Summary
Hier beschreiben wir chirurgische Verfahren zur Herstellung einer zuverlässigen Rückenmarks-Lateral-Hemisektion (HX) auf der9. Brustebene bei erwachsenen Ratten und neuroverhaltensbezogene Beurteilungen, die zum Nachweis asymmetrischer Defizite nach einer solchen einseitigen Verletzung entwickelt wurden.
Abstract
Unvollständige Rückenmarksverletzungen (SCI) führen oft zu Beeinträchtigungen der sensorimotorischen Funktionen und ist klinisch die häufigste Art von SCI. Humanes Brown-Séquard-Syndrom ist eine häufige Art von unvollständigem SCI, der durch eine Läsion auf die eine Hälfte des Rückenmarks verursacht wird, was zu Lähmungen und dem Verlust der Propriozeption auf der gleichen (oder ipsilesionalen) Seite wie die Verletzung und verlustsverlust von Schmerzen und Temperaturgefühlen auf der gegenüberliegenden Seite (oder kontralierung) führt. Angemessene Methoden zur Herstellung einer lateralen Rückenmarks-Hemisektion (HX) und zur Beurteilung neurologischer Beeinträchtigungen sind unerlässlich, um ein zuverlässiges Tiermodell des Brown-Séquard-Syndroms zu etablieren. Obwohl das laterale Hemisektionsmodell eine zentrale Rolle in der Grundlagen- und Translationsforschung spielt, fehlen standardisierte Protokolle zur Erstellung einer solchen Halbsektion und zur Bewertung der unilateralisierten Funktion. Das Ziel dieser Studie ist es, Schritt-für-Schritt-Verfahren zu beschreiben, um eine Ratte Spinallaterale HX auf der9. Brust (T9) Wirbelebene zu produzieren. Wir beschreiben also eine kombinierte Verhaltensskala für HX (CBS-HX), die eine einfache und sensible Bewertung der asymmetrischen neurologischen Leistung für einseitige SCI bietet. Der CBS-HX, von 0 bis 18, besteht aus 4 Einzelbewertungen, die einseitiges Hinterstufenspringen (UHS), Kupplung, Kontaktplatzierung und Gitterwandern umfassen. Bei CBS-HX werden die ipsilateralen und kontralateralen Hinterbeine getrennt bewertet. Wir fanden heraus, dass nach einem T9 HX die ipsilaterale Hintergliedigkeit eine beeinträchtigte Verhaltensfunktion zeigte, während das kontralaterale Hinterglied eine erhebliche Erholung zeigte. Das CBS-HX diskriminierte effektiv Verhaltensfunktionen zwischen ipsilateralen und kontralateralen Hinterbleibs und erkannte das zeitliche Fortschreiten der Erholung des ipsilateralen Hinterglieds. Die CBS-HX-Komponenten können bei Bedarf separat oder in Kombination mit anderen Maßnahmen analysiert werden. Obwohl wir nur visuelle Beschreibungen der chirurgischen Verfahren und Verhaltensbeurteilungen eines thorakalen HX zur Verfügung gestellt haben, kann das Prinzip auf andere unvollständige GGIs und auf anderen Ebenen der Verletzung angewendet werden.
Introduction
Die unvollständigen Rückenmarksverletzungen (SCI) führen oft zu schweren und anhaltenden Beeinträchtigungen der sensorimotorischen Funktionen und sind klinisch die häufigste Art von SCI1. Das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen wird durch eine Läsion auf die Hälfte des Rückenmarks verursacht, die zu Lähmungen und dem Verlust der Propriozeption auf der gleichen (oder ipsilesionalen) Seite wie die Verletzung und Verlust von Schmerzen und Temperaturempfindung auf der gegenüberliegenden (oder kontraproduktiven) Seite führt2,3,4. Spinale laterale Hämisektion Tiermodelle werden breit verwendet, um das menschliche Brown-Séquard-Syndrom zu imitieren und sie wurden bei Ratten5,6,7,,8,9, Opossums10, und Affen7,11,12,13 von verschiedenen Laboratorien auf verschiedenen Wirbelsäulenebenen berichtet. Detaillierte visualisierte Verfahren zur Herstellung einer standardlateralen Halbsektion wurden jedoch nicht beschrieben. Die Bereitstellung von Schritt-für-Schritt-Verfahren für eine laterale Halbsektion sollte das Modell optimieren und den Vergleich oder die Replikation experimenteller Ergebnisse in der Grundlagen- und Translationsforschung erleichtern.
Ein einseitiger SCI erzeugt asymmetrische und unverhältnismäßige Verhaltensdefizite, die mit herkömmlichen Bewertungen für symmetrische Verletzungen schwer messbar sind. Eine geeignete Methodik zur Bewertung neurologischer Beeinträchtigungen für ein einseitiges GGB ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung eines einseitigen SCI-Modells. Trotz der zentralen Rolle einer einseitigen Wirbelsäulenverletzung fehlen standardisierte Protokolle zur Bewertung sensorimotorischer Defizite bei Tieren mit einer solchen Verletzung. Die Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) Locomotor-Bewertungsskala war die am häufigsten verwendete Messung der Funktion nach SCI für erwachsene Ratten 14, was eine semiquantitative Beschreibung der Fortbewegung als Ganzes ergibt. Es misst jedoch nicht jedes Hinterglied unabhängig.
In dieser Studie berichten wir schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung eines Nagetier-Spinal-HX auf der9. Brust (T9) Wirbelebene. Wir führen auch eine kombinierte Verhaltensskala für die Hemisektion (CBS-HX) ein, die einseitiges Hinterstufentreten (UHS), Kopplung, Kontaktaufnahme und Grid Walking-Bewertungen zur Bewertung neurologischer Beeinträchtigungen und Erholung nach einem einseitigen SCI umfasst. Wir hoffen, dass dieses Modell ein nützliches Modell für die Untersuchung von Verletzungsmechanismen und therapeutischen Effizienzen für einseitige GKI sein wird.
Protocol
Alle chirurgischen und tierischen Handhabungsverfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und den Richtlinien der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use durchgeführt. Ausschuss.
1. Allgemeine Erwägung
- Verwenden Sie erwachsene weibliche Sprague-Dawley (SD) Ratten (mit einem Gewicht von 200 g, n=12) für diese Studie. Habituate Tiere in allen Testumgebungen und sammeln Basisdaten für alle Verhaltenstests eine Woche vor dem chirurgischen Eingriff.
- Führen Sie die Verhaltensbeurteilungen von zwei Beobachtern durch, die für die experimentellen Gruppen geblendet sind.
2. Tierzubereitung
- Reinigen Sie den OPERATIONStisch mit 70% Ethanol. Legen Sie ein vorgewärmtes Heizkissen auf den OP-Tisch. Bedecken Sie den operationschirurgischen Bereich mit einem sterilen chirurgischen Vorhang. Legen Sie die sterile Gaze, Wattestäbchen und autoklavierte chirurgische Werkzeuge auf die Oberfläche des chirurgischen Vorhangs.
- Schalten Sie einen Mikroperlensterilisator für die interchirurgische Sterilisation von chirurgischen Werkzeugen ein.
HINWEIS: Ein Beispiel für die in diesem Experiment verwendeten Werkzeuge ist in Abbildung 1dargestellt. - Anästhetisieren Sie die Ratte mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Ketamin (87,7 mg/kg) und Xylazin (12,3 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass die richtige Anästhesieebene durch keine Reaktion auf den Zehen-Pinch-Stimulus erreicht wird. Tragen Sie die Tierarztsalbe auf die Augen des Tieres auf, um das Austrocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern.
- Entfernen Sie das Haar über den Brustwirbel durch Rasur (Abbildung 2A). Entfernen Sie das rasierte Fell mit einem Vakuum, das mit einem HEPA-Filter ausgestattet ist.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Peelings aus Jod-basiertem Peeling und Ethanol.
- Bedecken Sie das Tier mit einem sterilen Vorhang mit einer Fehde über der vorgeschlagenen Einschnittstelle (Abbildung 2B). Hinweis; Im Video wurde der chirurgische Vorhang zu Demonstrationszwecken weggelassen.
3. Spinale Hemisektion
- Berühren Sie die13. Rippe, die die niedrigste Rippe in der Ratte ist, und eine schwebende Rippe, die sich nicht mit dem Brustbein verbindet. Folgen Sie der13. Rippe dorsal, um ihre Verbindung mit dem T13-Wirbel zu identifizieren, und zählen Sie dann auf, um den T10-Wirbel zu identifizieren.
- Verwenden Sie eine Skalpellklinge (#15, Abbildung 1), um einen 3 - 4 cm Mittellinienhautschnitt auf dem Rücken über den 8-11. Wirbelspinnprozessen durchzuführen.th
- Unter einem chirurgischen Mikroskop sezieren und trennen Sie die paraspinalen Muskeln seitlich von den spinalen Prozessen zu den Facetten der Wirbel T9 und T10 auf beiden Seiten mit der gleichen Skalpellklinge.
HINWEIS: Dieser Ansatz wird das Gewebe schön auseinander necken, ohne Blutungen zu verursachen. - Stabilisieren Sie die Wirbelsäule mit einem modifizierten Stabilisierungshalter. Machen Sie einen Schlitz auf beiden Seiten des seitlichen Wirbelknochens. Schieben Sie die Edelstahlarme unter die freiliegenden Querprozessfacetten und ziehen Sie die Schrauben fest, um die Stabilität zu gewährleisten.
- Verwenden Sie einen Retraktor, um Muskeln aus dem chirurgischen Bereich zurückzuziehen (Abbildung 2B) und um die Wirbellaminae T8-11 und spinöse Prozesse auszusetzen (Abbildung 2C).
ANMERKUNG: Es gibt eine große Lücke zwischen den spinösen Prozessen T8 und T9, die Orientierungspunkte für die Identifizierung von T9 sind (Abbildung 2C, dorsale Ansicht). Aus der seitlichen Sicht ist der spinöse Prozess der T9-Wirbelpunkte kauarisch, die T10-Spinnprozesspunkte dorsal und die T11-Spinnprozesspunkte rostral; So bilden die 3 spinlösen Prozesse eine Pyramide und der T10-Spinnprozess bildet den Höhepunkt(Abbildung 2D, Seitenansicht). - Führen Sie eine dorsale Laminektomie am T9-Wirbel mit einem Rongeur durch. Snip weg die T9 spinous Prozess und entfernen Sie einen kleinen Teil der Lamina links auf die Mittellinie(Abbildung 3A, gestrichelte Linie), und den gesamten rechten Teil der Lamina so seitlich wie möglich(Abbildung 3A, gestrichelte Linie). Für die Laminektomie den Rongeur sanft unter die Lamina legen und ein kleines Stück Knochen gleichzeitig schnipsen, bis ein gewünschter Bereich der Laminektomie abgeschlossen ist (Abbildung 3B und Abbildung 3C).
- Identifizieren Sie unter einem chirurgischen Mikroskop die dorsale Mittellinie des Rückenmarks (Abbildung 3C). Setzen Sie eine Nadel (30 G) vertikal durch die Mittellinie in das Rückenmark mit der abgeschrägten Seite nach rechts(Abbildung 4A).
HINWEIS: Die Nadel sollte das gesamte Rückenmark durchdringen, um die ventrale Wand des Wirbelkanals zu erreichen. - Stoppen Sie alle Blutungen mit einem kleinen Stück sterilem Gelschaum.
- Legen Sie eine Spitze einer Iridektomie/mikrochirurgische Schere durch die Mittellinie Nadelspur, und die andere Spitze entlang der seitlichen Oberfläche der rechten Halbband, und machen Sie dann einen kompletten Schnitt auf der rechten Halbschnur mit der Schere (Abbildung 4B).
HINWEIS: Verwenden Sie eine scharfe Mikroschere für den Rückenmarksschnitt, um die Kompressionsläsion zum Rückenmark während des Schneidens zu minimieren. - Verwenden Sie die seitliche Kante der gleichen Nadel wie ein Messer, um den Läsionspalt zu durchschneiden, um eine vollständige rechte Halbsektion zu bestätigen. Überprüfen Sie die Vollständigkeit des rechten Halbschnitts, indem Sie den Boden des Wirbelkanals mit dem chirurgischen Mikroskop visualisieren (Abbildung 4C, Querschnittsansicht; Abbildung 4D, Seitenansicht; Abbildung 4E, dorsale Ansicht).
- Legen Sie ein kleines Stück Gelatineschwamm über die Läsionsstelle (Abbildung 4F). Verwenden Sie Zementmischung und bauen Sie eine schmale Brücke über den Schwamm und die spinösen Prozesse von T8 und T10 (Abbildung 4G, H).
HINWEIS: Der Zweck der Verwendung einer Zementbrücke ist zweifach: 1) es trennt die Narbe an der Verletzungsstelle entwickelt, und 2) es macht es einfacher, das Rückenmarkssegment nach Tieropfern zu sezieren. - Die Muskel- und Hautschichten mit 4-0 Seidenfaden getrennt anbesen.
- 0,9% sterile Saline subkutan injizieren, um die Hydratation aufrechtzuerhalten. Injizieren Sie ein Schmerzmittel Buprenorphin (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/Tag subkutan für 2 Tage. Drücken Sie die Harnblase 2-3 mal täglich für die erste Woche und 1-2 mal in den folgenden Wochen, bis die spontane Blasenentleerung zurückkehrt.
4. Postoperative Tierpflege
- Bringen Sie das Tier in seinen einstöckigen Hauskäfig zurück. Geben Sie feuchtes Nagetier Chow oder Gel auf der Unterseite des Käfigs, um die Fähigkeit des Tieres zu essen / hydratisieren zu helfen. Legen Sie während der Erholung nach der Operation ein Heizkissen unter den Käfig. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen nur die Hälfte des Käfigbodens abdeckt, um eine Überhitzung zu vermeiden.
- 0,9% sterile Saline subkutan injizieren, um die Hydratation aufrechtzuerhalten. Injizieren Sie ein Schmerzmittel Buprenorphin (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/Tag subkutan für 2 Tage. Drücken Sie die Harnblase 2-3 mal täglich für die erste Woche und 1-2 mal in den folgenden Wochen, bis die spontane Blasenentleerung zurückkehrt.
5. Bewertung der einseitigen Hemisection Stepping (UHS)
ANMERKUNG: Der einseitige Hemisection Stepping (UHS)-Test ist ein direktes Maß für die Fähigkeit von SCI-Tieren, ihr ipsilesionales Hinterglied im freien Feld zu nutzen. Wie in 1.1 erwähnt, wurden die Tiere zweimal täglich für 7 Tage an eine offene Feldumgebung (Durchmesser 42 Zoll) 15 akklimatisiert. Zwei Beobachter, die blind gegenüber den Tiergruppen sind, führen den Test durch. UHS-Punkte sowohl an der Basislinie (7 Tage vor dem T9 HX) als auch Zeitpunkte nach Verletzungen werden gesammelt. Die Bewertungsschritte werden wie folgt beschrieben.
- Legen Sie das Tier in eine offene Feldumgebung und untersuchen Sie die Fortbewegung des Tieres für 4 min.
HINWEIS: Während der Tests kann das Tier ermutigt werden, sich aktiv zu bewegen. - Weisen Sie mit dem Formular in Tabelle 1den Wert 1 für Ja und 0 für Nein für jede Verhaltenskategorie zu, und summieren Sie dann den Gesamtwert, um eine endgültige UHS-Punktzahl von 0 bis 8 zu geben.
ANMERKUNG: Nach Tabelle 1 0: keine beobachtbare Bewegung des Hinterglieds; 1 – 4: isolierte Bewegungen von 3 Hinterbleibsgelenken (Hüfte, Knie und Knöchel); 5: Fegen ohne Gewichtsunterstützung; 6: Platzierung ohne Gewichtsunterstützung; 7: Platzierung mit Gewichtsstütze; und 8: Treten mit Gewichtsunterstützung. - Sammeln Sie UHS-Scores sowohl an der Basislinie (7 Tage vor dem T9 HX) als auch an Zeitpunkten nach Verletzungen.
HINWEIS: Die Ergebnisse werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem T9 HX bewertet.
6. Kupplung
- Analysieren Sie die CPL (Gangkopplung) mit einem Video, das ein Tier auf einer schmalen Start- und Landebahn oder einem einfachen offenen Feld aufzeichnet.
- Weisen Sie im Kopplungsabschnitt von Tabelle 1eine Punktzahl von 0 für "Nein", 1 für "Irregular/clumsy" und 2 für "Normal" für jede CPL-Kategorie zu.
ANMERKUNG: Der Kopplungstest (CPL) dient der Bewertung der Koordination von abwechselnden Bewegungen von Gliedmaßen, einschließlich homologer CPL (vordere/hintere Gliedmaßen, Abbildung 5A),diagonaler CPL (vorne links hinten rechts oder vorne rechts hinten links, Abbildung 5B) und homolateraler CPL (vordere hintere Gliedmaßen auf der gleichen Seite, Abbildung 5C). Nach einem T9 HX werden die Defizite des Hinterglieds auf der ipsilesionalen Seite sichtbar, was zum Wechsel der homologen CPL (Abbildung 5D), diagonaler CPL (Abbildung 5E) und homolateraler CPL (Abbildung 5F) führt.
7. Kontakt Platzierung
HINWEIS: Der Hinterblink-Kontakt-Platzierungstest wird verwendet, um die motorische Integration von Hinterbaltreaktionen auf propriozeptive Reize 16zu bewerten. Die Propriozeption gilt als intakt, wenn das Tier mit seinem Hinterglied auf die Oberfläche tritt, nachdem das Hinterglied unter der Oberfläche heruntergezogen wurde.
- Halten Sie das Tier in einer vertikalen Position, so dass beide Hinterbeine für die Platzierungsreaktion zur Verfügung stehen.
- Bürsten Sie die dorsale Oberfläche eines Hinterglieds leicht nach vorne zum Rand einer Oberfläche (z. B. Tierarbeitsbank).
- Beobachten Sie die Fußplatzierung auf der Oberfläche und weisen Sie eine Hinterlimb-Kontaktplatzierungspunktzahl zu. 0: keine Platzierung; 1: Platzierung.
HINWEIS: Die dorsale Oberfläche erhält Stimulation und der Fuß wird sich anschließend ausdehnen und den Fuß auf die Oberfläche legen, wenn der Reflex intakt ist. Das Bewertungsformular ist auch in Tabelle 1aufgeführt.
8. Grid Walking
HINWEIS: Der Grid Walking Test bewertet spontane motorische Defizite und Gliedmaßenbewegungen, die bei präzisem Schritt-, Koordinations- und präziser Pfotenplatzierung verbunden sind.
- Legen Sie eine Ratte auf ein erhöhtes kunststoffbeschichtetes Drahtgitter (36 x 38 cm mit 3 cm2 Öffnungen) und lassen Sie sie 30 Stufen lang frei über die Plattform laufen.
- Zählen Sie die Gesamtzahl der Schritte und die Anzahl der Fußfehlschritte für jede Gliedmaße. Videoaufzeichnungen werden gemacht, um die Zählung zu bestätigen.
HINWEIS: Zwei geblendete Beobachter bewerten die Pfotenplatzierung von Vorder- und Hinterbeinen, während die Tiere laufen. - Weisen Sie die Raster-Walking-Scores für jedes Hinterglied wie folgt zu – 0: Fehltritte größer als 15; 1: Fehltritte kleiner oder gleich 15; 2: Fehltritte kleiner oder gleich 10; und 3: Fehltritte kleiner oder gleich 5.
ANMERKUNG: Die Bewertung erfolgt auf Tabelle 1. Die Cutoffs-Scores werden als Maß für die Schwere der motorischen Defizite verwendet.
9. Perfusion und Gewebeverarbeitung
- Nach entsprechender Anästhesie ähnlich in Schritt 2.3, durchdringen Sie die Tiere sorgfältig nach dem transkardialen Perfusionsprotokoll 17.
- Sezieren und sammeln Sie die Rückenmarksproben und reparieren Sie sie über Nacht in 4% PFA.
- Die Proben können dann auf 30% Saccharoselösung übertragen werden.
- Schneiden Sie das Rückenmark in Querschnitte und färben Sie die ausgewählten Abschnitte mit einem Axonmarker SMI-31 und dem astrozytischen Marker glial fibrilläres saures Protein (GFAP) nach Standardverfahren18.
Representative Results
Die oben beschriebenen chirurgischen Verfahren ermöglichen die Herstellung eines konsistenten und reproduzierbaren seitlichen HX bei T9. Nach Perfusion und Hautentfernung konnte die chirurgische Stelle bei T9 durch eine Restnaht leicht identifiziert werden (Abbildung 6A). Eine weitere Zerlegung ermöglicht die Exposition der Zementbrücke (Abbildung 6B) und des Gelatineschwamms (Abbildung 6C) in Schichten. Das Rückenmark wird dann dem geöffneten Wirbelkanal ausgesetzt und ein seitlicher Halbschnitt auf der rechten Seite ist bestätigt (Abbildung 4D). Das Ausmaß der Verletzung kann durch ihre Verbindung mit den exponierten Wirbelkörpern und Rippen weiter bestätigt werden (Abbildung 6D). Die Immunfluoreszenzfärbung eines Querschnitts im Verletzungsepizentrum zeigt einen vollständigen Verlust der rechten Hemicord und die Erhaltung der linken Hemicord kontralateral zur Verletzung. Der Abschnitt mit einem Axonmarker SMI-31 und dem astrozytären Marker glial fibrilläres saures Protein (GFAP)(Abbildung 6E) gefärbt.
Neuroverhaltensfähig ist das CBS-HX-System in der Lage, asymmetrische Defizite im Laufe der Zeit nach einem T9 HX zu erkennen. Nach HX verlor das ipsilaterale Hinterglied seine Schrittfähigkeit, während das kontralaterale Hinterglied die Fähigkeit zum Gehen behielt. Für jede Verhaltensmessung führten wir 3 Studien durch und verwendeten den Mittelwert der 3 Studien zur Quantifizierung und Analyse. Wir verwendeten vor-chirurgische Maßnahme als Basislinie, die wir als die genaueste Kontrolle im Vergleich zur Verwendung anderer Ratten betrachten. Die Ergebnisse der 4 Einzelmaße, z.B. UHS, CPL, Kontaktplatzierung und Rasterlauf können separat analysiert werden (Abbildung 7A-D) oder sie können zu einem zusammengesetzten CBS-HX (Abbildung 7E) kombiniert werden. Zweiseitige ANOVA-Analysen zeigten signifikante Unterschiede in UHS (F = 23.199, p < 0.001), Kupplung (F = 8.376, p < 0.01), Kontaktplatzierung (F = 17.672, p < 0.001), Grid Walking (F = 19.261, p < 0.001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0.001) zwischen den ipsilateralen und kontralateralen Seiten. Abbildung 7A zeigt die Ergebnisse von UHS nach einem T9 HX. In den ersten 3 Tagen nach der Verletzung verloren Ratten die Fähigkeit zu treten und erhielten eine Punktzahl von 0-2 für die ipsilesional hintere. Schrittartige Bewegungen begannen auf der ipsilesionalen Seite bei 7-10 Tagen nach der Verletzung zu erscheinen, wobei die meisten Schritte dorsale Schritte waren. 28 Tage nach dem T9 HX konnten die Ratten plantare Schritte mit praktisch normaler Koordination mit einem zugewiesenen UHS-Score von 8 machen. Zum Vergleich: Das kontradiktole Hinterglied wurde weniger unterbrochen und der UHS-Score fiel innerhalb der ersten 5 Tage nach dem T9 HX und kehrte nach Tag 10 nach der Verletzung auf das Basisniveau zurück. Für den gesamten CPL-Test (einschließlich homolateraler, homologer und diagonaler Kopplung) wurden sowohl die Stabilität als auch die Anpassungsfähigkeit der Koordination nach T9 HX deutlich reduziert (Abbildung 7B). Nach 1-5 Tagen nach der Verletzung zeigten die HX-Tiere keine Anzeichen von CPL. Im Laufe der Zeit trat CPL des ipsilateralen Hinterglies auf, oft ungeschickt, unbeständig und unangemessen unterschiedlich in ihrer Geschwindigkeit, Kraft und Richtung. Die Kontaktplatzierung (Abbildung 7C) und das Gittergehen (Abbildung 7D) des ipsilateralen Hinterbeins waren auch innerhalb der ersten 5 Tage nach der Verletzung vom T9 HX betroffen und erholten sich in der Regel, wenn das Tier begann, plantare Schritte zu unternehmen. Das zusammengesetzte CBS-HX-System umfasst UHS-, CPL-, Kontaktplatzierungs- und Grid-Walking-Tests für eine maximal mögliche Punktzahl von 18 (Abbildung 7E). Die motorische Funktion der ipsilateralen Hinterbeine zeigte eine Abnahme der CBS-HX-Scores nach dem T9 lateralen HX, was mit den Defiziten im menschlichen Brown-Séquard-Syndrom übereinstimmt. Die motorische Funktion der ipsilateralen Hinterbeine zeigte eine Abnahme der CBS-HX-Scores von 1 Tag bis 4 Wochen nach dem T9 lateralen HX im Vergleich zu den kontralateralen Hinterbeinen (Abbildung 7E).
So kann das zusammengesetzte CBS-HX-System, das UHS, CPL, Kontaktplatzierung und Gittergang kombiniert, verwendet werden, um die Verhaltensfunktion von Ratten nach der seitlichen Verletzung des Brustrückenmarks für eine maximal mögliche Punktzahl von 18 zu bewerten.
Abbildung 1. Chirurgische Werkzeuge zur Herstellung einer T9 rechtsseitigen Halbsektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. ChirurgischeEx-Posure. A) Rasieren Sie das Haar auf dem Rücken über dem chirurgischen Bereich. B) Ziehen Sie die Muskeln mit einem Retraktor aus dem Operationsbereich. C) Setzen Sie die Wirbellaminae T8-11 aus und definieren Sie einzelne spinöse Prozesse (Pfeile). Beachten Sie, dass es eine große Lücke zwischen den spinösen Prozessen T8 und T9 gibt, was ein Meilenstein für die Identifizierung von T9 ist. D) Die schematische Zeichnung zeigt die seitliche Ansicht der spinösen Prozesse. Die Spinnprozesse T9-11 bilden eine Pyramide, wobei der T10-Spinnprozess der Höhepunkt ist. Auch hier wird eine große Lücke zwischen den spinösen Prozessen T8 und T9 eindeutig als Meilenstein für die Identifizierung von T9 angesehen, wo eine Laminektomie durchgeführt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Laminektomie und Exposition der rechten Hemicord. A) Die schematische Zeichnung zeigt den Querschnitt des Rückenmarks innerhalb des T9-Wirbels. Die gestrichelte Linie gibt das Ausmaß der Laminektomie auf jeder Seite an. B) Die schematische Zeichnung zeigt die Entfernung eines kleinen Teils der Lamina auf der linken Seite und des gesamten Wirbelbogens auf der rechten Seite. Ein Pfeil zeigt die dorsale Mittellinie der Schnur an. C) Dorsale Ansicht des exponierten Rückenmarks. Beachten Sie, dass sich die dorsale Vene in der Mitte des Rückenmarks befand, das die linken und rechten Halbmuskeln teilte. Die rechte Hemicord wurde vollständig entblößt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Seitliche Hemisektion. A-D) Schematische Zeichnungen zeigen die Mittelliniennadelinfügung in das Rückenmark (A), die T9-Hemisektion (B), die Abdeckung von Gelatineschwamm und Zement (C) und die seitliche Ansicht einer T9-Seitenhalbsektion (D). Gestrichelte Linien in C umreißen die entfernte T9-Wirbellamina und die rechte Hemicord. E) Dorsale Ansicht einer rechten Rückenmarks-Hemisektion. F) Platzierung eines kleinen Stücks Gelatineschwamm über der Hemisektionsstelle. G-H) Eine Simplex-P Zementbrücke, die über den Schwamm und die spinnförmigen Prozesse von T8 und T10 gebaut wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Schematische Zeichnung des Kupplungstests (CPL). test. Der CPL-Test dient der Bewertung der Koordination von abwechselnden Bewegungen von Gliedmaßen, einschließlich A) homologe CPL (vordere/hintere Gliedmaßen), B) diagonale CPL (vorne links-hinten rechts/vorne rechts-hinten links Gliedmaßen) und C) homolaterale CPL (vorne-hintere Gliedmaßen auf der gleichen Seite). Nach T9 HX (rote Box, D-F) wurde das Hinterglied-Defizit auf der ipsilesionalen Seite sichtbar und Tiere zeigen mangelnde Koordination in Homolog (D), Diagonale (E) und homolateraler (F) CPL. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Gewebesektion und Histologie. Nach der Perfusion wurden Gewebe seziert, um das Rückenmark freizulegen. Querschnitte wurden für die doppelte immunfluoreszente Färbung von glialfibrillären sauren Proteinen (GFAP, einem Marker für Astrozyten) und SMI31 (ein Marker für Axone) verarbeitet. A) Belichtung der Naht als Landmark für die Verletzungsstelle (gelber Pfeil). B) Belichtung des Zahnzements (gelber Pfeil). C) Exposition des Gelatineschwamms (gelber Pfeil). D) Identifizieren Sie die Spinalhemisektion auf der rechten Seite (gelber Pfeil). E) Ein Rückenmarksquerschnitt im Verletzungsepizentrum immunstainiert mit GFAP (grün) und SMI 31 (rot). Es zeigt, dass das rechte Rückenhemicord vollständig geschnitten war und das linke Hemicord gut erhalten war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Ergebnisse der neurobehavioralen Ergebnisse. Graphen zeigen die Ergebnisse der 5 Maßnahmen: A, der einseitige Halbschnitt -Score (UHS); B, Kupplung (CPL); C, Kontaktplatzierung; D, Grid Walking und E, kombinierte Verhaltensbewertung (CBS) auf ipsilateralen und kontralateralen Hinterbeinen nach einem T9 HX. Die Daten stehen für den Mittelwert s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 zwischen ipsilateralen und kontralateralen Hinterbleibs (Zwei-Wege-ANOVA, Tukeys Mehrfachvergleichstest, n = 12 Ratten/Gruppen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Subscore-Name/Bereich | Beschreibung | Ergebnis | |
| Einseitiges Hinterbeintritten | Beobachtbare leichte Hinterbeinbewegung | Nein | 0 |
| (UHS) | Ja | 1 | |
| (0-8) | Bewegung des Knöchels | Nein | 0 |
| Ja | 1 | ||
| Bewegung des Knies | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Bewegung der Hüfte | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Fegen (keine Gewichtsunterstützung) | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Platzieren (keine Gewichtsunterstützung) | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Platzieren (mit Gewichtsunterstützung) | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Stepping | Nein | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Kupplung | Homolateral | Nein | 0 |
| (0-6) | Unregelmäßig/ungeschickt | 1 | |
| Normalen | 2 | ||
| Homologen | Nein | 0 | |
| Unregelmäßig/ungeschickt | 1 | ||
| Normalen | 2 | ||
| Diagonale | Nein | 0 | |
| Unregelmäßig/ungeschickt | 1 | ||
| Normalen | 2 | ||
| Kontaktplatzierung | Nein | 0 | |
| (0-1) | Ja | 1 | |
| Grid Walking | Miss Schritte | >15 | 0 |
| (0-3) | Nr. 15 | 1 | |
| Nr. 10 | 2 | ||
| Nr. 5 | 3 | ||
| CBS-HX insgesamt | |||
| (0-18) | |||
Tabelle 1: Die kombinierten Verhaltenspunkte für die Halbsektion (CBS-HX)
Discussion
In dieser Studie berichten wir schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung eines einfachen, konsistenten und reproduzierbaren T9-Spinal-HX bei erwachsenen Ratten, das das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen imitiert. Wir führen ferner ein kombiniertes Verhaltens-Score-System für die Hemisektion (CBS-HX) ein, das empfindlich ist, um asymmetrische neurologische Beeinträchtigungen und das Fortschreiten der Genesung zu bewerten, gemessen durch eine Kombination aus einseitigem Hinterbeinschritt (UHS), Kopplung (CPL), Platzierung kontakt, und Gitter gehen. Obwohl wir die Verletzung auf T9-Ebene nachweisen, kann dieses Verfahren auf andere Bereiche des Rückenmarks angewendet werden, einschließlich der Hals- und Lendenbänder auf einfache und anspruchslose Weise. Wir hoffen, dass dieses Modell zusammen mit einseitigen Verhaltensbeurteilungen nützlich sein wird, um Verletzungsmechanismen und therapeutische Wirksamkeiten für solche Arten von GGB zu untersuchen.
Da das seitliche HX-Modell nur die ipsilaterale Hälfte der Schnur lädiert, ist die kontralaterale Seite der Schnur weitgehend erhalten und kann als interne Kontrolle verwendet werden. Viele absteigende und aufsteigende Pfade werden einseitig projiziert, und eine seitliche Halbierung verursacht in vielen Fällen Schäden an einem Axontrakt auf der einen Seite und bewahrt den gleichen Trakt auf der gegenüberliegenden Seite, was einen Vergleich der Reorganisation und funktionelle Natoren dieser Trakte bei demselben Tier. Darüber hinaus kann die Erzeugung einer stärker lokalisierten Läsion die Ausrichtung bestimmter Pfade ermöglichen. Zum Beispiel kann eine ventrale und ventrolaterale Läsion die Retikulaspinal- und Vestibulospinalwege beeinflussen. Eine dorsale oder dorsolaterale Läsion kann die Kortikal- und Rubrospinalwege beeinflussen. Das Hemisektions- oder Teilverletzungsmodell kann auch verwendet werden, um die Anatomie und Funktion anderer Bahnen zu untersuchen, wie z. B. der propriospinale, noradrerge oder serotonerge Bahnen. So kann das Hemisektionsmodell eindeutig eingesetzt werden, um die Kompensation durch sensorische Afferents, durch absteigende Bahnen und durch intrinsische Wirbelsäulenkreisläufe zu untersuchen. Dieses Modell eignet sich auch zur Untersuchung von Mechanismen der Bewegungsrückgewinnung nach HX.
Das laterale HX führt zu offensichtlichen Verhaltensstörungen, die unter motorischen Aufgaben (z.B. Treadscan oder Laufband) Paradigma für die automatisierte Ganganalyse 19bewertet werden können. Auch die Leitfähigkeit der axonalen Trakte auf der kontralateralen Seite zur Läsion konnte mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen gemessen werden, und diese Auswertung bietet die Möglichkeit, eine funktionelle Reorganisation nach verschiedenen Behandlungen zu etablieren. Darüber hinaus ermöglichen einseitige Injektionen der anatomischen Tracer in Neuronen eines bestimmten Weges die Visualisierung von anterograd beschrifteten Mittellinien-Kreuzungsfasern und deren Verbindung mit retrograd markierten Neuronen20,21,22,23,24,25.
Obwohl eine typische Spinal-HX-Operation weniger als 20 Minuten dauert, erfordert es einige Praxis, um eine präzise und konsistente HX zu erreichen. Erstens ist es wichtig, dass der HX-Spiegel der Wirbelsäule von Tier zu Tier konsistent ist. Daher ist es entscheidend, dass das geeignete Wirbelsegment für die Laminektomie identifiziert wird. Stellen Sie zweitens sicher, dass der HX vollständig ist. Um ein komplettes HX zu erstellen, kann man eine 30-Spur-Nadel verwenden, die vertikal durch die Mittellinie eingeführt wird, um das Schneiden mit mikroscheren zu führen. Die Nadeleinfügung vermeidet auch Schäden an den hinteren Wirbelsäulengefäßen oder der Schnur über Läsionen. Die zweite Funktion der 30-Spur-Nadel ist, dass sie als Messer dienen kann, um den Schnitt zu verfolgen, um sicherzustellen, dass es keine Mehrdeutigkeit der Läsion gibt. Drittens kann das Platzieren von Gelatine auf der Läsionsstelle das Auslaufen der Zerebrospinalflüssigkeit minimieren, und das Platzieren des Zements auf der Gelatine und das Überbrücken der Wirbellamina kann die Stabilität der Wirbelsäule an der Läsionsstelle stärken und die Wundheilung erleichtern. Um die Signalstörungen bei der Anwendung elektrophysiologischer Aufnahmen zu vermeiden, sollten Muskeln, Faszien und Haut in Schichten mit 4-0 Seidenfaden vernässt werden. Schließlich sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um die Schädigung des kontralateralen Rückenmarks zu minimieren. Es sollte eine histologische Überprüfung eingerichtet werden, um eine vollständige seitliche Halbsektion auf der einen Seite und die Erhaltung der anderen Hälfte der Schnur auf der anderen Seite zu bestätigen (siehe Abbildung 6E).
Um die Fortbewegung nach SCI zu verbessern, haben frühere Studien eine breite Palette von Strategien wie Zelltransplantation, Axonregeneration 8,,18,26,27und aktivitätsbasierte Rehabilitation 28,29,30verwendet. Inzwischen wurden mehrere Verhaltenstests für die funktionelle Bewertung und zum Screen enthebieren für die besten Behandlungen nach SCI etabliert. Die BBB-Bewegungsleitlinie wurde für die motorische Beurteilung von spinalen symmetrischen Verletzungen wie mittelseitiger Kontusion oder Transektionsverletzungen entwickelt, die bilaterale Hinterbeine 14,31betreffen. Bestimmte Parameter der BBB, wie Koordination und Zehenabstand, werden durch die Beobachtung beider Hinterbeine erfasst. Wenn ein Hinterglied intakt ist und der andere Defizite aufweist, wie bei asymmetrischen Verletzungen gesehen, dann wird das intakte Hinterglied die Punktzahl des betroffenen Hinterglieds verwirren. Da die BBB-Wertung nach der einseitigen Verletzung nicht einen Hinterbein-Score vom anderen berücksichtigt, ist sie nicht ideal für die Beurteilung einseitiger Rückenmarksverletzungen. Wenn jedoch gelenke Bewegung und Gewichtsunterstützung auf jeder Seite getrennt bewertet werden und nicht als Teil der BBB berechnet werden, dann wird das intakte Hinterglied (ähnlich einer Scheinkontrolle) die Punktzahl des betroffenen Hinterteils nicht verwirren. Darüber hinaus wird die intakte Seite die Gesamtpunktzahl des Tieres nicht verzerrt, da das intakte Hinterglied keine dramatischen Defizite in der Gelenkbewegung, Gewichtsunterstützung oder Trittweise aufweist.
Die kombinierte Verhaltensbewertung für die Halbsektion ist so konzipiert, dass sie eine sensible und leicht durchgeführte Bewertung der Verhaltenserholung im Rattenmodell der lateralen Halbsektion ist. Es kann verwendet werden, um Verhaltensweisen sowohl der frühen als auch der späten Phase der Wiederherstellung zu bewerten. Die Anfangsphase ist innerhalb von 7-10 Tagen nach der Verletzung. In den ersten 3-5 Tagen nach HX nahm die ipsilaterale Hintergliedaktivität stetig zu und sollte häufiger bewertet werden, um spontane oder behandlungsvermittelte Erholungen der Hinterbeine zu erfassen. Nach 5-7 Tagen nach HX begannen Ratten, schwungvolle Hinterbeine bewegungen ohne Gewichtsunterstützung zu machen. Nach 7-10 Tagen begannen Ratten in der Regel zu stehen und zu treten. In dieser Phase sollte auf das Schrittmuster geachtet werden. In der späten Phase (14-28 Tage) war die ipsilaterale Hinterbleibsaktivität stabil und nahezu normal.
Besondere Aufmerksamkeit sollte auch der Kupplungskapazität (CPL) gewidmet werden. Der CPL-Test (Gangkopplung) kann entweder mit einem Video (z.B. Treadscan/Catwalk) oder einem Filmvideo während eines Open-Field-Tests durchgeführt werden. Die zweite Option bietet Flexibilität, wenn die Forscher keinen Zugang zum Ganganalysesystem haben. Für beide Videoaufnahmesitzungen sind für diesen Test mindestens zwei aufeinander folgende Touchdowns für jeden Fuß erforderlich. Für die Analyse gibt es drei Kopplungsparameter: homologe, homlaterale und diagonale Kopplung (Schritt 6.2). Jede Kupplung beinhaltet einen Referenzfuß und den angegebenen Fuß. Nehmen wir zum Beispiel die homologe Kopplung (vorne links vorne rechts oder nach links hinten rechts), es ist die erste Touchdown-Zeit des gegebenen Fußes geteilt durch eine ganze Schrittzeit des Bezugsfußes. Da der linke und rechte Fuß aus der Phase heraus sein sollte, sollte die perfekte Kupplung 0,5 sein. Dies ist der gleiche Fall bei der homolateralen Kopplung (linke vordere linke Hinterseite oder rechte vordere rechte Hinterseite). Bei der diagonalen Kupplung (linke vordere rechte Hinterseite oder rechte vordere linke Hintern) sollte die perfekte Kupplung jedoch 0 oder 1 sein, da die beiden Füße in der Phase sein sollten. In Schritt 6.4 weisen wir für jede CPL eine Punktzahl von 0 bis 2 zu. Im Detail muss eine Punktzahl 0 den angegebenen Fuß darstellen, der nicht in der Lage ist, einen Touchdown zu beenden, daher keine CPL; eine Punktzahl 1 stellt eine unregelmäßige oder ungeschickte CPL dar, da der angegebene Fuß einen Touchdown beendet, aber nicht in der perfekten Kopplung; eine Punktzahl 2 bedeutet eine perfekte Kopplung von 0,5. Die drei Kopplungsparameterkonzepte sind in den vorherigen Veröffentlichungen32,33gut beschrieben. CPL kann mit den Bewertungen der Kontaktplatzierung und des Gitterlaufens kombiniert werden. Einzelne Komponenten des kombinierten Verhaltensbewertungssystems werden in verschiedenen Rattenmodellen von SCI mehr oder weniger effektiv sein. Für CPL wurden die Defizite offensichtlich in der Wechselrate und der Vollständigkeit der Sequenz sichtbar. Propriozeptive Hinterbeine, die Defizite aufstellen, konnten nach einseitigem HX deutlich aufgedeckt werden. In unserer Studie zeigten alle Ratten ipsilesionale Hinterbeine, die Defizite aufstellten, während die kontralaterale Hinterbeinplatzierung keine Defizite aufwies. Der Raster-Gehtest sollte berücksichtigt werden, wenn die Kontaktplatzierung, die den Kortikospinaltrakt beinhaltet, beginnt sich zu erholen. Um mögliche Ermüdungsprobleme auszuschließen, könnte die Abfolge von Verhaltenstests bei jedem Test randomisiert werden.
Abschließend berichten wir über Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ein reproduzierbares In-vivo-Rattenmodell des T9-Spinal-HX zu erstellen, das das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen imitiert. Das kombinierte Verhaltensbewertungssystem für die Hemisektion bietet ein diskriminativeres Maß für individuelle Sbdudenverhaltensergebnisse zur Bewertung von Verletzungsmechanismen und Behandlungen nach einem einseitigen SCI. Obwohl wir nur eine visuelle Beschreibung der chirurgischen Verfahren und Verhaltensbeurteilungen eines thorakalen HX liefern, können die hier beschriebenen Methoden auf andere unvollständige GGIs auf verschiedenen Verletzungsstufen angewendet werden.
Disclosures
Wir haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Jeffrey Recchia-Rife für seine ausgezeichnete technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von der Stiftung des Direktors des Allgemeinen Krankenhauses der Jinan Military Region von Chines PLA 2016ZD03 und 2014ZX01 (XJL und TBZ) unterstützt. Die Forschung im Xu-Labor wird unterstützt von NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 und Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 vom U.S. Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
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