Summary
Här beskriver vi kirurgiska ingrepp för att producera en tillförlitlig ryggmärg laterala hemisection (HX) på9: e bröst nivå i vuxna råttor och neurobehavioral bedömningar avsedda för att upptäcka asymmetriska underskott efter en sådan ensidig skada.
Abstract
Ofullständig ryggmärgsskada (SCI) leder ofta till försämringar av sensorimotoriska funktioner och är kliniskt den vanligaste typen av SCI. Human Brown-Séquard syndrom är en vanlig typ av ofullständig SCI orsakas av en lesion till hälften av ryggmärgen som resulterar i förlamning och förlust av proprioception på samma (eller ipsilesional) sida som skadan, och förlust av smärta och temperatur känsla på motsatt (eller preventivmedel) sida. Adekvata metoder för att producera en ryggmärg laterala hemisection (HX) och bedöma neurologiska funktionsnedsättningar är nödvändiga för att fastställa en tillförlitlig djurmodell av Brown-Séquard syndrom. Även om laterala hemisection modellen spelar en central roll i grundläggande och translationell forskning, standardiserade protokoll för att skapa en sådan hemisection och bedöma ensidiga funktion saknas. Målet med denna studie är att beskriva steg-för-steg förfaranden för att producera en råtta spinal laterala HX på9: e bröst (T9) vertebral nivå. Vi beskriver sedan en kombinerad beteende skala för HX (CBS-HX) som ger en enkel och känslig bedömning av asymmetriska neurologiska prestanda för ensidiga SCI. CBS-HX, från 0 till 18, består av 4 individuella bedömningar som inkluderar ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling, kontakt placering, och rutnät promenader. För CBS-HX bedöms de ensidig och kontralaterala bakbenen separat. Vi fann att, efter en T9 HX, visade ensidig hindlimb nedsatt beteende funktion medan kontralateral hindlimb visade betydande återhämtning. CBS-HX diskriminerande effektivt beteendemässiga funktioner mellan ensidig och kontralateral hindlimbs och upptäckta tidsmässiga progression av återvinning av ensidig hindlimb. CBS-HX-komponenterna kan analyseras separat eller i kombination med andra åtgärder vid behov. Även om vi endast lämnat visuella beskrivningar av kirurgiska ingrepp och beteendemässiga bedömningar av en bröst HX, kan principen tillämpas på andra ofullständiga SFI och på andra nivåer av skadan.
Introduction
De ofullständiga ryggmärgsskadorna (SCI) leder ofta till allvarliga och ihållande funktionsnedsättningar av sensorimotoriska funktioner och är kliniskt den vanligaste typen av SCI1. Brown-Séquard syndrom hos människor orsakas av en lesion till hälften av ryggmärgen som resulterar i förlamning och förlust av proprioception på samma (eller ipsilesional) sida som skadan, och förlust av smärta och temperatur känsla på motsatt (eller kontralesional) sida2,3,4. Spinal laterala hemisection djurmodeller används i stort sett för att efterlikna mänskliga Brown-Séquard syndrom och de har rapporterats hos råttor5,,6,7,8,9, opossums10, och apor7,11,12,13 av olika laboratorier på olika spinal nivåer. Detaljerade visualiserade procedurer för att producera en standard lateral hemisection har dock inte beskrivits. Att tillhandahålla steg-för-steg-förfaranden för en lateral hemisection bör optimera modellen och underlätta jämförelse eller replikering av experimentella resultat i grundläggande och translationell forskning.
En ensidig SCI producerar asymmetriska och oproportionella beteende underskott som är svåra att mäta med konventionella bedömningar för symmetriska skador. En lämplig metod för att bedöma neurologiska funktionsnedsättningar för en ensidig SCI är en viktig del av utvecklingen av en ensidig SCI-modell. Trots den centrala roll en ensidig spinal skada, standardiserade protokoll för att utvärdera sensorimotor underskott hos djur med en sådan skada saknas. Den Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) rörelse klassning skala har varit den mest använda mätning av funktionen efter SCI för vuxna råttor 14 som ger en semiquantitative beskrivning av förflyttning som helhet. Den mäter dock inte varje bakben oberoende av varandra.
I denna studie rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att producera en gnagare spinal HX vid9: e bröst (T9) vertebral nivå. Vi introducerar också en kombinerad beteende skala för hemisection (CBS-HX) som inkluderar ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling, placering kontakt och rutnät promenader bedömningar för utvärdering neurologiska nedskrivningar och återvinning efter en ensidig SCI. Vi hoppas att denna modell kommer att vara en användbar modell för att undersöka skademekanismer och terapeutiska effektivitetsvinster för ensidiga s.o.m.
Protocol
Alla kirurgiska och djur hantering förfaranden utfördes som godkänts enligt Guide for the Guide for care and use of Laboratory Animals (National Research Council) och riktlinjerna för Indiana University School of Medicine Institutionella Animal Care and Use Kommittén.
1. Allmän hänsyn
- Använd vuxna hondjursråttor (SD) (väger 200 g, n=12) för denna studie. Vana djur på alla testmiljöer och samla in baslinjedata för alla beteendetester en vecka före det kirurgiska ingreppet.
- Utför beteendebedömningarna av två observatörer som är förblindade för de experimentella grupperna.
2. Djurberedning
- Rengör operationsbordet med 70% etanol. Placera en förvärmd värmedyna på operationsbordet. Täck det kirurgiska området med en steril kirurgisk draperi. Placera den sterila gasväv, bomullspinnar och autoklaverade kirurgiska verktyg på ytan av den kirurgiska drapera.
- Slå på en microbead autoklav för intersurgery sterilisering av kirurgiska verktyg.
OBS: Ett exempel på de verktyg som används i detta experiment visas i figur 1. - Bedöva råttan med en intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin (87,7 mg/kg) och xyazin (12,3 mg/kg). Se till att rätt plan av anestesi nås utan svar på tå nypa stimulans. Applicera vet salva på ögonen på djuret för att förhindra hornhinnans torkning under operationen.
- Ta bort håret överliggande bröstkotorna genom rakning (Figur 2A). Ta bort den rakade pälsen med ett vakuum utrustat med ett HEPA-filter.
- Rengör operationsområdet med tre alternerande scrubs av jodbaserad scrub och etanol.
- Täck djuret med en steril drapering med en fenestration över det föreslagna snittstället (figur 2B). Anm.; I video har den kirurgiska draperiet utelämnats för demonstrationsändamål.
3. Spinal Hemisection
- Rör vid det13:e revbenet som är det lägsta revbenet i råttan och ett flytande revben som inte ansluter till bröstbenet. Följ den 13:e revbenet dorsally att identifiera dess samband med T13 kotan och sedan räkna upp för att identifiera T10 kotan.
- Använd ett skalpellblad (#15, figur 1) för att utföra ett 3- 4 cm mittlinjesmält hudsnitt på baksidan som överger de 8-11:e kotavsmåniga processerna.th
- Under ett kirurgiskt mikroskop, rakt på sak dissekera och separera paraspinala muskler i sidled från spinous processer mot fasor av T9 och T10 kotor på båda sidor med samma skalpell blad.
OBS: Detta tillvägagångssätt kommer fint reta vävnaden isär utan att orsaka blödning. - Stabilisera ryggraden med hjälp av en modifierad stabiliserande hållare. Gör en slits på båda sidor av det laterala kotbenet. Skjut de rostfria armarna under de exponerade tvärgående processaa faserna och dra åt skruvarna för att säkra stabiliteten.
- Använd ett upprullningsdon för att dra tillbaka musklerna från det kirurgiska området (figur 2B) och för att exponera T8-11 vertebral laminae och spinous processer (figur 2C).
OBS: Det finns ett stort gap mellan T8 och T9 spinous processer, som är landmärken för att identifiera T9 (Figur 2C,dorsala vyn). Från den laterala synen pekar den spinösa processen av T9-kotpunkterna caudally, T10 spinous process dorsally och T11 spinous process rostrally; så, de 3 spinous processer bildar en pyramid och T10 spinous processen utgör toppen(Figur 2D, lateral vy). - Utför en dorsal laminectomy på T9 kotan med hjälp av en rongeur. Klipp bort T9 spinous processen och ta bort en liten del av lamina vänster till mittlinjen (Figur 3A, streckad linje), och hela högra delen av lamina så i sidled som möjligt (Figur 3A, streckad linje). För laminectomy, sätt försiktigt in rongeuren under lamina och klipp en liten bit ben i taget tills en önskad region av laminectomy är klar (figur 3B och figur 3C).
- Under ett kirurgiskt mikroskop, identifiera ryggmärgens ryggmitta (figur 3C). För in en nål (30 G) vertikalt genom mittlinjen i ryggmärgen med den avfasade sidan vänd mot höger sida (bild 4A).
OBS: Nålen ska tränga in i hela ryggmärgen för att nå ryggradskanalens ventrala vägg. - Stoppa blödningen med en liten bit steril gelfoam.
- Sätt in en spets av en iridectomy/microsurgical sax genom mittlinjen nålen spår, och den andra spetsen längs den laterala ytan av den högra hemi-sladden, och sedan göra ett komplett snitt på höger hemi-sladd med saxen (Figur 4B).
OBS: Använd en vass mikrosax för ryggmärgen klippa för att minimera kompression lesion till ryggmärgen under styckningen. - Använd den laterala kanten av samma nål som en kniv för att skära igenom lesion gapet för att bekräfta en fullständig rätt hemisection. Kontrollera fullständigheten av den högra hemisection genom att visualisera botten av ryggradskanalen med kirurgiska mikroskop (Figur 4C, tvärsnittsvy; Bild 4D, lateral vy; Bild 4E, dorsal vy).
- Placera en liten bit gelatinsvamp över lesionstället (figur 4F). Använd cementblandningen och bygg en smal bro över svampen och de spinösa processerna av T8 och T10 (figur 4G, H).
OBS: Syftet med att använda en cementbro är tvåfaldigt: 1) det skiljer ärret som utvecklats vid skadeplatsen från resten av vävnaden, och 2) det gör det lättare att dissekera ryggmärgssegmentet efter djuroffer. - Sutur muskel- och hudlagren separat med 4-0 silkestråd.
- Injicera 0,9% steril saltlösning subkutant för att bibehålla hydrering. Injicera ett smärtstillande medel Buprenorfin (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/dag subkutant i 2 dagar. Tryck urinblåsan 2-3 gånger dagligen för den första veckan och 1-2 gånger under de följande veckorna tills spontana urinblåsan makulering avkastning.
4. Postoperativ djurvård
- Återlämna djuret till sin enhusbur. Ge fuktig gnagare chow eller gel på botten av buren för att underlätta i djurets förmåga att äta / återfukta. Placera en värmedyna under buren under återhämtningen efter operationen. Se till att värmedynan endast täcker halva burbotten för att undvika överhettning.
- Injicera 0,9% steril saltlösning subkutant för att bibehålla hydrering. Injicera ett smärtstillande medel Buprenorfin (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/dag subkutant i 2 dagar. Tryck urinblåsan 2-3 gånger dagligen för den första veckan och 1-2 gånger under de följande veckorna tills spontana urinblåsan makulering avkastning.
5. Bedöma den ensidiga Hemisection Stepping (UHS)
OBS: Den ensidiga hemisection stepping (UHS) test är ett direkt mått på förmågan hos SCI djur att utnyttja sina ipsilesional hindlimb i det öppna fältet. Som nämnts i 1,1, djuren var acklimatiserade till ett öppet fält miljö (diameter 42 inches) 15 två gånger om dagen i 7 dagar. Två observatörer förblindade för djurgrupperna utför testet. UHS-poäng vid både baslinjen (7 dagar före T9 HX) och tidpunkter efter skada kommer att samlas in. Bedömningsstegen beskrivs som följda.
- Placera djuret i en öppen fältmiljö och undersök djurets rörelse i 4 min.
OBS: Under testningen kan djuret uppmuntras att röra sig aktivt. - Med formuläret i tabell 1tilldelar du värdet 1 för Ja och 0 för Nej för varje beteendekategori och summerar sedan det totala värdet för att ge en slutlig UHS-poäng på 0 till 8.
OBS: Enligt tabell 1 0: ingen observerbar rörelse av hindlimb; 1 – 4: isolerade rörelser av 3 baklimbleder (höft, knä och fotled); 5: svepande utan viktstöd; 6: placering utan viktstöd; 7: placering med viktstöd; och 8: kliva med viktstöd. - Samla UHS-poäng vid både baslinjen (7 dagar före T9 HX) och tidpunkter efter skada.
POÄNGEN kommer att bedömas vid olika tidpunkter efter T9 HX.
6. Koppling
- Analysera CPL (gångkoppling) med en videoinspelning ett djur som går på en smal bana enhet eller en enkel öppen fält.
- I kopplingsavsnittet i tabell 1tilldelar du poängen 0 för "Nej", 1 för "Oregelbunden/klumpig" och 2 för "Normal" för varje CPL-kategori.
OBS: Kopplingstestet (CPL) är att utvärdera samordningen av alternerande rörelser i armar och ben, inklusive homologa CPL (främre/bakre bakre extremiteter, figur 5A), diagonal CPL (främre vänster bak högra eller främre höger-bakre vänstra extremiteter, figur 5B), och homolateral CPL (fram-bakre lemmar på samma sida, figur 5C). Efter en T9 HX blir bakbensunderskotten på den ipsilesional sidan synliga, vilket resulterar i växlingen mellan det homologa CPL(figur 5D),diagonalt CPL (figur 5E) och homolateralt CPL (figur 5F).
7. Kontakta Placering
OBS: Hindlimb kontaktplaceringstestet används för att utvärdera den motoriska integrationen av hindlimb-svar på proprioceptiva stimuli 16. Proprioception anses vara intakt om djuret steg upp med sin bakben på ytan efter hindlimb dras ner under ytan.
- Håll djuret i vertikalt läge så att båda bakbenen är tillgängliga för placeringssvaret.
- Borsta den dorsala ytan på en baklima framåt lätt mot kanten av en yta (t.ex. djurarbetsbänk).
- Observera fotplaceringen på ytan och tilldela en hindlimb kontakt placering poäng. 0: ingen placering; 1: placering.
OBS: Den dorsala ytan får stimulering och foten kommer därefter att förlänga och placera foten på ytan om reflexen är intakt. Bedömningsformuläret finns också i tabell 1.
8. Rutnät Walking
OBS: Nätet gångtest bedömer spontana motor underskott och lem rörelser inblandade i exakt steg, samordning och korrekt tass placering.
- Placera en råtta på ett upphöjt plastbelagt trådnätsgaller (36 × 38 cm med 3 cm2 öppningar) och låt den gå fritt över plattformen i 30 steg.
- Räkna det totala antalet fotsteg och antalet fotfelsteg för varje lem. Videoinspelningar görs för att bekräfta räkningen.
OBS: Två blindade observatörer bedöma tass placering av framben och hindlimbs som djur gå. - Tilldela rutnätet promenadpoäng för varje hindlimb enligt följande - 0: felsteg större än 15; 1: felsteg som är mindre än eller lika med 15. 2: felsteg som är mindre än eller lika med 10. och 3: felsteg mindre än eller lika med 5.
POÄNGbedömningen baseras på tabell 1. Cutoffs poäng används som mått på svårighetsgraden av motoriska underskott.
9. Perfusion och vävnadsbehandling
- Efter lämplig anestesi liknande i steg 2.3, granska djuren noggrant efter det transknödperfusionsprotokollet 17.
- Dissekera och samla ryggmärgsprover och efter fixera dem i 4% PFA över natten.
- Proverna kan sedan överföras till 30% sackaroslösning.
- Skär ryggmärgen i tvärsnitt och färga de valda sektionerna med en axonmarkör SMI-31 och astrocytisk markörgialfibersyrat protein (GFAP) enligt standardprocedurer18.
Representative Results
De kirurgiska ingrepp som beskrivs ovan tillåter produktion av en konsekvent och reproducerbar laterala HX vid T9. Efter perfusion och hudborttagning kunde operationsområdet vid T9 lätt identifieras genom en kvarvarande sutur (figur 6A). Ytterligare dissekering möjliggör exponering av cementbron (figur 6B) och gelatinsvamp (figur 6C) i lager. Ryggmärgen exponeras sedan för den öppnade ryggradskanalen och en lateral hemisection på höger sida bekräftas (figur 4D). Skadenivån kan bekräftas ytterligare genom dess samband med de exponerade kotkropparna och revbenen (figur 6D). Immunofluorescens färgning av ett tvärsnitt vid skada epicentrum visar en fullständig förlust av rätt hemicord och bevarandet av den vänstra hemicord kontralateral till skadan. Avsnittet färgas med en axonmarkör SMI-31 och astrocytisk markörgialfibersyrat protein (GFAP) (figur 6E).
Neurobehaviorally är CBS-HX-systemet kan upptäcka asymmetriska underskott över tiden efter en T9 HX. Efter HX förlorade den ensidig hindlimb sin förmåga att kliva medan den kontralaterala hindlimb behöll förmågan att gå. För varje beteendemått utförde vi 3 försök och använde medelvärdet av de 3 försöken för kvantifiering och analys. Vi använde förkirurgi åtgärd som en baslinje som vi anser vara den mest exakta kontrollen jämfört med att använda andra råttor. Poängen för de fyra enskilda måtten, dvs UHS, CPL, kontaktplacering och rutnätsgång kan analyseras separat (figur 7A-D) eller så kan de kombineras till en sammansatt CBS-HX (figur 7E). TvåvägsANOVA-analyser visade betydande skillnader i UHS (F = 23.199, p < 0.001), koppling (F = 8.376, p < 0,01), kontaktplacering (F = 17.672, p < 0.001), grid walking (F = 19.261, p < 0.001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0.001) mellan ipsilaterala och kontralaterala sidor. Figur 7A visar resultaten av UHS efter en T9 HX. Under de första 3 dagarna postinjury, råttor förlorade förmågan att steg och fick en poäng på 0-2 för ipsilesional hindlimb. Stegliknande rörelser började dyka upp på den ipsilesional sidan på 7-10 dagar efter skada med de flesta steg är dorsala steg. Vid 28 dag efter den T9 HX, råtta kunde ta plantar stammen med praktiskt normal koordination med en tilldelad UHS ställningen av 8. Som en jämförelse avbröts den kontralesionala bakbenet mindre och UHS-poängen sjönk inom de första 5 dagarna efter T9 HX och återgick till baslinjen efter dag 10 efter skada. För det totala CPL-testet (inklusive homolateral, homolog och diagonal koppling) minskade både samordningens stabilitet och anpassningsförmåga efter T9 HX markant (figur 7B). Vid 1-5 dagar efter skada, HX djuren visade inga tecken på CPL. Med tiden, CPL av ipsilateral hindlimb framträdde, ofta klumpig, ostadig, och olämpligt varierande i sin hastighet, kraft och riktning. Kontaktplaceringen (figur 7C) och rutnätsgång (figur 7D) av den ipsilaterala hindlimb påverkades också av T9 HX särskilt inom de första 5 dagarna efter skadan, och återhämtade sig vanligtvis när djuret började ta plantarsteg. Det sammansatta CBS-HX-systemet omfattar UHS- och CPL-provningarna för kontaktplacering och rutnätsgång för en högsta möjliga poäng på 18(figur 7E). Motorfunktionen av ipsilateral hindlimbs visat en minskning av CBS-HX poäng efter T9 laterala HX, vilket är förenligt med underskotten sett i den mänskliga Brown-Séquard syndrom. Motorfunktionen hos de ipsilaterala bakbenen visade en minskning av CBS-HX-poäng från 1 dag till 4 veckor efter T9 laterala HX jämfört med de kontralaterala bakbenen (figur 7E).
Således kan det sammansatta CBS-HX-systemet som kombinerar UHS, CPL, kontaktplacering och rutnätsgång användas för att utvärdera råttornas beteendefunktion efter bröst ryggmärgens laterala skada för en maximal möjlig poäng på 18.
Bild 1. Kirurgiska verktyg som används för att producera en T9 högersidig hemisection. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kirurgisk exposure. A) Raka håret på baksidan överliggande den kirurgiska regionen. B) Dra tillbaka musklerna från det kirurgiska området med hjälp av ett upprullningsdon. C) Exponera T8-11 vertebral laminae och definiera enskilda spinous processer (pilar). Observera att det finns en stor klyfta mellan T8 och T9 spinous processer, vilket är ett landmärke för att identifiera T9. D) Den schematiska ritningen visar den laterala vyn av de spinösa processerna. T9-11 spinous processer bildar en pyramid med T10 spinous processen är toppen. Återigen, en stor klyfta mellan T8 och T9 spinous processer ses tydligt som ett landmärke för att identifiera T9 där en laminectomy utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Laminectomy och exponering av rätt hemicord. A) Den schematiska ritningen visar ryggmärgens tvärsnitt i T9-kotan. Den streckade linjen anger omfattningen av laminectomy på varje sida. B) Den schematiska ritningen visar avlägsnandet av en liten del av lamina på vänster sida och hela kotbågen på höger sida. En pil indikerar sladdens dorsala mittlinje. C) Dorsal syn på den exponerade ryggmärgen. Observera att rygg venen var belägen i mitten av ryggmärgen dela vänster och höger hemicords. Höger hemicord var helt utsatt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4. Lateral hemisection. A-D) Schematiska ritningar visar mittlinjen nål insättning i ryggmärgen (A), T9 hemisection (B), täckning av gelatin svamp och cement (C), och den laterala synen på en T9 laterala hemisection (D). Streckade linjer i C beskriver den borttagna T9 vertebral lamina och rätt hemicord. E) Dorsal syn på en höger ryggmärg hemisection. F) Placering av en liten bit gelatin svamp över hemisection webbplats. G-H) En Simplex-P cement bro byggd över svampen och spinous processer av T8 och T10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Schematisk ritning av kopplingstestet (CPL). test. CPL-testet är att utvärdera samordningen av alternerande rörelser i armar och ben, inklusive A) homologA CPL (fram-fram/bak-baklem), B) diagonal CPL (främre vänster-bakre höger-bakre vänster-bakre vänster lemmar), och C) homolateral CPL (främre bakre lemmar på samma sida). Efter T9 HX (röd låda, D-F), blev hindlimb underskottet synlig på den ipsilesional sidan och djur visar bristande samordning i homolog (D), diagonal (E), och homolateral (F) CPL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Vävnadsdissekering och histologi. Efter perfusion, var vävnader dissekeras ut för att exponera ryggmärgen. Tvärsnitt bearbetades för dubbel immunofluorescent färgning av glia fibrillary sura protein (GFAP, en markör för astrocyter) och SMI31 (en markör för axoner). A) Exponering av suturen som ett landmärke för skadeplatsen (gul pil). B) Exponering av tandcement (gul pil). C) Exponering av gelatinsvampen (gul pil). D) Identifiera spinal hemisection på höger sida (gul pil). E) Ett ryggmärgstvärsnitt vid skada epicentrum immunstained med GFAP (grön) och SMI 31 (röd). Det visar att den högra spinal hemicord var helt skuren och den vänstra hemicord var väl bevarad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Resultat av neurobehavioral poäng. Diagram visar betyg av de 5 åtgärderna: A, den ensidiga hemisection poäng (UHS); B, koppling (CPL); C, kontakt placering; D, rutnät promenader, och E, kombinerat beteende poäng (CBS) på ensidiga och kontralateral bakben efter en T9 HX. Data representerar medelvärdet ± s.e.m. *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 mellan ipsilateral och kontralateral bakben (Tvåvägs ANOVA, Tukeys flertal jämförelsetest, n = 12 råttor/grupper). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Delpoängnamn/intervall | Beskrivning | Poäng | |
| Ensidig hindlimb kliva | Observerbar liten hindlimb rörelse | Nej | 0 |
| Jag är här för att se hur? | Ja | 1 | |
| (0-8) | Förflyttning av fotled | Nej | 0 |
| Ja | 1 | ||
| Rörelse av knä | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Rörelse av Höft | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Svepande (inget viktstöd) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Placering (inget viktstöd) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Placering (med viktstöd) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Kliva | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Koppling | Homolateral | Nej | 0 |
| (0-6) | Oregelbunden/klumpig | 1 | |
| Normal | 2 | ||
| Homologa | Nej | 0 | |
| Oregelbunden/klumpig | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Diagonal | Nej | 0 | |
| Oregelbunden/klumpig | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Kontakta placering | Nej | 0 | |
| (0-1) | Ja | 1 | |
| Rutnät promenader | Missa steg | >15 | 0 |
| (0-3) | ≤15 | 1 | |
| ≤10 | 2 | ||
| ≤5 | 3 | ||
| Totalt CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
Tabell 1: De kombinerade beteendepoängen för hemisection (CBS-HX)
Discussion
I denna studie rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att producera en enkel, konsekvent och reproducerbara T9 spinal HX hos vuxna råttor som härmar Brown-Séquard syndrom hos människor. Vi introducerar vidare ett kombinerat beteende poängsystem för hemisection (CBS-HX) som är känslig för att utvärdera asymmetrisk neurologisk försämring och progression av återhämtning, mätt med en kombination av ensidiga hindlimb stepping (UHS), koppling (CPL), kontakt och rutnätsgång. Även om vi visar skadan på T9 nivå, kan detta förfarande tillämpas på andra regioner i ryggmärgen inklusive massundersökning och ländryggen sladdar på ett enkelt och krävande sätt. Vi hoppas att denna modell, tillsammans med unilateraliserade beteendemässiga bedömningar, kommer att vara användbart för att undersöka skademekanismer och terapeutiska effektivitetsvinster för sådana typer av SCI.
Eftersom den laterala HX-modellen endast organskador den ipsilaterala halvan av sladden, är den kontralaterala sidan av sladden till stor del bevarad och kan användas som en intern kontroll. Många fallande och stigande vägar är ensidigt projiceras och en lateral hemisection i många fall ger skador på en axonal tarmkanalen på ena sidan och bevarar samma tarmkanalen på motsatt sida, vilket möjliggör jämförelse av omorganisation och funktionella konsekvenserna av dessa områden hos samma djur. Dessutom kan producera en mer lokaliserad lesion tillåta inriktning av specifika vägar. Till exempel, en ventrala och ventrolateral lesion kan påverka reticulospinal och vestibulospinal vägar. En dorsal eller dorsolateral lesion kan påverka korticospinal och rubrospinal vägar. Den hemisection eller partiell skada modell kan också användas för att studera anatomi och funktion av andra vägar, såsom propriospinal, noradrenergic eller serotonerga vägar. Således kan hemisection modellen vara unikt anställd för att studera ersättning av sensoriska afferenter, genom fallande vägar, och av inneboende spinal kretsar. Denna modell är också lämplig för att undersöka mekanismer för rörelsedrivande återhämtning efter HX.
Den laterala HX leder till uppenbara beteendemässiga nedskrivningar, som kan bedömas under motoriska uppgifter (t.ex. Treadscan eller Löpband) paradigm för den automatiserade gånganalys 19. Dessutom kan ledningsförmågan hos axonal skrifter på kontralateral sidan till lesion mätas med hjälp av elektrofysiologiska inspelningar, och denna utvärdering ger möjlighet att upprätta en funktionell omorganisation efter olika behandlingar. Dessutom ensidiga injektioner av anatomiska spårämnen i nervceller i en viss väg tillåta visualisering av anterogradely märkt mittlinjen korsning fibrer och deras samband med bakåtsträvande märkta nervceller20,21,22,23,24,25.21
Även om en typisk spinal HX kirurgi tar mindre än 20 minuter att avsluta, det kräver viss praxis för att uppnå en exakt och konsekvent HX. För det första är det viktigt att spinal HX-nivån är konsekvent från djur till djur. Därför är det viktigt att lämpliga vertebral segmentet för laminectomy identifieras. För det andra, se till att HX är klar. För att göra en komplett HX, kan man använda en 30-gauge nål införas vertikalt genom mittlinjen för att styra skärande med hjälp av mikroscisser. Nålen insättning också undviker skador på den bakre ryggmärgskärl eller sladd över lesioning. Den andra funktionen av 30-gauge nålen är att den kan fungera som en kniv för att spåra snittet för att se till att det inte finns någon tvetydighet av lesionen. För det tredje, placera gelatin på lesion webbplats kan minimera ryggmärgsvätskan läckage, och placera cement ovanpå gelatin och överbrygga vertebral lamina kan stärka stabiliteten hos spinal kotor vid lesion plats och underlätta sårläkning. För att undvika signalstörningar med tillämpning av elektrofysiologiska inspelningar bör muskler, fascia och hud sys i lager med 4-0 silkestråd. Slutligen bör alla ansträngningar göras för att minimera skadorna på den kontralaterala ryggmärgen. Histologiska kontroller bör fastställas för att bekräfta en fullständig lateral hemisection på ena sidan och bevarande av den andra halvan av sladden på den andra sidan (som visas i figur 6E).
För att förbättra förflyttningen efter SCI har tidigare studier använt sig av ett brett spektrum av strategier, inklusive celltransplantation, axonregenerering 8,,18,26,27och aktivitetsbaserad rehabilitering 28,29,30. Samtidigt har flera beteendetester fastställts för funktionell bedömning och för att screena för de bästa behandlingarna efter SCI. BBB-kolmotorska klassificeringsskalan har utformats för rörelsepassningsbedömning av ryggradssymmetriska skador såsom en midline kontusion eller transection skador som påverkar bilaterala hindlimbs 14,31. Vissa parametrar för BBB, såsom samordning och tå clearance, registreras genom att observera båda bakbenen. Om en hindlimb är intakt och den andra visar underskott som ses i asymmetriska skador, då intakt hindlimb kommer att förvirra poängen för den drabbade hindlimb. Eftersom BBB-poänggörandet inte rymmer en bakbenspoäng från den andra efter den ensidiga skadan, är den inte idealisk för att bedöma ensidiga ryggmärgsskador. Om gemensamma rörelser och viktstöd på varje sida bedöms separat och inte beräknas som en del av BBB, kommer dock den intakta bakbenet (liknande en simulerad kontroll) inte att blanda ihop poängen för det drabbade hindlimb. Dessutom kommer den intakta sidan inte bias den totala poängen för djuret, eftersom den intakta hindlimb inte har dramatiska underskott i gemensamma rörelser, viktstöd, eller kliva.
Den kombinerade beteende poäng för hemisection är utformad för att vara en känslig och lätt utförd utvärdering av beteendemässiga återhämtning i råtta modell av laterala hemisection. Det kan användas för att bedöma beteenden av både tidiga och sena faser av återhämtning. Den tidiga fasen är inom 7-10 dagar efterinjury. Under de första 3-5 dagarna efter HX, den ensiella hindlimb aktiviteten ökade stadigt och bör bedömas oftare för att registrera spontana eller behandling-medierad hindlimb rörelse återvinningar. Vid 5-7 dag post-HX, råtta började till göra svepande hindlimb rörelserna utan vikt stöd. Vid 7-10 dag, råtta typiskt börja till stå och steg. Under denna fas bör uppmärksamhet på stegmönstret ägnas. I slutet av fasen (14-28 dagar) var den enpsilateral hindlimb aktiviteten stabil och nära det normala.
Stor uppmärksamhet bör också ägnas åt kopplingskapacitet (CPL). CPL-testet (gångkoppling) kan utföras antingen med en video (t.ex. Treadscan/Catwalk) eller en filmvideo under ett test med öppna fält. Det andra alternativet ger flexibilitet om forskarna inte har tillgång till gånganalyssystemet. För båda videoinspelningssessionerna krävs minst två på varandra följande touchdowns för varje fot för det här testet. För analysen finns tre kopplingsparametrar: homolog, homolateral och diagonal koppling (steg 6.2). Varje koppling innebär en referensfot och den givna foten. Ta homolog koppling (främre vänster-främre höger, eller bak vänster-hind höger) till exempel är det den första touchdown tid av den givna foten dividerat med en hel steg tid referensfoten. Eftersom vänster och höger fot ska vara ur fas, bör den perfekta kopplingen vara 0,5. Detta är samma fall i homolateral koppling (vänster främre vänster bak, eller höger fram-höger bak). För diagonal koppling (vänster fram-höger bak, eller höger fram-vänster bak), bör den perfekta kopplingen vara 0 eller 1 eftersom de två fötterna bör vara i fas. I steg 6.4 tilldelar vi en poäng för varje CPL från 0 till 2. I detaljer ska en poäng 0 representera den givna foten inte kan röra sig för att avsluta en touchdown, därav ingen CPL; en poäng 1 representerar oregelbunden eller klumpig CPL eftersom den givna foten avslutar en touchdown men inte i den perfekta kopplingen. en poäng 2 betyder en perfekt koppling på 0,5. Begreppen de tre kopplingsparametern beskrivs väl i de tidigare publikationerna32,33. CPL kan kombineras med bedömningar av kontaktplacering och rutnätsgång. Enskilda komponenter i det kombinerade beteende poängsystemet kommer att vara mer eller mindre effektiva i olika råtta modeller av SCI. För CPL blev underskotten uppenbarligen synliga i alterneringen och sekvensens fullständighet. Proprioceptive hindlimb placering underskott kan tydligt avslöjas efter ensidiga HX. I vår studie visade alla råttor ipsilesional hindlimb placera underskott medan kontralateral hindlimb placering visade inga underskott. Rutnätet gångtest bör beaktas när kontakt placering, vilket innebär corticospinal tarmkanalen, börjar återhämta sig. För att utesluta eventuella trötthetsproblem kan sekvensen av beteendetester randomiseras vid varje test.
Sammanfattningsvis rapporterar vi steg-för-steg förfaranden för att skapa en reproducerbar in vivo råtta modell av T9 spinal HX som härmar Brown-Séquard syndrom hos människor. Det kombinerade beteende poängsystemet för hemisection erbjuder ett mer diskriminerande mått på enskilda hindlimb beteendemässiga resultat för att utvärdera skada mekanismer och behandlingar efter en ensidig SCI. Även om vi bara ger en visuell beskrivning av kirurgiska ingrepp och beteendemässiga bedömningar av en bröst HX, metoder som beskrivs här kan tillämpas på andra ofullständiga SFI på olika skada nivåer.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jeffrey Recchia-Rife för hans utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes delvis av stiftelsen för generaldirektören för Jinan military region of Chines PLA 2016ZD03 och 2014ZX01 (XJL och TBZ). Forskning i Xu laboratoriet stöds av NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, och Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 från US Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
References
- Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
- Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
- Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
- Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395 (2014).
- Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
- Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
- Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
- Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
- Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
- Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
- Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
- Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
- Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
- Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
- Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
- Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
- Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
- Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
- Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290 (2014).
