plassere den på toppen av explant.
    Merk: Filter papir hjelper spore hvor explant etter utviklingen i CAM. Den gir også daglige narkotika-leveranser til explant under i ovo utvikling, eventuelt (beskrevet i trinn 5.6).
  4. Seal vinduet egg med klar plast tape og identifisere det bruker en trekull blyant.
    Merk: Plast båndet beskytter embryoet fra dehydrering under inkubasjonstiden.
  5. Inkuber manipulert egg i 10 dager i en fuktet inkubator på 38 ° C. Følg til trinn 6.
  6. Valgfritt trinn: Daglig drug administrasjonen under incubation periode.
    1. For å adgang filteret, delvis løft plast båndet. Legg 100 µL av narkotika løsning, dråpe for dråpe, på papiret. Tette igjen vinduet og plassere egg tilbake i fuktet inkubator på 38 ° C.
      Merk: For denne analysen, dosen av 20 µM i cyclopamine vil hemme Hh signalering i løpet av ovo utvikling5.

6. ektopisk Organ formasjon i CAM etter 10 dager i Ovo utvikling

  1. Etter 10 dager med inkubering, fjerne egg settefiskanlegg og nøye trekke plast båndet.
  2. Kuttet CAM rundt regionen filter bruker buet saks og overføre CAM-avledet explant med filter papir til et lite glass bolle ca 3/4 fylt med kaldt PBS.
  3. Med hjelp av tynne tang overføre CAM-avledet explant til et 100 mm Petriskål svart base som inneholder 10 mL PBS. Fjern filter papir og overskytende av membran Wecker øye saks og tynn tang.
  4. Overføre CAM-explant til etappe, den stabiliserende løsning (3,7% PFA i PBS) med en skimmer. Euthanize kylling embryoer uten å fjerne dem fra egg ved å gjøre en nøyaktig kutt i nakken regionen fosteret ved hjelp av store saks.
  5. Vurdere orgel dannelsen i parafinsnitt av CAM-avledet explants av konvensjonelle histologi og immunohistochemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ovenfor beskrevet protokollen detaljer en metode som gjør etterforskningen av både tidlig - og sen-stadier av organogenesen, ofte begrenset av komplekse cellulære og molekylære interaksjoner.

Denne metoden var tidligere ansatt i Figueiredo et al. 5 å rakne rollen hakk og Hh signalering i avian parathyroid/thymus primordium utbygging.

Her, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2 bruke samme modell av organogenesen. Figur 1A viser eksperimentell design brukt å utforske de tidlige stadiene av thymus og parathyroid formasjon. Vaktel embryonale territoriet bestående av potensielle orgel barnelærdom (3/4PAR) var isolert og dyrket i vitro 48 h i et organotypic system.

Figure 1
Figur 1 . Representant resultater oppnådd med organotypic kultur analysen: genuttrykk analyse av den embryonale regionen presumptive territoriene av thymus og parathyroids (3/4PAR) utviklet i vitro for 48 h. Skjematisk fremstilling av tverrgående delen av fosteret i regionen interesse og eksperimentell design (A). Kort, 3/4PAR på qE3 var mekanisk isolert og dyrket i vitro 48 h. Uttrykket av 3/4PAR-relaterte gener, Tbx1, Six1 og Bmp4, ble undersøkt av qRT PCR hjelp primerne i tabellen (B). Uttrykk for Tbx1, Six1 og Bmp4 ble analysert i fersk isolert (3/4PAR-0 h) og kultivert (3/4PAR-48 h) vev (C). Uttrykket av PAR-relaterte gener ble analysert i vev vokst i vitro for 48 timer i nærvær av 200 nM Ly411575 (D) og 20 µM cyclopamine (E), som er farmakologiske hemmere av hakk og pinnsvin signalnettverk trasé, henholdsvis. Uttrykk for hver transcript ble målt som forholdet mot gjennomsnittet av β-utgangen og hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase transkripsjon uttrykk nivåer og uttrykt i vilkårlig enheter (hver transcript i kontrollen = 1). Midler og standardavvik var bestemt med en programvare for biostatistikk analyse og vitenskapelige grafisk design. Feilfelt representerer standardavvik for gjennomsnittet. Tosidige unpaired Student t-test ble brukt og resultater ble vurdert signifikant forskjellig når p-verdien var mindre enn 0.05 (p < 0,05). Β-utgangen, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, medfødte; PÅLYDENDE, pharyngeal arch regionen. PP, pharyngeal veske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Uttrykket av gener kjent være involvert i dannelsen av PAR strukturer (PAR-relaterte gener), dvs, Tbx116,17, Six118, og Bmp415,17, ble evaluert i normal utvikling. Kvantitativ sanntid PCR (qRT-PCR) ble utført som beskrevet tidligere5 (primere vises i figur 1B). Utskrifter av tre gener ble oppdaget i fersk isolert (3/4PAR-0 h) og 48 h-kulturperler vev (3/4PAR-48 h) (figur 1 c). Bare Bmp4 uttrykk nivåer ble betydelig redusert etter 48 h kultur.

For å vurdere rollen hakk og Hh signalnettverk trasé i de tidlige stadiene av thymus og parathyroid utvikling, ble farmakologiske hemmere lagt til kultur medium under i vitro utvikling. Hemmer doser er beskrevet i Figueiredo et al. 5 uttrykk nivåer av tre gener analysert ble betydelig redusert i 3/4PAR vokst i nærvær av hakk inhibitor, sammenlignet med kontrollen forhold (uten stoff) (figur 1 d). Derimot blokkert bare Bmp4 transkripsjoner ble betydelig redusert i 48 h-kulturperler vev da Hg signalering ble (figur 1E).

For å studere på slutten stadier av thymus og parathyroid gland organogenesen, ble kultivert vev deretter podet på CAMs og lov til å videreutvikle 10 dager (se eksperimentell design i figur 2A).

Figure 2
Figur 2 . Representant resultatene med den i ovo analysen: morfologisk analyse av graftene vokst i 10 dager i chorioallantoic membranen. Skjematisk fremstilling av 48 h-kulturperler PAR podet på CAM og utviklet for 10 dager (A). Seriell deler av lysbildene og CAM-avledet explants (B-jeg) beiset med H & E (B, C, Fog G), immunodetected med QCPN (D og E) og anti-Pan CK (H og jeg) antistoffer, og counterstained med Gill's hematoxylin. Svart pilespisser indikerer sterk immunostaining for QCPN (E) og Pan CK (jeg). En tverrstilt delen av en chimeric thymus lymfoide celler vert opprinnelse og vaktel-avledet thymic epitelceller med sterk QCPN+ signaler (svart pilspisser) (E). Sterk Pan CK+ signaler (svart pilspisser) i epithelia av thymus og parathyroid glands (jeg). Bildene samlet inn ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare og et mikroskop med et kamera (se Tabell for materiale). Ca, brusk; CAM, chorioallantoic membran; Epi, epitel; PÅLYDENDE, pharyngeal arch regionen. PT, parathyroid glands; SoM, glatt muskel; 10 d, ti dager. Skalere barer, 50 µm (B, D, Fog H) og 100 µm (C, E, Gog jeg). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Morfologisk analyse av organer utvikle på CAM-avledet explants ble utført av konvensjonelle histologi og immunohistochemistry (figur 2B-jeg), som beskrevet tidligere5. CAM-avledet explants viste fullt dannet chimeric thymus (figur 2B-E) med vaktel-avledet (QCPN+) thymic epitel kolonisert av lymfoide progenitor celler av donor opprinnelse (kylling) (tall 2D, E). Seriell deler av CAM-avledet explants videre behandlet for immunocytochemistry med anti-pan cytokeratin (anti-pan CK) antistoff (en tarmepitelet markør), viste thymic og parathyroid epithelia med vanlige morfologiske funksjoner (figur 2 H Jeg). Thymic epitelceller vises en reticular arkitektur mens parathyroid parenchymal celler var globular, arrangert i klynger og omkranset av mange kapillærer. I tillegg kan andre PAR-avledet strukturer og respiratoriske apparater være observert i graftene. Brusk, åndedretts epitel og glatt muskel knyttet til mucosa var lett skilles i figur 2B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et viktig aspekt for suksessen til denne metoden er kvaliteten på både kylling og vaktel egg. Vurderer de lange inkubasjonstiden periodene, spesielt i ovo analysen, en god kvalitet av kylling egg forbedrer priser levedyktighet (opptil 90%) ved slutten av prosedyren. For å oppnå dette, kan du teste egg fra forskjellige leverandører. Ruge unmanipulated egg i lange perioder (opptil 16-17 dager) og sjekk deres utvikling. Skal regnes som en god batch, bør mer enn 80% av embryoene presentere normal utvikling. Det er også viktig å sikre at fremgangsmåten inkubasjon gir reproduserbar synkron utviklingsstadier garantere pålitelig og virkelig representativ resultatene på slutten. På grunn av egg skall porøsitet, opprettholde en fuktet atmosfære i inkubator for alle egg inkubasjon trinn. For å unngå miljøforurensning, kan antibiotika legges til den PBS løsninger i prosedyren (valgfritt trinn).

Denne metoden starter ved isolere vaktel orgel barnelærdom og voksende dem i et organotypic system for 48 timer. Denne første skritt, allerede brukt thymus og parathyroid utviklingen5, kan også brukes til andre organer hvis analysen begrensningene er tatt hensyn. Små explants av orgel barnelærdom (mindre enn 3 mm) og korte perioder i vitro inkubering (opptil 48 h) anbefales å hindre ineffektiv spredning av næringsstoffer og tørking av vev, som vanligvis oppstår når explants nå større dimensjoner.

Denne metoden tillater også modulering av signalveier, uten komplekse genetisk manipulasjon ved bruk av løselig reagenser, som farmakologisk hemmere5,7. Til dette bør økende doser av narkotika testes for å identifisere fysiologiske/giftige kultur betingelsene. Hemmende handlingene kan måles ved gene expression analyse av signalnettverk veien mål-gener.

I trinn to i denne prosedyren, er kultivert vev podet på CAM å studere på slutten stadier av orgel formasjon. CAM analysen er brukt i andre sammenhenger av organogenesen som utvikling av skjelettet og fjær dannelsen av direkte pode av orgel barnelærdom på CAM9,10,11. I tillegg ble CAM engraftment også brukt i mus i kylling xenografts å studere testiklene modning19. Selv CAM analysen er en kraftig forskning verktøyet å studere slutten stadier av orgel formasjon, er det viktig å være klar over sine begrensninger. En av de viktigste trinnene av protokollen er CAM forberedelse til pode. Det er viktig å målrette bare mindre skipene i vaskulær lesjoner. Men hvis bare noen av disse er lesioned, kan påfølgende angiogenic svaret ikke være tilstrekkelig til å fremme invasjonen av podet vev av nye fartøyer fra CAM. Derfor har ikke transplantert vev nok næringsstoffer eller gass utveksling for å opprettholde vekst. På den annen side, hvis integriteten til store skip er svekket når forbereder såret området, har fosteret forkastes.

En viktig ANSVARSBEGRENSNING i ovo utvikling med CAM er anatomisk forskyvning av formet organer, på grunn av tredimensjonale tvang av voksende explants. Dette resulterer ofte i ufullstendige separasjon av thymus og parathyroid glands (figur 2F-jeg) og utilstrekkelig thymic segmentering, med reduksjon av normale antall organer dannet5.

En annen betingelse av CAM system kan være en sub-optimale tilgjengelighet av farmakologiske reagenser5, selv med daglig bedøve administrasjon, dermed begrense analyse av explant sent utvikling. Som et eksempel, tidligere studier viste at cyclopamine vellykket hemme Hh signalering i ovo, mens hakk signalering inhibitor, Ly411575, viste ingen inhibitoriske egenskaper i ovo5.

Utover disse begrensningene gir denne metoden viktig eksperimentelle tilnærminger for å undersøke de tidlige - og sen-stadiene av orgel dannelsen ved hjelp av avian modellen. I tillegg kan utvikler vev manipuleres og høstes ved noen gang-vinduet i vitro og ovo utviklingen gjør metoden også egnet for longitudinelle studier i organogenesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig António Cidadão, Isabel Alcobia og Leonor Parreira for kritisk lesing av manuskriptet, til Padma Akkapeddi for video fortellerstemme, og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøremål Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med video-system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Polycarbonate Membrane Insert  Corning 3412 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert 
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
6-well culture plates Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
Pyrex bowls from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette normax 5426015
Whatman qualitative filter paper Sigma-Aldrich WHA1001090 Filter paper
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Cyclopamine hydrate Sigma-Aldrich C4116 Pharmacological inhibitor of Hh signalling
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Stemolecule LY411575 Stemgent 04-0054 Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15596026 Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80
Microscope Leica Microsystems  DM2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49, (2-3), 85-103 (2005).
  2. Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
  3. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117, (1-4), 231-239 (2007).
  4. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17, (4), 779-804 (2014).
  5. Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418, (2), 268-282 (2016).
  6. National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
  7. Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6, (3), e17660 (2011).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10, (9), 2387-2393 (1991).
  10. Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32, (1), 27-34 (2003).
  11. Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58, (3), 303-314 (2016).
  12. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
  13. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
  14. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
  15. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361, (2), 208-219 (2012).
  16. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27, (3), 286-291 (2001).
  17. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193, (6), 393-403 (2011).
  18. Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293, (2), 499-512 (2006).
  19. Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64, (4), 264-269 (2014).
To-trinns tilnærming til utforske tidlig og sent-etappene Organ-formasjonen i Avian modellen: Thymus og Parathyroid Glands organogenesen paradigme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).More

Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter