Summary
Her beskriver vi kirurgiske prosedyrer for å produsere en pålitelig ryggmargslateral hemiseksjon (HX) på 9th thoraxnivå hos voksne rotter og nevroatferdsvurderinger designet for å oppdage asymmetriske underskudd etter en slik ensidig skade.
Abstract
Ufullstendig ryggmargsskade (SCI) fører ofte til svekkelse av sensoriske funksjoner og er klinisk den hyppigste typen SCI. HumanT Brun-Séquard syndrom er en vanlig type ufullstendig SCI forårsaket av en lesjon til den ene halvdelen av ryggmargen som resulterer i lammelse og tap av proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tap av smerte og temperaturfølelse på motsatt (eller kontralesjons) side. Tilstrekkelige metoder for å produsere en ryggmargslateral hemiseksjon (HX) og vurdere nevrologiske funksjonsnedsettelser er avgjørende for å etablere en pålitelig dyremodell av Brown-Séquard syndrom. Selv om lateral hemisection modell spiller en avgjørende rolle i grunnleggende og translasjonell forskning, standardiserte protokoller for å skape en slik hemisection og vurdere ensidig funksjon mangler. Målet med denne studien er å beskrive trinnvise prosedyrer for å produsere en rotte spinal lateral HX på 9th thorax (T9) vertebral nivå. Vi beskriver da en kombinert atferdsskala for HX (CBS-HX) som gir en enkel og sensitiv vurdering av asymmetrisk nevrologisk ytelse for ensidig SCI. CBS-HX, fra 0 til 18, består av 4 individuelle vurderinger som inkluderer ensidig bakbenstepping (UHS), kobling, kontaktplassering og rutenettgange. For CBS-HX vurderes de ipsilaterale og kontralaterale bakbenene separat. Vi fant at etter en T9 HX viste det ipsilaterale bakbenet nedsatt atferdsfunksjon, mens det kontralaterale bakbenet viste betydelig gjenoppretting. CBS-HX effektivt diskriminerte atferdsfunksjoner mellom ipsilaterale og kontralaterale bakben og oppdaget temporal progresjon av utvinning av det ipsilaterale bakbenet. CBS-HX-komponentene kan analyseres separat eller i kombinasjon med andre tiltak ved behov. Selv om vi bare ga visuelle beskrivelser av kirurgiske prosedyrer og atferdsvurderinger av en thorax HX, kan prinsippet brukes på andre ufullstendige SCIer og på andre nivåer av skaden.
Introduction
Ufullstendige ryggmargsskader (SCI) fører ofte til alvorlige og vedvarende svekkelser av sensoriske funksjoner og er klinisk den hyppigste typen SCI1. Brown-Séquard syndrom hos mennesker er forårsaket av en lesjon til halvparten av ryggmargen som resulterer i lammelse og tap av proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tap av smerte og temperatur følelse på motsatt (eller contralesional) side2,3,4. Spinal lateral hemisection dyr modeller brukes bredt for å etterligne menneskelig Brown-Séquard syndrom og de har blitt rapportert i rotter5,6,7,8,9, opossums10, og aper7,11,12,13 av ulike laboratorier på ulike spinal nivåer. Detaljerte visualiserte prosedyrer for produksjon av en standard lateral hemiseksjon er imidlertid ikke beskrevet. Å gi trinnvise prosedyrer for en lateral hemiseksjon bør optimalisere modellen og legge til rette for sammenligning eller replikering av eksperimentelle resultater i grunnleggende og translasjonell forskning.
En ensidig SCI produserer asymmetriske og uforholdsmessige atferdsunderskudd som er vanskelige å måle ved hjelp av konvensjonelle vurderinger for symmetriske skader. En tilstrekkelig metodikk for å vurdere nevrologiske funksjonsnedsettelser for en ensidig SCI er en viktig del av utviklingen av en ensidig SCI-modell. Til tross for den avgjørende rollen som en ensidig ryggskade mangler standardiserte protokoller for evaluering av sensoriske underskudd hos dyr med en slik skade. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) lokomotor rating skala har vært den mest brukte måling av funksjon etter SCI for voksne rotter 14 som gir en semikvantitativ beskrivelse av bevegelse som helhet. Det måler imidlertid ikke hvert bakben uavhengig.
I denne studien rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å produsere en gnagerspinal HX på 9th thorax (T9) vertebral nivå. Vi introduserer også en kombinert atferdsskala for hemisection (CBS-HX) som inkluderer ensidig bakbensstepping (UHS), kobling, plassering av kontakt og grid walking vurderinger for evaluering av nevrologiske funksjonsnedsettelser og gjenoppretting etter en ensidig SCI. Vi håper denne modellen vil være en nyttig modell for å undersøke skademekanismer og terapeutiske efficacies for ensidige SCIer.
Protocol
Alle kirurgiske og dyrehåndteringsprosedyrer ble utført som godkjent i henhold til Veiledning for omsorg og bruk av laboratoriedyr (National Research Council) og retningslinjene for Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Komiteen.
1. Generell vurdering
- Bruk voksne kvinnelige Sprague-Dawley (SD) rotter (veier 200 g, n = 12) for denne studien. Vanlige dyr til alle testmiljøer og samle inn baselinedata for alle atferdstester en uke før kirurgisk prosedyre.
- Utfør atferdsvurderingene av to observatører som er blindet for eksperimentelle grupper.
2. Dyr Forberedelse
- Rengjør det kirurgiske bordet med 70% etanol. Plasser en forvarmet varmepute på det kirurgiske bordet. Dekk det kirurgiske området med en steril kirurgisk drapere. Plasser den sterile gasbind, bomullspinner, og autoklaved kirurgiskverktøy på overflaten av kirurgisk drapere.
- Slå på en mikroperle sterilisator for intersurgery sterilisering av kirurgiske verktøy.
MERK: Et eksempel på verktøyene som brukes i dette eksperimentet, vises i figur 1. - Bedøve rotten med en intraperitoneal (dvs.) injeksjon av ketamin (87,7 mg/kg) og xylazin (12,3 mg/kg). Sørg for at riktig plan for anestesi er nådd uten respons på tåklemmen stimulans. Påfør veterinærsalve på dyrets øyne for å forhindre hornhinnetørking under operasjonen.
- Fjern håret som ligger over tetraktryggvirvlene ved barbering (Figur 2A). Fjern den barberte pelsen med et vakuum utstyrt med et HEPA-filter.
- Rengjør operasjonsområdet med tre vekslende skrubber av jodbasert skrubb og etanol.
- Dekk dyret med en steril drapering med en fenestration over det foreslåtte snittstedet (Figur 2B). Merk; I videoen har den kirurgiske draperingen blitt utelatt for demonstrasjonsformål.
3. Spinal Hemisection
- Berør den13. Følg 13th rib dorsally for å identifisere sin forbindelse med T13 vertebra og deretter telle opp for å identifisere T10 vertebra.
- Bruk et skalpellblad (#15, figur 1) til å utføre et 3- 4 cm midtlinjet hudsnitt på ryggen som ligger over 8-11th vertebral spinous prosesser.
- Under et kirurgisk mikroskop, rett ut dissekere og skille paraspinalmusklene lateralt fra de spinøse prosessene mot fasetter av T9 og T10 ryggvirvler på begge sider ved hjelp av samme skalpellblad.
MERK: Denne tilnærmingen vil pent erte vevet fra hverandre uten å forårsake blødning. - Stabiliser ryggraden ved hjelp av en modifisert stabiliserende holder. Lag en spalte på begge sider av det laterale vertebrale beinet. Skyv armene i rustfritt stål under de eksponerte tverrgående prosessfasetter og stram skruene for å sikre stabiliteten.
- Bruk en tilbaketrekking til å trekke tilbake muskler fra det kirurgiske området (Figur 2B) og til å eksponere T8-11 vertebral laminae og spinøse prosesser (Figur 2C).
MERK: Det er et stort gap mellom T8- og T9-spinøse prosesser, som er landemerker for å identifisere T9 (Figur 2C, ryggvisning). Fra sidevisningen peker den spinøse prosessen til T9 vertebra-punktene caudally, T10 spinous prosessen dorsally, og T11 spinous prosessen peker rostrally; så, de 3 spinøse prosessene danner en pyramide og T10 spinous prosessen danner toppen (Figur 2D, lateral visning). - Utfør en dorsal laminektomi på T9 vertebra ved hjelp av en rongeur. Klipp bort T9 spinøs prosessen og fjerne en liten del av lamina venstre til midtlinjen (Figur 3A, stiplet linje), og hele høyre del av lamina så lateralt som mulig (Figur 3A, stiplet linje). For laminektomi, sett rongeurforsiktig under lamina og klipp et lite stykke bein om gangen til et ønsket område av laminektomi er fullført (Figur 3B og figur 3C).
- Under et kirurgisk mikroskop identifiserer du ryggmargens ryggmargsryggmargs ryggmargsrygglinje (figur 3C). Sett en kanyle (30 G) vertikalt gjennom midtlinjen inn i ryggmargen med den skrå siden mot høyre side (figur 4A).
MERK: Nålen skal trenge inn i hele ryggmargen for å nå luftvirvlerveggen i vertebralkanalen. - Stopp blødningen med et lite stykke sterilt gelskum.
- Sett inn en spiss av en iridectomy / mikrokirurgisk saks gjennom midtlinje nålsporet, og den andre spissen langs den laterale overflaten av høyre hemi-ledning, og deretter gjøre et fullstendig kutt på høyre hemi-ledning med saksen (Figur 4B).
MERK: Bruk en skarp mikrosaks til ryggmargen kuttet for å minimere kompresjonslesjon en ryggmarg under kuttingen. - Bruk den laterale kanten av samme nål som en kniv for å skjære gjennom lesjonsgapet for å bekrefte en fullstendig høyre hemiseksjon. Kontroller fullstendigheten av riktig hemiseksjon ved å visualisere bunnen av vertebralkanalen med det kirurgiske mikroskopet (Figur 4C, tverrsnittsvisning; Figur 4D, sidevisning; Figur 4E, dorsal visning).
- Plasser et lite stykke gelatinsvamp over lesjonsstedet (Figur 4F). Bruk sementblanding og bygg en smal bro over svampen og de spinøse prosessene til T8 og T10 (Figur 4G, H).
MERK: Formålet med å bruke en sementbro er todelt: 1) det skiller arret utviklet på skadestedet fra resten av vevet, og 2) det gjør lettere å dissekere ut ryggmargssegmentet etter dyreoffer. - Sutur muskel- og hudlagene separat med 4-0 silketråd.
- Injiser 0,9% steril saltvann subkutant for å opprettholde hydrering. Injiser et smertestillende middel Buprenorfin (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 timer/dag subkutant i 2 dager. Trykk urinblæren 2-3 ganger daglig for den første uken og 1-2 ganger i de følgende ukene til spontan blæreannullering returnerer.
4. Postoperativ dyrepleie
- Returner dyret til sitt en-housed hjem bur. Gi fuktig gnager chow eller gel på bunnen av buret for å hjelpe til med dyrets evne til å spise / hydrere. Plasser en varmepute under buret under gjenoppretting etter operasjonen. Pass på at varmeputen bare dekker halvparten av burbunnen for å unngå overoppheting.
- Injiser 0,9% steril saltvann subkutant for å opprettholde hydrering. Injiser et smertestillende middel Buprenorfin (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 timer/dag subkutant i 2 dager. Trykk urinblæren 2-3 ganger daglig for den første uken og 1-2 ganger i de følgende ukene til spontan blæreannullering returnerer.
5. Vurdere den ensidige hemisection Stepping (UHS)
MERK: Den ensidige hemisection stepping (UHS) testen er et direkte mål på evnen til SCI dyr å utnytte deres ipsilesional hindlimb i det åpne feltet. Som nevnt i 1.1, dyrene ble akklimatisert til et åpent felt miljø (diameter 42 inches) 15 to ganger om dagen i 7 dager. To observatører blindet til dyregruppene utfører testen. UHS score på begge baseline (7 dager før T9 HX) og tidspoeng etter skade vil bli samlet. Trinnene for vurdering er beskrevet som fulgt.
- Plasser dyret i et åpent feltmiljø og undersøk dyrets bevegelse i 4 min.
MERK: Under testing kan det gis oppmuntring til dyret for å bevege seg aktivt. - Med skjemaet i tabell 1tilordnes du en verdi på 1 for Ja og 0 for Nei for hver atferdskategori, og deretter summerer du den totale verdien for å gi en endelig UHS-poengsum på 0 til 8.
MERK: Ifølge tabell 1 0: ingen observerbar bevegelse av bakbenet; 1 – 4: isolerte bevegelser av 3 bakbenledd (hofte, kne og ankel); 5: feiing uten vektstøtte; 6: plassere uten vektstøtte; 7: plassere med vektstøtte; og 8: stepping med vektstøtte. - Samle UHS score på begge baseline (7 dager før T9 HX) og tidspoeng etter skade.
MERK: Poengsummene vil bli vurdert på ulike tidspunkter etter T9 HX.
6. Kobling
- Analyser CPL (gangkobling) med et videoopptak av et dyr som går på en smal rullebaneenhet eller et enkelt åpent felt.
- I koblingsdelen av tabell 1tilordnes du en poengsum på 0 for "Nei", 1 for "Uregelmessig/klønete", og 2 for "Normal" for hver CPL-kategori.
MERK: Koblingen (CPL) testen er å evaluere koordinering av vekslende bevegelser av lemmer, inkludert homologCPL (foran-front / bak-bak lemmer, Figur 5A), diagonal CPL (foran venstre bak høyre eller foran høyre bak venstre lemmer, Figur 5B), og homolateral CPL (foran bak lemmer på samme side, Figur 5C). Etter en T9 HX blir underskuddene i bakbenet på ipsilesional side synlig, noe som resulterer i veksling av homolog CPL (Figur 5D), diagonal CPL (Figur 5E) og homolateral CPL (Figur 5F).
7. Kontakt Plassering
MERK: Bakre benkontaktplasseringstesten brukes til å evaluere motorintegrasjonen av bakbensresponser på proprioceptive stimuli 16. Proprioception anses å være intakt hvis dyret går opp med bakbenet på overflaten etter at bakbenet er trukket ned under overflaten.
- Hold dyret i vertikal stilling slik at begge bakbenene er tilgjengelige for plasseringsresponsen.
- Pensle dorsaloverflaten av et bakben fremover lett mot kanten av en overflate (f.eks dyr arbeidsbenk).
- Vær oppmerksom på fotplasseringen på overflaten og tilordne en bakbenskontakt. 0: ingen plassering; 1: plassering.
MERK: Dorsaloverflaten mottar stimulering og foten vil deretter strekke seg og plassere foten på overflaten hvis refleksen er intakt. Vurderingsskjemaet er også i tabell 1.
8. Rutenett Vandring
MERK: Grid walking test vurderer spontane motorunderskudd og lem bevegelser involvert i presis stepping, koordinering, og nøyaktig pote plassering.
- Plasser en rotte på et forhøyet plastbelagt nettingnett (36 × 38 cm med 3 cm2 åpninger) og la den gå fritt over plattformen i 30 trinn.
- Tell det totale antall fotspor og antall fotfeiltrinn for hvert lem. Videoopptak er gjort for å bekrefte tellingen.
MERK: To blindede observatører vurderer poteplassering av forben og bakben når dyr går. - Tilordne rutenettet gå score for hver hindlimb som følger - 0: feiltrinn større enn 15; 1: feiltrinn mindre enn eller lik 15; 2: feiltrinn mindre enn eller lik 10; og 3: feiltrinn mindre enn eller lik 5.
MERK: Poengvurderingen er basert på tabell 1. Cutoffs score brukes som mål for alvorlighetsgraden av motorunderskudd.
9. Perfusjon og vevsbehandling
- Etter passende anestesi lignende i trinn 2.3, perfuse dyrene nøye følge transkardial perfusjon protokoll 17.
- Dissekere og samle ryggmargsprøvene og post-fix dem i 4% PFA over natten.
- Prøvene kan deretter overføres til 30% sukroseløsning.
- Skjær ryggmargen i tverrsnitt og beis de valgte delene med en aksonmarkør SMI-31 og astrocytisk markør glial flimmersyre protein (GFAP) i henhold til standardprosedyrer18.
Representative Results
De kirurgiske prosedyrene som er beskrevet ovenfor tillater produksjon av en konsekvent og reproduserbar lateral HX ved T9. Etter fjerning av perfusjon og hud kan operasjonsstedet ved T9 lett identifiseres av en gjenværende sutur (figur 6A). Videre disseksjon gjør det mulig å eksponeringen av sementbroen (Figur 6B) og gelatinsvamp (Figur 6C) i lag. Ryggmargen blir deretter utsatt for den åpnede vertebralkanalen og en lateral hemiseksjon på høyre side er bekreftet (Figur 4D). Skadenivået kan bekreftes ytterligere av sin tilknytning til de eksponerte vertebrale legemene og ribbeina (figur 6D). Immunfluorescensfarging av et tverrsnitt ved skadeepisenteret viser et fullstendig tap av høyre hemicord og bevaring av venstre hemicord kontralateral til skaden. Seksjonen farget med en aksonmarkør SMI-31 og astrocytisk markør glial flimmersyreprotein (GFAP) (Figur 6E).
Neurobehaviorally, CBS-HX systemet er i stand til å oppdage asymmetriske underskudd over tid etter en T9 HX. Etter HX mistet det ipsilaterale bakbenet sin evne til å gå, mens det kontralaterale bakbenet beholdt evnen til å gå. For hvert atferdsmål utførte vi 3 studier og brukte gjennomsnittet av de 3 studiene for kvantifisering og analyse. Vi brukte pre-kirurgi mål som en baseline som vi anser som den mest nøyaktige kontrollen sammenlignet med å bruke andre rotter. Score av de 4 individuelle tiltakene, det vil si UHS, CPL, kontaktplassering og rutenettgange kan analyseres separat (Figur 7A-D) eller de kan kombineres til en kompositt CBS-HX (Figur 7E). Toveis ANOVA-analyser viste signifikante forskjeller i UHS (F = 23.199, p < 0,001), kobling (F = 8,376, p < 0,01), kontaktplassering (F = 17.672, p < 0,001), rutenettgange (F = 19.261, p < 0.001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0.001) mellom de ipsilaterale og kontralaterale sidene. Figur 7A viser resultatene av UHS etter en T9 HX. I de første 3 dagene etterskade mistet rotter evnen til å gå og fikk en score på 0-2 for ipsilesional bakben. Trinnlignende bevegelser begynte å dukke opp på ipsilesional side på 7-10 dager etter skade med de fleste skritt er ryggtrinn. Ved 28 dager etter T9 HX kunne rottene ta plantarskritt med nesten normal koordinering med en tildelt UHS-score på 8. Til sammenligning ble kontralesjonsbakbenet mindre avbrutt, og UHS-poengsummen falt i løpet av de første 5 dagene etter T9 HX og returnerte til baselinenivå etter dag 10 etter skade. For den totale CPL -testen (inkludert homolateral, homolog og diagonal kobling) ble både stabilitet og tilpasningsevne for koordinering etter T9 HX markert redusert (figur 7B). Ved 1-5 dager etter skade viste HX-dyrene ingen tegn til CPL. Over tid dukket CPL av det ipsilaterale bakbenet opp, ofte klønete, ustø og upassende varierende i hastighet, kraft og retning. Kontaktplassering (Figur 7C) og rutenettgange (Figur 7D) av det ipsilaterale bakbenet ble også påvirket av T9 HX spesielt i løpet av de første 5 dagene etter skaden, og vanligvis gjenopprettet da dyret begynte å ta plantar trinn. Det sammensatte CBS-HX-systemet inkluderer UHS, CPL, kontaktplassering og grid walking tester for en maksimal mulig score på 18 (Figur 7E). Motorfunksjonen til de ipsilaterale bakbenene viste en reduksjon i CBS-HX-skår etter T9 lateral HX, som er i samsvar med underskuddene sett i det menneskelige Brown-Séquard-syndromet. Motorfunksjonen til de ipsilaterale bakbenene viste en reduksjon i CBS-HX score fra 1 dag til 4 uker etter T9 lateral HX sammenlignet med de kontralaterale bakbenene (Figur 7E).
Dermed kan det sammensatte CBS-HX-systemet som kombinerer UHS, CPL, kontaktplassering og rutenettgange brukes til å evaluere atferdsfunksjonen til rotter etter den laterale skaden av thoraxryggmargen for en maksimal mulig score på 18.
Figur 1. Kirurgiske verktøy som brukes til å produsere en T9 høyresidet hemiseksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Kirurgisk exposure. A) Barber håret på ryggen overliggende den kirurgiske regionen. B) Trekk musklene fra det kirurgiske området ved hjelp av en retractor. C) Utsett T8-11 vertebral laminae og definer individuelle spinøse prosesser (piler). Vær oppmerksom på at det er et stort gap mellom T8- og T9-spinøse prosesser, som er et landemerke for å identifisere T9. D) Den skjematiske tegningen viser sidevisningen av de spinøse prosessene. T9-11 spinous prosesser danner en pyramide med T10 spinous prosessen er toppen. Igjen, et stort gap mellom T8 og T9 spinous prosesser er tydelig sett på som et landemerke for å identifisere T9 hvor en laminektomi utføres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Laminektomi og eksponering av riktig hemicord. A) Den skjematiske tegningen viser tverrsnittet av ryggmargen i T9 vertebra. Den stiplede linjen indikerer omfanget av laminektomi på hver side. B) Den skjematiske tegningen viser fjerning av en liten del av lamina på venstre side og hele vertebralbuen på høyre side. En pil indikerer ryggmidtlinjen i ledningen. C) Dorsal syn på den eksponerte ryggmargen. Legg merke til at ryggvenen lå midt i ryggmargen som delte venstre og høyre hemicords. Høyre hemicord var helt utsatt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Lateral hemiseksjon. A-D) Skjematiske tegninger viser midline nålen innsetting i ryggmargen (A), T9 hemisection (B), dekke av gelatin svamp og sement (C), og den laterale visningen av en T9 lateral hemisection (D). Stiplede linjer i C skisserer den fjernede T9 vertebral lamina og høyre hemicord. E) Dorsal syn på en høyre ryggmarghemiseksjon. F) Plassering av et lite stykke gelatinsvamp over hemisection-området. G-H) En Simplex-P sementbro bygget over svampen og de spinøse prosessene til T8 og T10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Skjematisk tegning av koblingen (CPL) test. CPL testen er å evaluere koordinering av vekslende bevegelser av lemmer, inkludert A) homolog CPL (foran-front / bak-bak lemmer), B) diagonal cpl (foran venstre bak høyre / foran høyre bak venstre lemmer), og C) homolateral CPL (foran-bak lemmer på samme side). Etter T9 HX (rød boks, D-F), hindlimb underskuddet ble synlig på ipsilesional side og dyr viser mangel på koordinering i homolog (D), diagonal (E), og homolateral (F) CPL. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Vevdisseksjon og histologi. Etter perfusjon ble vev dissekert ut for å avsløre ryggmargen. Tverrsnitt ble behandlet for dobbel immunfluorescerende farging av glial flimmersyreprotein (GFAP, en markør for astrocytter) og SMI31 (en markør for aksoner). A) Eksponering av suturen som et landemerke for skadestedet (gul pil). B) Eksponering av tannsement (gul pil). C) Eksponering av gelatinsvampen (gul pil). D) Identifiser spinalhemiseksjonen på høyre side (gul pil). E) En ryggmargstverrsnitt ved skadeepisenteret immunisert med GFAP (grønn) og SMI 31 (rød). Det viser at høyre ryggmargshemicord ble helt kuttet og venstre hemicord var godt bevart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Resultater av nevroatferdsscore. Grafer viser score av de 5 tiltakene: A, den ensidige hemisection score (UHS); B, kobling (CPL); C, kontakt plassering; D, grid walking, og E, kombinert atferd score (CBS) på ipsilaterale og kontralaterale bakben etter en T9 HX. Data representerer gjennomsnitt ± s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 mellom ipsilaterale og kontralaterale bakben (Toveis ANOVA, Tukeys flere sammenligninger test, n = 12 rotter/grupper). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn/område for underpoeng | Beskrivelse | Score | |
| Ensidig bakbensstepping | Observerbar liten bakbensbevegelse | nei | 0 |
| -Jeg har ikke noe å si. | ja | 1 | |
| (0-8) | Bevegelse av ankel | nei | 0 |
| ja | 1 | ||
| Bevegelse av kneet | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Bevegelse av hip | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Feiende (ingen vektstøtte) | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Plassering (ingen vektstøtte) | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Plassering (med vektstøtte) | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Stepping | nei | 0 | |
| ja | 1 | ||
| Kobling | Homolateral | nei | 0 |
| (0-6) | Uregelmessig/klønete | 1 | |
| Normal | 2 | ||
| Homologe | nei | 0 | |
| Uregelmessig/klønete | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Diagonal | nei | 0 | |
| Uregelmessig/klønete | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Kontakt plassering | nei | 0 | |
| (0-1) | ja | 1 | |
| Rutenett gange | Gå glipp av trinn | >15 | 0 |
| (0-3) | ≤15 | 1 | |
| ≤10 (andre er i 1998 | 2 | ||
| ≤5 (andre er i regi | 3 | ||
| Totalt CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
Tabell 1: Den kombinerte atferdsskårer for hemisection (CBS-HX)
Discussion
I denne studien rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å produsere en enkel, konsekvent og reproduserbar T9 spinal HX hos voksne rotter som etterligner Brown-Séquard syndromet hos mennesker. Vi introduserer videre et kombinert atferdsskårsystem for hemisection (CBS-HX) som er følsomfor å evaluere asymmetrisk nevrologisk svekkelse og progresjon av utvinning, målt ved en kombinasjon av ensidig bakbensstepping (UHS), kobling (CPL), å plassere kontakt, og rutenett gange. Selv om vi demonstrerer skaden på T9-nivå, kan denne prosedyren brukes på andre områder av ryggmargen, inkludert livmorhals- og lumballedninger på en enkel og lite krevende måte. Vi håper denne modellen, sammen med ensidige atferdsvurderinger, vil være nyttig for å undersøke skademekanismer og terapeutiske efficacies for slike typer SCI.
Siden den laterale HX-modellen bare lesjoner den ipsilaterale halvdelen av ledningen, er den kontralaterale siden av ledningen i stor grad bevart og kan brukes som en intern kontroll. Mange synkende og stigende veier projiseres ensidig, og en lateral hemiseksjon gir i mange tilfeller skade på en aksonalkanal på den ene siden og bevarer den samme kanalen på motsatt side, slik at sammenligning av omorganisering og funksjonelle konsekvenser av disse kanalene i samme dyr. I tillegg kan det å produsere en mer lokalisert lesjon tillate målretting av spesifikke veier. For eksempel kan en ventral og ventrolateral lesjon påvirke reticulospinal og vestibulospinalveier. En ryggeller dorsolateral lesjon kan påvirke kortikospinal- og rubrospinalbanene. Hemiseksjonen eller delvis skademodell kan også brukes til å studere anatomien og funksjonen til andre veier, for eksempel propriospinal, noradrenerge eller serotonerge veier. Dermed kan hemisection modellen være unikt ansatt for å studere kompensasjon av sensoriske afferents, ved synkende veier, og ved iboende spinal kretser. Denne modellen er også egnet for å undersøke mekanismer for lokomotor utvinning etter HX.
Den laterale HX fører til åpenbare atferdshemminger, som kan vurderes under motoriske oppgaver (f.eks. tredeskan eller tredemølle) paradigme for den automatiserte ganganalyse 19. Også konduktiviteten av aksonalkanalene på den kontralaterale siden til lesjonen kan måles ved hjelp av elektrofysiologiske opptak, og denne evalueringen gir mulighet til å etablere en funksjonell omorganisering etter ulike behandlinger. Videre ensidige injeksjoner av anatomiske tracers i nevroner av en bestemt vei tillate visualisering av anterogradly merket midtlinje krysset fibre og deres forbindelse med retrogradly merkede nevroner20,21,22,23,24,25.
Selv om en typisk spinal HX kirurgi tar mindre enn 20 minutter å fullføre, det krever litt praksis for å oppnå en presis og konsekvent HX. For det første er det viktig at spinal HX-nivået er konsistent fra dyr til dyr. Derfor er det avgjørende at riktig vertebral segment for laminektomi er identifisert. For det andre må du kontrollere at HX er fullført. For å lage en komplett HX, kan man bruke en 30-gauge nål satt vertikalt gjennom midtlinjen for å veilede skjæringen ved hjelp av mikrosaks. Nålen innsetting unngår også skade på bakre ryggbeholdere eller ledning over lesjon. Den andre funksjonen til 30-gauge nålen er at den kan tjene som en kniv for å spore kuttet for å sikre at det ikke er tvetydighet av lesjonen. For det tredje kan det å plassere gelatin på lesjonsstedet minimere cerebrospinalvæskelekkasjen, og plassere sementen på toppen av gelatinen og bygge bro over vertebrallamina kan styrke stabiliteten av spinalryggvirvler på lesjonsstedet og lette sårheling. For å unngå signalforstyrrelser med bruk av elektrofysiologiske opptak, bør muskler, fascia og hud sutureres i lag med 4-0 silketråd. Til slutt bør alle anstrengelser gjøres for å minimere skaden på den kontralaterale ryggmargen. Histologisk verifisering bør etableres for å bekrefte en fullstendig lateral hemiseksjon på den ene siden og bevaring av den andre halvdelen av ledningen på den andre siden (som vist i figur 6E).
For å forbedre bevegelse etter SCI, tidligere studier har benyttet et bredt spekter av strategier, inkludert celletransplantasjon, axon regenerering 8,18,26,27, og aktivitetsbasert rehabilitering 28,29,30. I mellomtiden er det etablert flere atferdstester for funksjonell vurdering og for å screene for de beste behandlingene etter SCI. BBB lokomotor rating skala ble designet for lokomotor vurdering av spinal symmetriske skader som en midline kontusjon eller transection skader som påvirker bilaterale bakben 14,31. Visse parametere av BBB, som koordinering og tåklaring, registreres ved å observere begge bakbenene. Hvis den ene bakbenet er intakt og den andre viser underskudd sett i asymmetriske skader, vil det intakte bakbenet forvirre poengsummen til det berørte bakbenet. Siden BBB-scoringen ikke rommer den ene bakbensskåren fra den andre etter den ensidige skaden, er det ikke ideelt for å vurdere ensidige ryggmargsskader. Men hvis felles bevegelse og vektstøtte på hver side vurderes separat og ikke beregnes som en del av BBB, vil det intakte bakbenet (lik en bløffkontroll) ikke forvirre poengsummen til det berørte bakbenet. Videre vil den intakte siden ikke forutse dyrets samlede poengsum, fordi det intakte bakbenet ikke har dramatiske underskudd i felles bevegelse, vektstøtte eller stepping.
Den kombinerte atferdsscoren for hemisection er utformet for å være en følsom og lett utført evaluering av atferdsgjenoppretting i rottemodellen for lateral hemiseksjon. Den kan brukes til å vurdere atferd av både tidlige og sene faser av utvinning. Den tidlige fasen er innen 7-10 dager etterskade. I de første 3-5 dagene etter HX økte den ipsilaterale bakbensaktiviteten jevnt og bør vurderes oftere for å registrere spontane eller behandlingsmedierte bakbensbevegelsesgjenopprettinger. Ved 5-7 dager etter HX begynte rotter å gjøre feiende bakbensbevegelser uten vektstøtte. Ved 7-10 dager begynte rotter vanligvis å stå og gå. I løpet av denne fasen bør det utbetales oppmerksomhet til steppingmønsteret. I sen fase (14-28 dager) var den ipsilaterale bakbensaktiviteten stabil og nær normal.
Det bør også være nøye hensyn til koblingskapasitet (CPL). CPL-testen (gangtegning) kan utføres enten med en video (f.eks. Treadscan/Catwalk) eller en filmvideo under en åpen felttest. Det andre alternativet gir fleksibilitet hvis forskerne ikke har tilgang til ganganalysesystemet. For begge videoopptaksøktene er det nødvendig med minst to touchdowns på rad for hver fot for denne testen. For analysen er det tre koblingsparametere: homolog, homolateral og diagonal kobling (trinn 6.2). Hver kobling innebærer en referansefot og den gitte foten. Ta homolog kobling (foran venstre foran høyre, eller bak venstre-bak høyre) for eksempel, det er den første touchdown tiden på den gitte foten delt med en hel skritttid av referansefoten. Siden venstre og høyre fot skal være ute av fase, bør den perfekte koblingen være 0,5. Dette er det samme tilfellet i homolateral kobling (venstre foran-venstre bak, eller høyre foran høyre bak). Men for diagonalkobling (venstre foran høyre bak, eller høyre forside-venstre bak), bør den perfekte koblingen være 0 eller 1 siden de to føttene skal være i fase. I trinn 6.4 tilordner vi en poengsum for hver CPL fra 0 til 2. I detaljer skal en poengsum 0 representere den gitte foten ikke er i stand til å flytte for å fullføre en touchdown, derav ingen CPL; en score 1 representerer noen uregelmessig eller klønete CPL siden den gitte foten fullfører en touchdown, men ikke i den perfekte koblingen; en score 2 betyr en perfekt kobling på 0,5. De tre koblingsparameterbegrepene er godt beskrevet i de forrige publikasjonene32,33. CPL kan kombineres med vurderinger av kontaktplassering og rutenettgange. Individuelle komponenter i det kombinerte atferdspoengsystemet vil være mer eller mindre effektive i forskjellige rottemodeller av SCI. For CPL ble underskuddene åpenbart synlige i vekslingshastigheten og fullstendigheten av sekvensen. Proprioceptive hindlimb plassere underskudd kan tydelig avsløres etter ensidig HX. I vår studie viste alle rotter ipsilesional hindlimb plassere underskudd mens den kontralaterale bakben plassering viste ingen underskudd. Rutenettet strekktest bør vurderes når kontaktplassering, som innebærer kortikospinalkanalen, begynner å komme seg. For å utelukke eventuelle tretthetsproblemer, kan sekvensen av atferdstester bli randomisert ved hver test.
Til slutt rapporterer vi trinnvise prosedyrer for å skape en reproduserbar in vivo rottemodell av T9 spinal HX som etterligner Brown-Séquard syndromet hos mennesker. Det kombinerte atferdspoengsystemet for hemisection gir et mer diskriminerende mål på individuelle bakbensatferdsresultater for evaluering av skademekanismer og behandlinger etter en ensidig SCI. Selv om vi bare gir en visuell beskrivelse av kirurgiske prosedyrer og atferdsvurderinger av en thorax HX, kan metoder som er beskrevet her, brukes på andre ufullstendige SCIer på ulike skadenivåer.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Jeffrey Recchia-Rife for hans utmerkede tekniske hjelp. Dette arbeidet ble delvis støttet av stiftelsen av direktør for generalhospitalet i Jinan Military Region of Chines PLA 2016ZD03 og 2014ZX01 (XJL og TBZ). Forskning i Xu-laboratoriet støttes av NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 og Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 fra det amerikanske veterandepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
References
- Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
- Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
- Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
- Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395 (2014).
- Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
- Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
- Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
- Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
- Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
- Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
- Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
- Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
- Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
- Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
- Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
- Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
- Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
- Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
- Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290 (2014).
