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Un modelo Experimental del síndrome metabólico inducido por la dieta de conejo: consideraciones metodológicas, desarrollo y evaluación

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Se describen métodos para el desarrollo de un modelo experimental del síndrome metabólico inducido por la dieta (MET) en conejos con una dieta alta en grasas, alta sacarosa. Animales desarrollaron obesidad central, hipertensión leve, pre diabetes y dislipidemia, reproduciendo los principales componentes de MetS humanas. Este modelo crónico permitirá la adquisición de mecanismos subyacentes de conocimiento de la progresión de la enfermedad.

Abstract

En los últimos años, la obesidad y síndrome metabólico (MetS) se han convertido en un problema creciente de salud pública y la práctica clínica, dada su prevalencia creciente debido al aumento del sedentarismo y hábitos alimenticios poco saludables. Gracias a modelos animales, la investigación básica puede investigar los mecanismos que subyacen a procesos patológicos como el MetS. Aquí, describimos los métodos utilizados para desarrollar un modelo de conejo experimental de MetS inducida por la dieta y su evaluación. Después de un período de aclimatación, animales son alimentados con un alto contenido de grasa (10% hidrogenada el aceite de coco y manteca de cerdo de 5%), alta sacarosa (15% de sacarosa disuelta en agua) dieta durante 28 semanas. Durante este período, se realizaron varios procedimientos experimentales para evaluar los diferentes componentes del MetS: morfológicas y mediciones de la presión arterial, determinación de tolerancia de glucosa y el análisis de varios marcadores de plasma. Al final del periodo experimental, animales desarrolladas obesidad central, hipertensión leve, la prediabetes y dislipidemia con un aumento de los niveles de triglicéridos (TG), HDL bajo y LDL alto, reproduciendo los principales componentes de MetS humanas. Este modelo crónica permite nuevas perspectivas para la comprensión de los mecanismos subyacentes en la progresión de la enfermedad, la detección de marcadores preclínicos y clínicos que permite la identificación de pacientes en riesgo, o incluso la prueba de nuevas terapéuticas enfoques para el tratamiento de esta compleja patología.

Introduction

Obesidad y síndrome metabólico (MetS) se han convertido en un problema creciente de salud pública y la práctica clínica, dada su creciente prevalencia debido al auge del estilo de vida sedentario y de hábitos alimenticios poco saludables1. Hay varias definiciones de MetS, pero la mayoría de ellos lo describen como un grupo de alteraciones cardiovasculares y metabólicas como obesidad abdominal, disminución de HDL y colesterol LDL elevado, triglicéridos elevados, intolerancia a la glucosa y la hipertensión2 ,3,4. La diagnosis requiere que tres de estos cinco criterios están presentes.

Debido a modelos animales, la investigación básica ha sido capaz de investigar los mecanismos que subyacen a procesos patológicos como el MetS. Se han utilizado varios modelos animales, pero es de vital importancia que el modelo reproduce las principales manifestaciones clínicas de la patología humana (figura 1). Con este objetivo, se han desarrollado modelos animales considerados similares a los seres humanos, principalmente caninos y porcinos, (véase Verkest5 y Zhang & Lerman6 para revisión). Sin embargo, modelos caninos no muestran todos los componentes de MetS, dado que el desarrollo de ateroesclerosis o hiperglucemia en perros mediante la dieta es cuestionable5. Porcina modelos presentan la semejanza más anatómica y fisiológica de los seres humanos y así ofrecen poder de predicción significativo para dilucidar los mecanismos subyacentes a MetS, pero su mantenimiento y la complejidad de los procedimientos experimentales hacen uso de este trabajo muy intensivo y costoso modelo6.

Por otro lado, modelos de roedores (ratón y rata), dieta inducida espontánea y transgénicos, se han utilizado en la literatura para el estudio de la obesidad, hipertensión y MetS y sus consecuencias patológicas en diferentes órganos y sistemas (véase Wong et al. 7 para su revisión). Aunque el uso de estos modelos es más asequible que el canino o porcina, tienen desventajas importantes. De hecho, dependiendo de la cepa, los animales desarrollan algunos componentes de los MetS, mientras que otros como la hipertensión, la hiperglucemia y la hiperinsulinemia son ausente7. Además, uno de los principales componentes de MetS, la obesidad, en algunas cepas genéticamente modificadas, no sólo depende de factores asociados con la dieta, más bien se ha demostrado que algunos animales se convierten en obesos con comida normal o aún reducida ingesta8. Finalmente, las ratas y ratones muestran una natural deficiencia en la proteína de transferencia de éster de colesterol (CETP) y usan HDL como el principal medio de transporte de colesterol, que los hace relativamente resistente al desarrollo de la aterosclerosis. Esta es una diferencia importante en el metabolismo lipídico con los seres humanos, que expresan CETP y transportar el colesterol en LDL9.

Por el contrario, el conejo de laboratorio representa una etapa intermedia entre el animal más grande y modelos experimentales de roedores. Así, el conejo puede presentarse fácilmente a diferentes tipos de protocolos con mínimas necesidades de personal y mantenimiento, siendo más fácilmente manejado en procedimientos experimentales que los modelos animales más grandes. Además, se ha informado de que los conejos alimentados con una dieta alta en grasas tienen similares cambios hemodinámicos y neurohumoral como seres humanos obesos8,10,11. De nota, acerca del metabolismo de los lípidos, el conejo tiene abundante CETP en plasma y su perfil de lipoproteína LDL ricos12, que es también similar a los seres humanos. Además, conejos desarrollan hiperlipidemia muy rápidamente ya que, como herbívoros, son muy sensibles a la grasa dietética13.

Figure 1
Figura 1: comparación de modelos animales MetS. Verkest5, Zhang y Lerman6y Wong et al. 7 para su revisión. "Equation 1" indica una ventaja y "Equation 2" indica una situación de desventaja. *controversial, depende el estudio, *como fuera por Carroll et al. 8, algunas cepas genéticamente modificadas se convierten en obesos independientemente de la ingestión de alimentos. CEPT: proteína de transferencia acumulación de colesteril éster. GTT: prueba de tolerancia a glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para aclarar los mecanismos básicos subyacentes a la remodelación patológica producen por MetS en los diferentes órganos y sistemas y para comprender esta patología compleja, la elección de un modelo experimental que reproduce los principales componentes de MetS de humano es esencial. El conejo puede proporcionar muchas ventajas dadas su similitud con la fisiología humana y la asequibilidad de uso en protocolos de crónica y las medidas. En esta línea, algunos modelos de conejo inducida por la dieta con dieta alta en grasa y sacarosa de alta han sido utilizados14,15,16,17,18,19 (tabla 1) y un caracterización de los diferentes componentes de los MetS es de gran importancia cuando relacionados con un fenotipo con remodelación del órgano. Por lo tanto, objetivo principal de este artículo es describir los métodos para desarrollar un modelo de MetS inducida por dieta en conejos que permite el estudio de su fisiopatología y repercusiones en la remodelación del órgano.

Estudio Dieta Duración Raza Componentes de MetS
OB HT HG DL
Yin et al., (2002)14 ·    10% de grasa 24 semanas ·      NZB masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37% de sacarosa ·      2 kg
Zhao et al., (2007)15 ·    10% de grasa 36 semanas ·      Hombre JW Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30% de sacarosa ·      16 semanas
Helfestein et al (2011)16 ·    10% de grasa 24 semanas ·      NZB masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    sacarosa al 40% ·      12 semanas
·    0.5-0.1 colesterol
Ning et al., (2015)17 ·    10% de grasa 8-16 semanas ·      WHHL masculino Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30% fructosa * ·      12 semanas
Liu et al., (2016)18 ·    10% de grasa 48 semanas ·      NZB masculino Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30% de sacarosa ·      12 semanas
Mutis de Arias et al., (2017)19 ·    15% de grasa 28 semanas ·      NZB masculino Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabla 1: MetS inducida por la dieta del conejo modelos con alto contenido de grasa dieta alta sacarosa. El símbolo "Equation 2"indica ausencia,"Equation 1" presencia, y "-" no evaluado. * restringido. WHHL, Watanabe hiperlipidemic hereditarios conejos. JW, conejos blancos japoneses. OB, obesidad. HT, hipertensión. HG, hiperglucemia. DL, dislipidemia.

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Protocol

Cuidado de los animales y los protocolos experimentales utilizados en este estudio cumplen con UE Directiva 2010/63 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y fueron aprobados por el Comité de uso (2015/VSC/guisante/00049) y atención institucional del Animal.

Nota: El protocolo consiste en la administración crónica de una dieta alta en grasas, alta sacarosa durante 28 semanas y la evaluación de los componentes principales de los MetS. Se utilizaron 11 adultos machos Nueva Zelanda blanco (NZB) conejos 4.39 ± 0.14 (s.d.) kg, que eran 20-22 semanas de edad al inicio del protocolo experimental. Fueron alojados en una habitación con humedad (50 ± 5%) y ciclo de las condiciones de regulación de temperatura (20 ± 1,5 ° C) con una luz de 12 h. Las palabras "chow" y "dieta" puede utilizarse indistintamente en los pasos del protocolo.

1. dieta administración

  1. Obtener o preparar las dietas
    1. Obtener una disponible comercialmente dieta alta en grasas con aceite de coco hidrogenado añadido (10%) y manteca de cerdo (5%)19. Esta dieta proporciona 3,7 kcal·g-1.
    2. Preparar soluciones de sacarosa de 5 a 15% disolviendo las cantidades apropiadas de sacarosa en agua esterilizada (p. ej., uso 300 g de sacarosa en 2 L de caldo por una solución de sacarosa de 15%). Una solución de 15% proporcionará kcal·mL 0.6-1.
    3. Obtener un comercialmente disponibles control dieta19, que proporciona 2.7 kcal·g-1.
  2. Aclimatar a los animales durante 4 semanas
    1. Alimentación de cada animal en el grupo control 120 g de dieta de control diario. Proporcionar agua ad libitum.
    2. Alimentar animales en MetS chow de 250 g de grupo a partir de un control de 50% y 50% chow de alto contenido de grasa, aumentando progresivamente a chow de grasas 100% por el fin de semana 4.
      Nota: El objetivo sería lograr: (i) control del 35% y 65% grasas chow por el fin de semana 1; (ii) control 25% y 75% grasas chow por el fin de semana 2; (iii) 15% control y 85% chow de alto contenido de grasa al final de la semana 3. (iv) 100% chow de alto contenido de grasa al final de la semana 4.
    3. Dar animales en los MetS de agua con 5% de sacarosa en el inicio del grupo y aumentar la concentración de sacarosa al 15% a finales dela semana 4 .
    4. Registro de la ingesta diaria de chow y sacarosa solución para calcular la ingesta calórica según los valores proporcionados en 1.1.1. y 1.1.2.
  3. Inducir a MetS (28 semanas)
    1. Alimentar a cada animal en el grupo de control 120 g de control chow y agua ad libitum diario.
    2. Alimentación de los animales en el grupo de MetS 250 g de grasa chow y el 15% de sacarosa en agua. Chow de reemplazar todos los días y la solución de sacarosa cada tercer día.
    3. Sopese los restantes chow y agua todos los días para estimar la ingesta diaria.

2. morfológica evaluación

  1. Medida peso corporal del animal sobre una base semanal.
  2. Medir la altura, longitud, contorno abdominaly longitud tibialy estimar el Índice de masa corporal antes de la administración de la dieta experimental y a las semanas 14 y 28 en animales anestesiados.
    1. Canule la vena marginal de la oreja derecha con un catéter estéril desechable (18-22 G) e inyecte el propofol (8 mgkg-1) seguido de 1,5 mL de solución de NaCl al 0,9%. En el conejo anestesiado, realizar las mediciones enumeradas los pasos posteriores.
    2. Mida la altura y longitud. Usando medición de cinta, mida y anote la distancia desde la nariz hasta el talón en posición de decúbito lateral (de longitud). En la misma posición, tomar la distancia entre el acromion en el hombro y la punta de la pata (altura).
    3. Calcular índice de masa (IMC) de cuerpo20 como peso corporal (kg) · [longitud (m) x estatura (m)] -1.
    4. Coloque la cinta métrica suavemente alrededor del contorno abdominal y realizar una medición con el animal en posición supina.
    5. Medir la longitud tibial de la parte inferior de la articulación de la rodilla a la inserción del tendón de Aquiles.

3. en ayunas glicemia y prueba de tolerancia de glucosa intravenosa (IVGTT)

Nota: Es aconsejable comenzar los procedimientos de la misma hora del día (es decir, 2-15:00).

  1. Preparar una solución stock de glucosa (60%) con 60 g de glucosa en 100 mL de solución de NaCl al 0,9%.
  2. Rápido el animal para 7 h retirar alimentos y mantenimiento de agua, luego colocar el conejo consciente en un limitador en la posición propensa. Preparar el medidor de glucosa (insertar una nueva tira en el medidor) y tomar la primera muestra de la vena marginal de la oreja izquierda utilizando una lanceta para obtener una gota de sangre. Luego toque la gota de sangre con las prueba de tira y medir los niveles de glucemia utilizando el medidor de glucosa para determinar glicemia ayuna.
  3. Canule la vena marginal de la oreja derecha con un catéter desechable (18-22 G) e inyectar un bolo de una solución de glucosa de 60% (0.6 g·kg-1).
    Nota: Para preparar el bolo, añadir 1 mL/kg de la acción de la glucosa.
  4. Tomar muestras de sangre con la lanceta (una gota de sangre) en 15, 30, 60, 90, 120 y 180 min después de la inyección de glucosa y analizarlos con el medidor de glucosa como en 3.2.
  5. Retire el catéter desechable y pellizque el sitio de inserción del catéter con una gasa. Una vez que la sangre ha coagulado, retire la gasa y comprobar el estado del animal.

4. presión arterial

  1. Preparar el sistema de adquisición como un transductor de presión, una jeringa de 10 mL con 0.9% NaCl, una llave de tres vías, un amplificador y un PC/portátil con el software de adquisición (para la grabación de la presión arterial).
  2. Configurar el equipo. En primer lugar, coloque la llave de tres vías y la jeringa en el transductor de presión, entre el transductor y el catéter y conectar el transductor de presión del amplificador. Luego conecte el amplificador a la PC/laptop.
  3. Realizar la calibración del transductor de presión según las recomendaciones del fabricante.
  4. Coloque el animal consciente en un limitador de conejo en la posición propensa. Calentar la oreja antes de la canulación, luego por vía tópica se aplica un anestésico local (lidocaína/prilocaína de 2,5%) en el oído alrededor del sitio de inserción. Golpee suavemente la zona donde se ejecuta el paquete vascular para identificar fácilmente la arteria. Entonces inserta un catéter estéril (18-22 G) en la arteria central de la oreja izquierda. Afloje las restricciones y permitir que el animal permanezca tranquilo durante 30 minutos.
  5. Registrar la presión arterial continuamente por 20 min directamente del catéter arterial, colocar el transductor de presión ubicado el animal al nivel del corazón (frecuencia de muestreo: 1 KHz, ver figura 5B).
    Nota: Para mantener la presión arterial (PA) grabación libre de la interferencia de la coagulación de sangre (señal de BP pierde amplitud o desaparece), debe realizarse una inyección de NaCl (0,9%). Usando la llave de tres vías, cerrar el circuito que va desde el transductor a la sonda, abre el circuito que va desde la jeringa al catéter e inyectar 1-2 mL. Esto elimina coágulos de sangre que se puede formar en el catéter. Luego, abrir el circuito entre el transductor y el catéter y seguir la grabación una vez que la señal se ha recuperado.
  6. Una vez terminada la grabación, extraiga el catéter y pellizcar con una gasa en el sitio de inserción de catéter para detener la pérdida de sangre. Una vez que la sangre ha coagulado, retire la gasa y comprobar el estado del animal.

5. plasma medidas

Nota: Es aconsejable comenzar los procedimientos de la misma hora del día (es decir, 2-15:00).

  1. Rápido el animal para 7 h retirar alimentos y mantenimiento de agua, luego colocar el animal consciente en un limitador en la posición prona e insertar una aguja de 21 G estéril en la vena marginal de la oreja izquierda. Una vez que la sangre comience a gotear, deseche la primera gota y recoger las muestras de sangre en tubos con EDTA hasta el nivel indicado en el tubo. Almacenar las muestras en hielo.
  2. Centrifugar las muestras de sangre en 1.500 x g, 15 min, 4 ° C. Después de la centrifugación, el plasma con una pipeta de succión y preparar alícuotas de 250 μl.
  3. Analizar inmediatamente las muestras frescas. Parámetros de control básico son los siguientes: triglicéridos, colesterol total, HDL y LDL colesterol.
    Nota: Las muestras analizadas no recién deben almacenarse inmediatamente en un congelador de-80 ° C. Si está interesado en el análisis de glucosa en la sangre de las muestras de plasma, la prueba de la glucosa de la sangre debe utilizar tubos con oxalato del fluoruro en vez de EDTA.

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Representative Results

MetS representa un conjunto de anormalidades metabólicas y cardiovasculares, cuyo estudio puede facilitarse mediante el uso de modelos experimentales. De hecho, para aclarar los mecanismos subyacentes a la remodelación patológica producida por MetS, la elección de un modelo experimental que apropiadamente se asemeja a la condición humana y es conveniente para la investigación es de importancia crucial. Aquí, presentamos los métodos para inducir a MetS en conejos con una dieta alta en grasas saturadas, sacarosa y una caracterización detallada para su evaluación. El uso de dieta en lugar de un modelo animal transgénico es de gran importancia ya que la dieta afecta el metabolismo de todo el cuerpo19, así asemejándose a estrechamente lo que ocurre en humanos MetS. Se utilizó un factorial (modelo mixto) ANOVA con dos factores, uno de medidas repetidas o "dentro" factor (tiempo: pre, semana 14 y la 28, dependiendo del análisis) y un "entre" factor (Grupo: control y MetS) para el análisis estadístico. Significado fue aceptado cuando p < 0.05.

La dieta alta en grasas, alta sacarosa es bien tolerada por los animales. Un período de aclimatación de 4 semanas es necesario para la correcta transición desde el anterior régimen de alimentación a la dieta alta en grasas, alta sacarosa. Animales en el grupo de control se alimentan chow 120 g, que ha demostrado ser apropiado para el mantenimiento del conejo adulto8. Conejos en el grupo de MetS aumentaron progresivamente de peso hasta el final del protocolo experimental (tabla 2). Animales deben tener 50-100 g por semana. Es importante que los conejos se alojaron individualmente en jaulas con suficiente espacio, la luz y el enriquecimiento ambiental (figura 2), y se realiza una comprobación diaria de los animales. También sobre una base diaria, chow y bebida la ingesta debe supervisada y registrada, con el fin de lograr la ganancia de peso y detectar problemas de salud posible, ya que los conejos se estresan fácilmente y puede ser la respuesta detener el consumo de alimento. Además, puesto que las pelotillas de alto grado en grasas tienden a ser muy inestable y pierde consistencia muy fácilmente, convirtiéndose en polvo que los conejos no comen, es de vital importancia para preparar las porciones diarias de chow muy cuidadosamente (figura 2A). En la Figura 3A, se observa el comportamiento de consumo de energía y sus fluctuaciones, que van desde 250 hasta 815 kCal en el grupo de MetS. En la figura 3B, se muestra la contribución relativa de las diferentes fuentes de energía (chow y bebida). Hay períodos críticos en las semanas 14 y 28 porque, dado el estrés producido por procedimientos experimentales, conejos podrían disminuir la ingesta de agua y chow. La cuantificación diaria permite la identificación rápida de este problema que puede evitarse mediante la introducción de chow de control (control de 20% de grasas, 80%) y disminución de la solución de sacarosa de 15% a 10%, o incluso 5%, durante 2-3 días hasta animales recupera su normal valores de entrada. Animales también desarrollaron obesidad central como se muestra en el aumento de peso, perímetro abdominal y el IMC (tabla 2), que está estrechamente relacionada con los factores de riesgo que definen MetS3.

Figure 2
Figura 2: administración de la dieta. En el panel A, control de chow (arriba) y high-fat chow (abajo) se representan, mostrando las diferencias entre los dos debido a la grasa. Para evitar el polvo que hace pelotillas de alto grado en grasas menos aceptable, es necesario utilizar un colador para separar polvo de pellets de alto contenido de grasa (Panel A, abajo). En el panel B, podemos observar los materiales necesarios para hacer la solución potable (izquierda), y cómo es conveniente realizar una solución madre para distribuir en el dispensador de agua. Por último, el bienestar de los animales es muy importante, y deben ser alojados individualmente en jaulas (C) con suficiente espacio y luz y, si es posible, enriquecimiento ambiental (es decir, plataformas, juguetes, etc.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: consumo de energía. La evolución de la ingesta semanal durante las 28 semanas del período experimental se representa en el panel A para el control y los MetS. La ingesta relativa (en porcentaje) de kCal de chow de alto contenido de grasa y la solución de beber de los MetS animales se muestra en el panel B. Control (n = 5), MetS (n = 6). Barras de error: SD. modificado de Arias Mutis et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Pre-dieta Semana 14 Semana 28
Control MetS de Control MetS de Control MetS de
Peso (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Longitud (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Altura (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Alteración. perímetro (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Longitud tibial (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
IMC (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabla 2: características morfológicas. Se encontraron diferencias al comparar control vs MetS en las semanas 14 y 28 en el peso (efecto principal p = 0.003, η2 = 0,6; comparaciones de pares en la semana 14 p < 0.001 y semana 28 p < 0,001), perímetro abdominal (efecto principal p < 0.001, η2 = 0.9 pairwise comparaciones en la semana 14 p < 0.001 y semana 28 p < 0.001) y el IMC (principal efecto p = 0.016, η2 = 0,5; comparaciones de pares en la semana 14 p < 0.001 y semana 28 p < 0.001). Control (n = 5) y MetS (n = 6). Los valores se expresan como media (SD). Modificada de Arias Mutis et al. 19.

Con respecto a la glucemia en ayunas, la respuesta a la IVGTT desempeña un papel clave en la caracterización de glucosa homeostasis21. Se observa hiperglucemia leve en la semana 14, que alcanza una meseta y mantiene valores similares en la semana 28 (Figura 4A). El área bajo la curva (AUC) también aumenta en el grupo de MetS (Figura 4B). A pesar de que los valores límite para identificar el tipo diabetes II en conejos basado en la glucemia en ayunas aún no han sido reconocidas19, con este protocolo experimental, conejos sometidos a 28 semanas de alto grado en grasas, alta sacarosa alimentación desarrollado prediabetes con problemas de glucosa en ayunas y la intolerancia a la glucosa.

Figure 4
Figura 4: regulación de la glucosa de la sangre. Los resultados de la IVGTT en control y los MetS animales en las semanas 14 y 28 se muestran en el panel A. La cuantificación del área bajo la curva (AUC) de 0 a 180 min es representada en el grupo B con una caja y bigotes de parcela. Este parámetro aumentó en MetS animales en las semanas 14 y 28 versus controles (principal efecto p = 0.001, η2 = 0,5; comparaciones de pares en la semana 14 p = 0.001 y semana 28 p = 0.002). Control (n = 5), MetS (n = 6). Modificada de Arias Mutis et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La hipertensión está estrecha y directamente relacionado con la severidad de la obesidad. Conejos alimentan con una dieta alta en grasas, alta sacarosa durante 28 semanas mostró un aumento en la presión arterial sistólica, diastólica y media, ya en la semana 14 y este aumento en la presión arterial se mantiene en la semana 28 (figura 5 – E). Dada la estrecha relación entre la presión arterial y el IMC de22, es de gran importancia para asegurar que los animales ganan peso progresivamente para obtener un aumento significativo en la presión arterial.

Figure 5
Figura 5: modificaciones en la presión arterial. Panel A muestra el catéter insertado en la arteria auricular. De la nota, dado que la vena y la arteria auricular recorren la dentición de la oreja muy de cerca, es de vital importancia para diferenciarlos. Antes de la canulación, es recomendable calentar la oreja y, después de la anestesia tópica, golpear suavemente la zona donde se ejecuta el paquete vascular. La arteria tiene una pared vascular más gruesa y un color más claro que la vena, y se observan pulsos de la sangre. Panel B muestra la configuración experimental con el transductor de presión, que está conectado a un amplificador y registra continuamente la señal (grabación de BP). Los paneles C y D Mostrar parcelas caja y bigotes de la presión arterial sistólica y diastólica en la semana 14 y 28 en ambos grupos experimentales. Presión arterial mala (mapa) se presenta en el grupo E. Se encontraron diferencias al comparar control vs MetS en las semanas 14 y 28 en sistólica (principal efecto p = 0.003, η2 = 0.4; comparaciones de pares en la semana 14 p = 0,029 y semana 28 p = 0.013), diastólica (principal efecto p = 0.027, η2 = 0,3; pares comparaciones en la semana 14 p = 0.036 y semana 28 p = 0.001) y mapa (principal efecto p = 0.006, η2 = 0,4; comparaciones de pares en la semana 14 p = 0.027 y semana 28 p = 0.001). Control (n = 5), MetS (n = 6). Modificada de Arias Mutis et al. 19 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, para evaluar el desarrollo de los MetS, se necesita una evaluación de los cambios en los marcadores bioquímicos del plasma. En este modelo de crónica, se observó una alteración en el perfil de lípidos tan temprano como la semana 14, y esta alteración se mantuvo estable hasta la semana 28, sin nuevos aumentos en las diferencias. Modificaciones en el perfil lipídico plasmático se caracterizan por un aumento de triglicéridos y de LDL, una disminución en HDL, y no hay cambios en el colesterol total en los MetS animales versus controles en ambos puntos temporales (semanas 14-28) (tabla 3).

Semana 14 Semana 28
Control MetS de Control MetS de
Colesterol total (mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglicéridos (mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabla 3: evaluación de la bioquímica del plasma de. Se encontraron diferencias al comparar control vs MetS en las semanas 14 y 28 en HDL (principal efecto p = 0.008, η2 = 0,3; pares comparaciones en la semana 14 p = 0.006 y semana 28 p = 0,037), LDL (principal efecto p = 0.040, η2 = 0.2; pares comparaciones en la semana 14 p = 0.02 8 y la semana 28 p = 0.034) y los triglicéridos (principal efecto p = 0.002, η2 = 0.4; pares comparaciones en la semana 14 p = 0.004 y la semana 28 p = 0.001). Control (n = 5) y MetS (n = 6). Los valores se expresan como media (SD). Modificada de Arias Mutis et al. 19

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Discussion

El establecimiento de un modelo experimental adecuado puede proporcionar un método más consistente y fiable para estudiar el desarrollo de los MetS, y también es necesario entender los mecanismos básicos que subyacen a los órganos y sistemas de remodelación. Aquí, describimos los métodos utilizados para desarrollar un modelo experimental relevante de MetS inducida por la dieta y cómo evaluar los principales componentes de este grupo de anormalidades metabólicas y cardiovasculares que caracterizan a este modelo: obesidad central, hipertensión, intolerancia a la glucosa y dislipidemia con HDL bajo, LDL alto y un aumento de los niveles de TG.

Una fuerza importante del modelo es la capacidad para el estudio de la condición que precede a la manifestación clínica de la patología. De hecho, con respecto a cambios metabólicos, en 28 semanas animales no desarrollaron tipo diabetes II y estaban en un estado de prediabetes (figura 4). Semejantemente, marcadores bioquímicos del plasma demostraron una evidente alteración en el perfil lipídico, con aumento de LDL y TG, una disminución en HDL, pero no hay cambios en el colesterol total (tabla 3), que es un factor clave en el desarrollo de la aterosclerosis. Aunque podemos observar un aumento en la sistólica, diastólica y mapa en la semana 28 (figura 5), esto se puede considerar hipertensión leve. En general, los efectos en los marcadores metabólicos y cardiovasculares son modestos, pero este modelo puede permitir la investigación de la patología del estado antes del se manifiesta (y en muchos casos irreversibles), permitiendo la identificación de preclínica y clínica marcadores que podrían permitir la detección de pacientes en riesgo.

Además, a diferencia de otros MetS modelos animales (ratón, rata y perro), modelos de conejos transgénicos o espontánea pueden desarrollar todos los componentes de los MetS. Curiosamente, se ha reportado que la combinación de los diferentes componentes del MetS puede amplificar el riesgo cardiovascular. De hecho, la remodelación patológica producida por la hipertensión se agrava cuando más componentes de MetS aparecen23. Este modelo experimental podría permitir el estudio de los mecanismos subyacentes, y el efecto de los diferentes componentes combinados. Además, dado que la dieta afecta el metabolismo de todo el cuerpo, el uso de un modelo inducido por la dieta tiene gran importancia, emulando de cerca lo que ocurre en humanos MetS19.

La fuerza del pasado, pero no menos importante, es el equilibrio entre la relevancia y el impacto en investigación aplicada y el coste económico. Por un lado encontramos los cerdos modelos, muy similares a los seres humanos, pero muy caro en términos de tiempo, recursos y costo económico. En el otro lado, tenemos modelos de roedores, que son fáciles de implementar con muy poco coste, pero tienen un menor poder de generalización. El modelo de conejo representa el punto medio, ya que es lo suficientemente flexible como para diferentes tipos de estudios evitando algunos de los inconvenientes de los modelos animales grandes y muestra similares cambios hemodinámicos y neurohumoral, observados en humanos MetS8, 10,19.

Deben considerarse las siguientes limitaciones de los métodos descritos. Con respecto a la obesidad central y distribución de la grasa corporal, el uso de la proyección de imagen de resonancia magnética sería el patrón oro, si está disponible, de lo contrario usar la cuantificación de grasa visceral en el final de las 28 semanas. Otros métodos no invasivos para estudios longitudinales, tales como radiografía de la tomografía computada, sería más adecuado24. En su lugar medimos circunferencia abdominal e IMC (tabla 2), que también se han utilizado en varios estudios en conejos como una medida de obesidad central25,11,26. Medida de la longitud tibial también podría ser más precisa mediante ecografía o una radiografía de la pierna. Con el fin de establecer si la causa de la intolerancia a la glucosa en este modelo de crónica es resistencia a la insulina o producción disminuida de la insulina, resistencia a la insulina debe determinarse mediante una prueba de tolerancia a insulina o determinar niveles de insulina en ayunas.

Por último, con el fin de mejorar el modelo, podrían adoptarse varias medidas. Probablemente podríamos haber obtenido un aumento más rápido de la glucemia con la combinación de períodos breves de alloxan inyección y el alto grado en grasas, dieta alta sacarosa, pero entonces el fenotipo no se podía atribuir solamente a la dieta. Edad podría jugar también un papel importante, ya que trabajamos con conejos adultos jóvenes (4,5 meses de edad cuando los animales llegaron a las instalaciones animales, 12.5-13 meses de edad al final del protocolo experimental) y MetS a menudo ocurre en mayores de edad27. Desafortunadamente, conejos más viejos no estaban disponibles comercialmente. Sería interesante probar este modelo en animales más viejos y observar si el fenotipo se agrava.

Los métodos aquí presentados para el desarrollo de este modelo experimental de MetS en conejos de laboratorio deben proporcionar una herramienta valiosa para los estudios con el objetivo de aclarar los mecanismos básicos subyacentes a la remodelación patológica producida por MetS en las distintas órganos y sistemas y para comprender esta compleja patología. Por último, desde NZB los conejos son animales sedentarios, este modelo inducida por la dieta puede ser útil para el estudio de cómo los diferentes componentes de la patología evolucionan de manera similar que ocurre en humanos MetS y podría permitir nuevas perspectivas para la comprensión del mecanismos fisiopatológicos implicados en la progresión de la enfermedad, la identificación de marcadores clínicos y preclínicos para identificar a pacientes en riesgo, o incluso la prueba de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de esta compleja patología.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372) a MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) y el Instituto de Salud Carlos III-FEDER fondos (CB16/11 CIBERCV/0486) FJC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
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Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
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Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
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Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
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Funnel BT Ingenieros not available Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-
FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
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Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
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CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
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Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

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Medicina número 134 síndrome metabólico modelos animales conejo enfermedades cardiovasculares presión arterial tolerancia a la glucosa
Un modelo Experimental del síndrome metabólico inducido por la dieta de conejo: consideraciones metodológicas, desarrollo y evaluación
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Arias-Mutis, Ó. J., Genovés,… More

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