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Um modelo Experimental de síndrome metabólica induzida por dieta em coelho: considerações metodológicas, desenvolvimento e avaliação

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Descrevemos os métodos para desenvolver um modelo experimental de síndrome metabólica induzida pela dieta (MetS) em coelhos, usando uma dieta hiperlipídica, alta-sacarose. Os animais desenvolveram obesidade central, hipertensão ligeira, pre-diabetes e dislipidemia, reproduzindo, assim, os principais componentes do MetS humanos. Este modelo de crônico permitirá a aquisição de mecanismos subjacentes do conhecimento da progressão da doença.

Abstract

Nos últimos anos, obesidade e síndrome metabólica (MetS) tornaram-se um problema crescente para a saúde pública e prática clínica, dada a sua prevalência aumentada devido ao aumento de estilos de vida sedentários e hábitos alimentares pouco saudáveis. Graças a modelos animais, a pesquisa básica pode investigar os mecanismos subjacentes a processos patológicos como MetS. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para desenvolver um modelo experimental de coelho de MetS induzida por dieta e sua avaliação. Após um período de aclimatação, os animais são alimentados com um alto teor de gordura (10% hidrogenados óleo de coco e banha 5%), dieta de alta-sacarose (15% de sacarose dissolvida em água) para 28 semanas. Durante este período, vários procedimentos experimentais foram realizados para avaliar os diferentes componentes dos MetS: morfológicas e medições de pressão arterial, determinação de tolerância de glicose e a análise de vários marcadores de plasma. No final do período experimental, animais desenvolvidas obesidade central, hipertensão ligeira, pré-diabetes e dislipidemia com baixo HDL, LDL elevado e um aumento dos níveis de triglicérides (TG), reproduzindo, assim, os principais componentes do MetS humanos. Este modelo de crônico permite novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos subjacentes na progressão da doença, a detecção de marcadores pré-clínicos e clínicos que permitem a identificação de pacientes de risco, ou mesmo o teste de novo terapêutico abordagens para o tratamento desta patologia complexa.

Introduction

Obesidade e síndrome metabólica (MetS) tornaram-se um problema crescente para a saúde pública e prática clínica, dada a sua prevalência aumentada devido ao aumento de estilos de vida sedentários e de hábitos alimentares pouco saudáveis1. Existem várias definições de MetS, mas a maioria descrevê-lo como um conjunto de alterações cardiovasculares e metabólicas como obesidade abdominal, redução de HDL e colesterol LDL elevado, triglicérides elevados, intolerância à glicose e hipertensão2 ,3,4. Diagnóstico requer que três dos cinco critérios estão presentes.

Devido a modelos animais, pesquisa básica tem sido capaz de investigar os mecanismos subjacentes a processos patológicos como MetS. Vários modelos animais têm sido utilizados, mas é de importância crucial que o modelo de escolha reproduz as principais manifestações clínicas da patologia humana (Figura 1). Com este objectivo, foram desenvolvidos modelos animais considerados semelhantes aos seres humanos, principalmente caninos e suína, (ver Verkest5 e Zhang & Lerman6 para revisão). No entanto, modelos caninos não mostra todos os componentes do MetS, dado que o desenvolvimento de aterosclerose ou hiperglicemia em cães por meio da dieta é questionável5. Suína modelos apresentam a similaridade mais anatômica e fisiológica com os humanos e assim oferecem poder preditivo significativo para elucidar os mecanismos subjacentes MetS, mas sua manutenção e a complexidade dos procedimentos experimentais fazem o uso Este modelo muito trabalho intensivo e caro6.

Por outro lado, modelos de roedores (rato e rato), dieta induzida espontânea e transgênicos, têm sido extensivamente usados na literatura para o estudo da obesidade, hipertensão e MetS e suas consequências patológicas em diferentes órgãos e sistemas (veja Wong et al. 7 para revisão). Embora o uso desses modelos é mais acessível do que o canino ou suína,... eles têm desvantagens importantes. Com efeito, dependendo da pressão, animais desenvolvem alguns componentes do MetS, enquanto outros como hipertensão, hiperglicemia e hiperinsulinemia são ausentes7. Além disso, um dos principais componentes dos MetS, obesidade, em algumas variedades geneticamente modificadas, não só depende de fatores associados com a dieta, prefiro tem sido demonstrado que alguns animais se tornam obesas com comida normal ou mesmo reduzida ingestão8. Finalmente, camundongos e ratos mostram uma deficiência natural na proteína de transferência de éster de colesterol (CETP) e usam o HDL como os principais meios de transporte de colesterol, o que os torna relativamente resistentes ao desenvolvimento da aterosclerose. Esta é uma diferença importante no metabolismo de lipídios com seres humanos, que expressam CETP e transportar o colesterol principalmente em LDL9.

Por outro lado, o coelho do laboratório representa um estágio intermediário entre o animal maior e modelos experimentais de roedores. Assim, o coelho pode ser facilmente submetido a diferentes tipos de protocolos com requisitos mínimos de pessoal e manutenção, sendo mais facilmente manipulado em procedimentos experimentais do que modelos animais maiores. Além disso, foi relatado que coelhos alimentados com uma dieta high-fat tem alterações hemodinâmicas e neurohumoral semelhantes como seres humanos obesos8,10,11. De nota, sobre o metabolismo lipídico, o coelho tem CETP abundante no plasma e seu perfil de lipoproteína é rica em LDL12, que também é semelhante aos seres humanos. Além disso, coelhos desenvolvem hiperlipidemia rapidamente dado que, como herbívoros, eles são muito sensíveis a gordura dietética13.

Figure 1
Figura 1: comparação de modelos animais de MetS. Consulte Verkest5, Zhang e Lerman6e Wong et al . 7 para revisão. "Equation 1" indica uma vantagem e "Equation 2" indica uma desvantagem. *controverso, varia de acordo com o estudo, *como apontou fora por Carroll et al . 8, algumas linhagens geneticamente modificadas tornam-se obesas independentemente da ingestão de alimentos. CEPT: proteína de transferência de éster de colesterol. GTT: teste de tolerância à glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fim de elucidar os mecanismos básicos subjacentes a remodelação patológico produzido por metástases nos diferentes órgãos e sistemas e para obter uma compreensão desta patologia complexa, a escolha de um modelo experimental que reproduz os principais componentes do MetS humano é essencial. O coelho pode fornecer muitas vantagens, dadas a sua semelhança com a fisiologia humana e a disponibilidade de uso em protocolos crônicos e medições. Nesta linha, alguns modelos de coelho induzida por dieta usando dieta hiperlipídica e alta-sacarose foram utilizados14,15,16,17,18,19 (tabela 1) e um caracterização dos diferentes componentes dos MetS é de grande importância quando relativas a um fenótipo com remodelação de órgão. Assim, o objetivo principal do presente artigo é para descrever os métodos para desenvolver um modelo de MetS induzida por dieta em coelhos que permite o estudo de sua fisiopatologia e impacto na remodelação do órgão.

Estudo Dieta Duração Raça Componentes de MetS
OB HT HG DL
Yin et al. (2002)14 ·    10% de gordura 24 semanas ·      NZW masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37% de sacarose ·      2 kg
Zhao et al. (2007)15 ·    10% de gordura 36 semanas ·      JW masculino Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30% de sacarose ·      16 semanas
Helfestein et al (2011)16 ·    10% de gordura 24 semanas ·      NZW masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    40% de sacarose ·      12 semanas
·    0.1-0.5 colesterol
Ning et al (2015)17 ·    10% de gordura 8-16 semanas ·      WHHL masculino Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30% de frutose * ·      12 semanas
Liu et al (2016)18 ·    10% de gordura 48 semanas ·      NZW masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30% de sacarose ·      12 semanas
Árias-Mutis et al (2017)19 ·    15% de gordura 28 semanas ·      NZW masculino Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabela 1: MetS induzida por dieta coelho modelos usando dieta hiperlipídica, alta-sacarose. O símbolo "Equation 2"indica ausência,"Equation 1" presença, e "-" não avaliada. * restrito. WHHL, Watanabe hiperlipidemic hereditários coelhos. JW, japonês coelhos brancos. OB, obesidade. HT, hipertensão. HG, hiperglicemia. DL, dislipidemia.

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Protocol

Cuidados com animais e os protocolos experimentais usados neste estudo cumpriu com UE Directiva 2010/63, sobre a protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram aprovados pelo Comitê de uso (2015/VSC/ervilha/00049) e cuidados institucionais do Animal.

Nota: O protocolo consiste na administração crônica de uma dieta de alto teor de gordura, alta-sacarose por 28 semanas e a avaliação dos principais componentes dos MetS. Nós usamos 11 coelhos Nova Zelândia branco (NZW) masculino adulto pesando 4.39 ± 0,14 (s.d.) kg, que eram 20-22 semanas de idade no início do protocolo experimental. Eles estavam alojados em um quarto com uma humidade relativa (50 ± 5%) e ciclo de condições de controle de temperatura (20 ± 1,5 ° C) com uma luz de 12-h. As palavras "chow" e "diet" pode ser usados de forma intercambiável nas etapas do protocolo.

1. dieta administração

  1. Obter ou preparar dietas
    1. Obter um comercialmente disponível alta gordura dieta com óleo de coco hidrogenado adicionado (10%) e banha (5%)19. Esta dieta fornecerá 3.7 kcal·g-1.
    2. Prepare soluções de sacarose de 5 a 15%, dissolvendo as quantidades apropriadas de sacarose em água esterilizada (por exemplo, uso 300 g de sacarose em estoque de 2 L de uma solução de sacarose 15%). Uma solução de 15% fornecerá kcal·mL 0,6-1.
    3. Obter um disponível comercialmente dieta controle19, que fornece 2,7 kcal·g-1.
  2. Adaptar os animais por 4 semanas
    1. Alimente a cada animal no grupo controle 120g de dieta controle diariamente. Fornece água ad libitum.
    2. Alimente animais em MetS chow de 250g de grupo começando com um controle de 50% e 50% comida de alto teor de gordura, aumentando progressivamente a comida de alto teor de gordura de 100% até o final da semana 4.
      Nota: O objetivo seria atingir: (i) controle de 35% e chow de alto teor de gordura 65% até o final de semana 1; (ii) 25% controle e chow de alto teor de gordura de 75% no final de semana 2; (iii) 15% controle e 85% gordura comida no final de semana 3. (iv) comida de alto teor de gordura 100% até o final da semana 4.
    3. Dê animais em MetS grupo água com 5% de sacarose no início e aumentar a concentração de sacarose a 15% até o final da semana 4th .
    4. Registre a ingestão diária de chow e sacarose solução para calcular a ingestão calórica, conforme valores fornecidos em 1.1.1. e 1.1.2.
  3. Induzir o MetS (28 semanas)
    1. Cada animal no grupo controle 120g de controle de alimentação comida e água ad libitum diariamente.
    2. Alimente os animais no grupo de MetS 250 g de gordura chow e 15% de sacarose em água. Substitua o chow diariamente e a solução de sacarose a cada três dias.
    3. Pese o restante comida e água diariamente para estimar o consumo diário.

2. avaliação morfológica

  1. Medida animal peso corporal em uma base semanal.
  2. Medir a altura, comprimento, contorno abdominale comprimento da tíbiae calcular o IMC antes da administração da dieta experimental e em semanas 14 e 28 em animais anestesiados.
    1. Canule veia marginal de orelha direita com um cateter descartável estéril (18-22 G) e injetar o propofol (8 mgkg-1), seguido por 1,5 mL de solução de NaCl 0,9%. No coelho anestesiado, execute as medidas listadas nas etapas subsequentes.
    2. Medida de altura e comprimento. Usando a fita métrica, medida e registro a distância entre o nariz para o calcanhar na posição de decúbito lateral (comprimento). Na mesma posição, leve a distância entre o acrômio no ombro à ponta da pata (altura).
    3. Calcular o índice de massa (IMC) de corpo20 como peso corporal (kg) · [corpo comprimento (m) x altura (m)] -1.
    4. Coloque a fita métrica suavemente ao redor do contorno abdominal e fazer uma medição com o animal em posição supina.
    5. Meça o comprimento da tíbia da parte inferior da articulação do joelho para a inserção do tendão de Aquiles.

3. jejum a glicemia e teste de tolerância à glicose intravenosa (IVGTT)

Nota: É aconselhável iniciar os procedimentos, a mesma hora do dia (ou seja, 2-15:00).

  1. Prepare uma solução de glicose (60%) com 60 g de glicose em 100 mL de solução de NaCl 0,9%.
  2. Rápido o animal para 7 h (retirar alimentos e manter a água), em seguida, coloque o coelho consciente em uma retenção de bruços. Preparar o medidor de glicose (inserir uma nova tira no monitor) e pegue a primeira amostra da veia marginal esquerda usando uma lanceta para obter uma gota de sangue. Em seguida, encoste a gota de sangue com o teste tira e medir glicemia usando o medidor de glicose para determinar a glicemia de jejum.
  3. Canule veia marginal de orelha direita com um cateter descartável (18-22 G) e injetar um bolus de uma solução de glicose de 60% (0,6 g·kg-1).
    Nota: Para preparar o bolo, adicione 1 mL/kg do estoque de glicose.
  4. Colher amostras de sangue usando o lancet (uma gota de sangue) em 15, 30, 60, 90, 120 e 180 min após a injeção de glicose e analisá-los com o medidor de glicose como em 3.2.
  5. Remover o cateter descartável e comprima o local de inserção do cateter com uma gaze. Uma vez que o sangue está coagulado, remova a gaze e verificar o status do animal.

4. pressão arterial

  1. Preparar o sistema de aquisição, incluindo um transdutor de pressão, uma seringa de 10 mL com 0,9% de NaCl, uma torneira de três vias, um amplificador e um PC/laptop com o software de aquisição (para gravação de pressão arterial).
  2. Configure o equipamento. Primeiro, coloque a torneira de três vias e a seringa no transdutor de pressão, entre o transdutor e o cateter e conectar o transdutor de pressão para o amplificador. Em seguida, conecte o amplificador para o PC/laptop.
  3. Execute a calibração de transdutores de pressão de acordo com as recomendações do fabricante.
  4. Coloque o animal consciente em uma retenção de coelho, de bruços. Aquecer a orelha antes de canulação e, em seguida, aplicar topicamente um anestésico local (lidocaína/prilocaína 2,5%) no ouvido ao redor do local de inserção. Bata levemente a área onde o pacote vascular é executado para identificar facilmente a artéria. Em seguida, insira um cateter estéril (18-22 G) na artéria central da orelha esquerda. Soltar as amarras e permitir que o animal ficar quietos por 30 min.
  5. Registrar a pressão arterial continuamente por 20 min diretamente do cateter arterial, colocando o transdutor de pressão posicionado ao lado do animal no nível do coração (frequência de amostragem: 1 KHz, ver Figura 5B).
    Nota: Para manter a pressão arterial (PA) gravação livre da interferência de coagulação de sangue (sinal de BP perde amplitude ou desaparece), deve ser feita uma injeção de NaCl (0,9%). Usando a torneira de três vias, fecha o circuito que vai partir do transdutor para o cateter, abrir o circuito que vai desde a seringa ao cateter e injetar 1-2 mL. Isto irá remover coágulos de sangue que podem formar-se o cateter. Em seguida, abra o circuito entre o transdutor e o cateter e continuar a gravação, uma vez que o sinal tenha sido recuperado.
  6. Quando a gravação estiver concluída, remova o cateter e aperte com uma gaze no sítio de inserção do cateter para parar a perda de sangue. Uma vez que o sangue está coagulado, remova a gaze e verificar o status do animal.

5. plasma medições

Nota: É aconselhável iniciar os procedimentos, a mesma hora do dia (ou seja, 2-15:00).

  1. Rápido o animal para 7 h (retirar alimentos e manter a água), em seguida coloque o animal consciente em uma retenção de bruços e introduza uma agulha estéril de 21 G na veia marginal da orelha esquerda. Uma vez que o sangue começa a escorrer, descartar a primeira gota e coletar as amostras de sangue em tubos de EDTA até o nível indicado no tubo. Armazene as amostras no gelo.
  2. Centrifugar as amostras de sangue em 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Após a centrifugação, o plasma, utilizando uma pipeta de sucção e preparar alíquotas de 250 µ l.
  3. Analise as amostras frescas imediatamente. Parâmetros básicos de controle são as seguintes: triglicerídeos, colesterol total, HDL e LDL colesterol.
    Nota: As amostras analisadas não recém devem ser armazenadas imediatamente em um freezer-80 ° C. Se estiver interessado na análise de amostras de plasma de glicose no sangue, o teste de glicose do sangue deve usar tubos com fluoreto de oxalato em vez de EDTA.

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Representative Results

MetS representa um conjunto de anormalidades metabólicas e cardiovasculares, cujo estudo pode ser facilitado pela utilização de modelos experimentais. Com efeito, para elucidar os mecanismos subjacentes a remodelação patológico produzido por MetS, a escolha de um modelo experimental que apropriadamente se assemelha a condição humana e é adequado para a pesquisa é de importância crucial. Aqui, apresentamos os métodos para induzir MetS em coelho usando uma dieta rica em gordura saturada e sacarose e uma caracterização detalhada para sua avaliação. O uso da dieta ao invés de um modelo animal geneticamente modificado é de grande importância desde dieta afeta o metabolismo do corpo inteiro19, assim assemelhando-se pròxima o que acontece em MetS humanos. Usamos um fatorial (modelo misto) ANOVA com dois fatores, um medidas repetidas ou "dentro" fator (tempo: pré, semana 14 e 28, dependendo da análise) e um fator "entre" (Grupo: controle e MetS) para análise estatística. Significância foi aceita quando p < 0,05.

A dieta de alto teor de gordura, alta-sacarose é bem tolerada pelos animais. Um período de aclimatação de 4 semanas é necessário para a transição correta do regime anterior de alimentação para a dieta de alto teor de gordura, alta-sacarose. Animais no grupo controle são alimentados com comida de 120g, que foi mostrada para ser apropriado para a manutenção do adulto coelho8. Coelhos no grupo MetS aumentaram progressivamente em peso até o fim do protocolo experimental (tabela 2). Os animais devem ganhar 50-100 g por semana. É importante que os coelhos são alojados individualmente em gaiolas com bastante espaço, luz e enriquecimento ambiental (Figura 2), e é realizada uma verificação diária dos animais. Também em uma base diária, ingestão de comida e bebida deve ser supervisionado e registrado, para atingir o ganho de peso e detectar possíveis problemas de saúde, desde que os coelhos são facilmente estressados e a resposta pode ser para parar o consumo de alimento. Além disso, desde pelotas de alto teor de gordura tendem a ser muito instável e perder consistência muito facilmente, transformando em pó que coelhos não coma, é de importância crítica para preparar as porções diárias de chow, com muito cuidado (Figura 2A). Na Figura 3A, podemos observar o comportamento de consumo de energia e suas flutuações, que variam de 250 a 815 kCal no grupo dos MetS. Na Figura 3B, a contribuição relativa das diferentes fontes de energia (comida e bebida) é retratada. Existem períodos críticos em semanas 14 e 28 porque, dada a tensão produzida por procedimentos experimentais, coelhos podem diminuir a ingestão de comida e água. A quantificação diária permite a identificação rápida deste problema, que pode ser evitado introduzindo chow control (controle de 20% de gordura, 80%) e diminuindo a solução de sacarose de 15% para 10%, ou mesmo 5%, durante 2-3 dias até animais recuperar sua normal valores de ingestão. Animais também desenvolveram a obesidade central como mostrado pelo aumento de peso, perímetro abdominal e IMC (tabela 2), que está intimamente relacionado com os fatores de risco que definem MetS3.

Figure 2
Figura 2: administração da dieta. No painel A, controlar a comida (topo) e comida de alto teor de gordura (abaixo) são descritos, mostrando as diferenças entre os dois devido a gordura adicionada. Para evitar o pó que faz de pelotas de alto teor de gordura menos palatável, é necessário usar um filtro para separar o pó da pelota de alto teor de gordura (painel A, inferior). No painel de B, podemos observar os materiais necessários para fazer a solução beber (à esquerda), e como é aconselhável fazer uma solução de distribuição no distribuidor da água. Por último, o bem-estar dos animais é muito importante, e eles devem ser alojados individualmente em gaiolas (C) com bastante espaço e luz e, se possível, enriquecimento ambiental (i.e., plataformas, brinquedos, etc.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: consumo de energia. A evolução da ingestão semanal durante as 28 semanas do período experimental é representada no painel A para controle e MetS. A ingestão relativa (em percentagem) de kCal de gordura chow e a solução de beber dos MetS animais é mostrada no painel de controle B. (n = 5), MetS (n = 6). Barras de erros: SD. Modified de Arias-Mutis et al. 19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pré-dieta Semana 14 Semana 28
Controle MetS Controle MetS Controle MetS
Peso (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Comprimento (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Altura (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Abdom. perímetro (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Comprimento da tíbia (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
IMC (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabela 2: características morfológicas. Encontramos diferenças quando se compara o controle vs MetS em semanas 14 e 28 em peso (efeito principal p = 0,003, η2 = 0,6; comparações emparelhadas na semana 14 p < 0,001 e semana 28 p < 0,001), perímetro abdominal (efeito principal p < 0,001, η2 = 0,9 pairwise comparações na semana 14 p < 0,001 e semana 28 p < 0,001) e IMC (efeito principal p = 0.016, η2 = 0.5; comparações emparelhadas na semana 14 p < 0,001 e semana 28 p < 0,001). Controle (n = 5) e MetS (n = 6). Os valores são expressos como dizer (SD). Modificado de Arias-Mutis et al. 19.

Em relação a glicemia de jejum, a resposta para o IVGTT desempenha um papel fundamental na caracterização da homeostase de glicose21. Observamos uma leve hiperglicemia na semana 14, que atinge um platô e mantém valores semelhantes na semana 28 (Figura 4A). A área sob a curva (AUC) aumenta também no grupo de MetS (Figura 4B). Mesmo que os valores de interrupção para identificar o tipo diabetes II em coelhos com base na glicemia de jejum ainda não foram reconhecidas19, com este protocolo experimental, coelhos submetidos a 28 semanas de alto teor de gordura, alimentação de alta-sacarose desenvolvido pré-diabetes com glicemia de jejum prejudicada e intolerância à glicose.

Figure 4
Figura 4: Regulamento de glicose do sangue. Os resultados da IVGTT no controle e MetS animais em semanas 14 e 28 são mostrados no painel A. A quantificação da área sob a curva (AUC) de 0 a 180 min é retratada no painel B, com uma caixa e plotagem de bigodes. Este parâmetro aumentou em MetS animais em semanas 14 e 28 contra controles (efeito principal p = 0,001, η2 = 0.5; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,001 e semana 28 p = 0,002). Controle (n = 5), MetS (n = 6). Modificado de Arias-Mutis et al. 19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Hipertensão está intimamente e diretamente relacionada com a gravidade da obesidade. Coelhos alimentados com uma dieta de alto teor de gordura, alta-sacarose por 28 semanas mostraram um aumento na pressão sistólica, diastólica e média já na semana 14 e este aumento da pressão arterial é mantido na semana 28 (Figura 5 – E). Dada a estreita relação entre a pressão arterial e IMC22, é de grande importância para garantir que os animais ganham peso progressivamente para obter um aumento significativo da pressão arterial.

Figure 5
Figura 5: alterações na pressão arterial. Painel A retrata o cateter inserido na artéria auricular. Digno de nota, dado que a veia e a artéria auricular atravessam a dentição do ouvido atentamente, é de crucial importância para diferenciá-los. Antes de canulação, é aconselhável aquecer a orelha e, após anestesia tópica, a Bata suavemente a área onde o pacote vascular é executado. A artéria tem uma espessa parede vascular e uma cor mais clara do que a veia, e pulsos de sangue podem ser observados. Painel B mostra a configuração experimental com o transdutor de pressão, que é conectado a um amplificador e grava continuamente o sinal (gravação de BP). Os painéis C e D Mostrar caixa e bigodes plotagens de pressão sistólica e diastólica em semana 14 e 28, em ambos os grupos experimentais. Pressão arterial média (mapa) é apresentado no painel de E. Encontramos diferenças ao comparar controle vs MetS em semanas 14 e 28 na sistólica (efeito principal p = 0,003, η2 = 0,4; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,029 e semana 28 p = 0,013), diastólica (efeito principal p = 0,027, η2 = 0,3; comparações emparelhadas na semana p = 0.036 14 e semana 28 p = 0,001) e mapa (efeito principal p = 0,006, η2 = 0,4; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,027 e semana 28 p = 0,001). Controle (n = 5), MetS (n = 6). Modificado de Arias-Mutis et al. 19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalmente, para avaliar o desenvolvimento dos MetS, é necessária uma avaliação das alterações em marcadores bioquímicos do plasma. Neste modelo de crônica, observamos uma alteração no perfil lipídico mais cedo como semana 14, e esta alteração manteve-se estável até a semana 28, sem novos aumentos nas diferenças. Modificações no perfil lipídico de plasma são caracterizadas pelo aumento de triglicérides e LDL, uma diminuição de HDL, e sem alterações no colesterol total em MetS animais versus controles com os dois pontos de tempo (semanas 14 e 28) (tabela 3).

Semana 14 Semana 28
Controle MetS Controle MetS
Colesterol total (mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglicerídeos (mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabela 3: avaliação da bioquímica do plasma. Encontramos diferenças quando se compara o controle vs MetS em semanas 14 e 28 no HDL (efeito principal p = 0,008, η2 = 0,3; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,006 e semana 28 p = 0.037), LDL (principal efeito p = 0.040, η2 = 0,2; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,02 8 e semana 28 p = 0,034) e triglicerídeos (principal efeito p = 0,002, η2 = 0,4; comparações emparelhadas na semana 14 p = 0,004 e semana 28 p = 0,001). Controle (n = 5) e MetS (n = 6). Os valores são expressos como dizer (SD). Modificado de Arias-Mutis et al. 19

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Discussion

O estabelecimento de um modelo experimental adequado pode fornecer um método mais consistente e confiável para estudar o desenvolvimento dos MetS, e também é necessário compreender os mecanismos básicos que sustentam os órgãos e sistemas de remodelação. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para desenvolver um modelo experimental relevante de MetS induzida por dieta e como avaliar os principais componentes do aglomerado de anormalidades metabólicas e cardiovasculares que caracterizam este modelo: obesidade central, hipertensão, intolerância à glicose e dislipidemia com baixo HDL, LDL elevado e um aumento dos níveis de TG.

Uma força principal do modelo é a capacidade de estudar a condição que precede a manifestação clínica da patologia. Na verdade, sobre alterações metabólicas, em 28 semanas animais não desenvolvem a diabetes tipo II em estavam em um estado de pré-diabetes (Figura 4). Da mesma forma, marcadores bioquímicos de plasma mostraram uma evidente alteração no perfil lipídico com aumento de LDL e TG, uma diminuição no HDL, mas sem alterações no colesterol total (tabela 3), que é um fator chave no desenvolvimento da aterosclerose. Mesmo que podemos observar um aumento na pressão sistólica, diastólica e mapa na semana 28 (Figura 5), esta pode ser considerada hipertensão moderada. Em geral, os efeitos desses marcadores metabólicos e cardiovasculares são modestos, mas este modelo pode permitir que a investigação da patologia estado antes o manifestado (e na maioria dos casos irreversíveis), permitindo assim a identificação de pré-clínicos e clínicos marcadores que podem permitir a detecção de pacientes em risco.

Além disso, ao contrário de outros MetS modelos animais (rato, rato e cão), modelos de coelhos espontânea ou transgénicos podem desenvolver todos os componentes do MetS. Curiosamente, foi relatado que a combinação dos diferentes componentes dos MetS pode amplificar o risco cardiovascular. Com efeito, a remodelação patológica produzida pela hipertensão é agravada quando mais componentes de MetS aparecem23. Este modelo experimental pode permitir o estudo dos mecanismos subjacentes, e o efeito dos diferentes componentes combinados. Além disso, dado que a dieta afeta o metabolismo de todo o corpo, o uso de um modelo induzida por dieta tem um significado importante, emulando pròxima o que acontece no humano MetS19.

A força do passado, mas não menos importante, é o equilíbrio entre a relevância e o impacto na investigação de translação e o custo económico. De um lado encontramos a suína, modelos, muito semelhantes aos seres humanos, mas muito caro em termos de tempo, recursos e custo econômico. Do outro lado, temos modelos de roedores, que são fáceis de implementar com custo muito pequeno, mas tem um menor poder de generalização. O modelo de coelho representa o ponto médio, como é flexível o suficiente para muitos tipos diferentes de estudos, evitando algumas das desvantagens de modelos animais grandes e mostra alterações hemodinâmicas e neurohumoral similares observadas em humanos MetS8, 10,19.

As seguintes limitações dos métodos descritos devem ser consideradas. Com relação a obesidade central e distribuição de gordura do corpo, o uso da ressonância magnética seria o padrão-ouro, se disponível, caso contrário, use a quantificação de gordura visceral no final das 28 semanas. Outros métodos não-invasivos para estudos longitudinais, tais como a radiografia computadorizada, seria mais adequado24. Em vez disso medimos a circunferência abdominal e IMC (tabela 2), que também têm sido usados em vários estudos em coelhos, como medida de obesidade central25,11,26. Medida do comprimento da tíbia também poderia ser mais precisa, usando ecografia ou uma radiografia da perna. A fim de estabelecer se a causa da intolerância à glicose neste modelo crônica é resistência à insulina ou produção diminuída de insulina, resistência à insulina deve ser determinada usando um teste de tolerância à insulina ou determinar os níveis de insulina de jejum.

Finalmente, a fim de melhorar o modelo, várias medidas poderiam ser tomadas. Nós provavelmente poderia ter obtido um aumento mais rápido da glicemia com a combinação de breves períodos de aloxano injeção e o alto teor de gordura, dieta alta sacarose, mas em seguida o fenótipo não poderia ser atribuído somente à dieta. Idade poderia também desempenhar um papel importante, pois muitas vezes trabalhamos com coelhos adultos jovens (4,5 meses de idade quando os animais chegaram nas instalações de animais, 12,5-13 meses de idade até ao final do protocolo experimental) e MetS ocorre aos mais velhos de idade27. Infelizmente, os coelhos mais velhos não eram comercialmente disponíveis. Seria interessante testar este modelo em animais mais velhos e observar se o fenótipo é agravado.

Os métodos apresentados aqui, para o desenvolvimento deste modelo experimental de MetS em coelhos de laboratório devem fornecer uma ferramenta valiosa para estudos com o objetivo de elucidar os mecanismos básicos subjacentes a remodelação patológico produzido por MetS em diferentes órgãos e sistemas e para obter uma compreensão desta patologia complexa. Finalmente, desde coelhos NZW são animais sedentários, este modelo induzida por dieta pode ser útil para estudar como os diferentes componentes da patologia evoluem de maneira semelhante do que ocorre em humanos MetS e pode permitir novas perspectivas para a compreensão do mecanismos fisiopatológicos envolvidos na progressão da doença, a identificação de marcadores pré-clínicos e clínicos para identificar pacientes em risco, ou mesmo o teste de novas abordagens terapêuticas para o tratamento desta patologia complexa.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372) para MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) e Instituto de Salud Carlos III-FEDER fundos (CIBERCV CB16/11/0486) FCJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
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Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
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Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/balanzas/balanza-compacta-pce-bdm.htm
Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Funnel BT Ingenieros not available Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-
FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-
CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

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Um modelo Experimental de síndrome metabólica induzida por dieta em coelho: considerações metodológicas, desenvolvimento e avaliação
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