Das hier beschriebene Protokoll ist eine Methode zur Messung der Endoreduplikation innerhalb Knollen der Kartoffel (Solanum Tuberosum). Freuen Sie sich auf Plasmolyse und Protoplasten Extraktion Schritte um die Lärm und Schmutz in nachgeschalteten durchflusszytometrischen Analyse verringern.
Endoreduplikation, die Replikation von einer Zelle Kerngenom ohne anschließende Zytokinese ergibt Zellen mit erhöhten DNA-Gehalt und ist verbunden mit Spezialisierung, Entwicklung und Steigerung in zellulären Größe. In Pflanzen scheint Endoreduplikation das Wachstum und die Expansion von bestimmten Geweben und Organen zu erleichtern. Unter ihnen ist die Knolle der Kartoffel (Solanum Tuberosum), die erhebliche zellulären Erweiterung bei der Erfüllung ihrer Funktion der Kohlenhydratspeicher erfährt. So kann Endoreduplikation spielen eine wichtige Rolle in wie Knollen in der Lage sind, diese Fülle von Kohlenstoff aufnehmen. Jedoch schließt die Zelltrümmer aus Rohöl nuklearen Isolationsmethoden Knollen, Methoden, die mit Blättern, effektiv genutzt werden können die Schätzung der Knolle Endoreduplikation Index (EI). Dieser Artikel stellt eine Technik für die Beurteilung der Knolle Endoreduplikation durch die Isolation von Protoplasten während zeigen repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen Genotypen und Knolle Gewebe unterteilte. Die wesentlichen Einschränkungen des Protokolls sind die Zeit und Reagenz für die Probenvorbereitung sowie relativ kurze Lebensdauer von Proben nach lyse der Protoplasten erforderlich. Während das Protokoll für technische Variation empfindlich ist, stellt eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden der nuklearen losgelöst von diesen großen spezialisierten Zellen dar. Möglichkeiten für Verbesserungen des Protokolls wie recycling-Enzym, die Verwendung von Fixiermittel und andere Veränderungen werden vorgeschlagen.
Endoreduplikation ist der Prozess, durch den eine Zelle verzichtet auf die typischen Zellzyklus und stattdessen einen alternativen Verlauf der Entwicklung bestehend aus wiederholten Runden der DNA-Replikation ohne Zellteilung erfährt. Die daraus resultierenden Zelle DNA erhöht haben Inhalte und nukleare Größe, die vermutlich eine Rolle bei der zellulären Verordnung, Expansion und Spezialisierung. In der Regel ist eine Runde Endoreduplikation (genannt einen Endocycle) und der entsprechende Anstieg der DNA-Gehalt größer Zellvolumen zugeordnet sind, eine Beobachtung, die die “karyoplasmic Theorie”, die DNA-Gehalt erhöht ausgefällt, ordnungsgemäß erforderlich eine größere, vielleicht mehr komplex, Zelle1zu regulieren. Dieses Phänomen ist häufig in höheren Pflanzen, die in einer Reihe von Geweben, einschließlich derjenigen mit Struktur-/defensives (Trichomen)2,3, beobachtet nutritive (Mais Endosperm)4,5, und Spüle/Lagerung ( Tomaten Perikarp; Kartoffelknolle)6,7,8 Funktionen. In Obst wurde vermutet, dass diese Endoreduplikation spielt eine Rolle in die rasche Expansion der Samenschale zu erleichtern, wie die negative Beziehung zwischen Endoreduplikation und Obst Entwicklungs-Periode9belegt. Zum Beispiel Zellen mit DNA Inhalt bis zu 512C (512 Mal die haploiden Genom) in der Tomate Perikarp8eingehalten worden. Im übrigen Chevalier Et Al. (2014) gezeigt, dass Veränderungen in der Expression von Genen Zellzyklus zu einem Anstieg der Endoreduplikation Ebenen innerhalb der Samenschale wodurch dann größere Früchte10führen können. Veränderung der Gene, die Förderung der Endoreduplikation bietet somit, ein potenzielles Ziel für die Verbesserung der Biomasse oder Ertrag durch Pflanzenzucht oder Genmanipulation. Eine solche Verbesserung ist jedoch abhängig von der besseren Verständnis der Ursachen und folgen der Endoreduplikation.
Endoreduplikation ist in den meisten Fällen über Durchflusszytometrie gemessen wobei Kerne, veröffentlicht in grobe Gewebe Vorbereitungen11, mit einem DNA-Bindung Fluorophor, z. B. Propidium Jodid12 (PI) inkubiert werden. Die gefilterten Proben werden dann durch den Laser ein Durchflusszytometer übergeben, wo Emission Wellenlängen spezifisch für das Fluorophor beobachtet werden können. Die Intensität der Fluoreszenz in jedem Ereignis (z.B. Zellkern) korreliert direkt mit der DNA-Gehalt des Teilchens. So kann durch den Vergleich zu einem bekannten Standard, der relativen und absoluten DNA-Gehalt der Zellen in einer Probe berechnet werden. Endoreduplikation Indizes (EI) werden bestimmt durch die Gründung der durchschnittlichen Anzahl der Endocycles pro Zelle innerhalb einer Probe durch die Beobachtung der zellulären DNA-Gehalt (C-Wert) wo befindet sich 1 C der DNA-Gehalt einer haploiden Zelle (Formel in Schritt 6,7 des Protokolls). Zum Beispiel ist der Basis DNA-Gehalt der somatischen Zellen in einem diploiden Organismus 2 C. Wenn eine Probe einige Zellen mit 4 C hat, entsprechend einer Runde Endoreduplikation oder größer ein EI in der Nähe von 0 müsste; Allerdings sind fast alle Zellen 4 C wäre die EI etwa 1. Als mehrfache Umläufe der Endoreduplikation in höheren Pflanzen Beobachtungswerte EI häufig können jedoch viel größer sein. Bei der Berechnung der Endoreduplikation Indizes kann relativ einfach, es erfordert, dass die relativen Häufigkeiten der Kerne werden C-Werte zuverlässig festgestellt werden, die unter bestimmten Arten und Geweben (einschließlich Kartoffelknollen) ausgeschlossen ist. Es ist wahrscheinlich, dass Unterschiede in zelluläre Anatomie, Chemie oder Zellwand Zusammensetzung13 verursachen diese Proben werden widerspenstigen zu den typischen Vorbereitungen mit einer Rasierklinge, die Kerne direkt in entsprechende Puffer freizugeben, die häufig verwendet werden ein Modell für Endoreduplikation Studien mit Geweben wie Tomate Perikarp8.
In der Kartoffel bleibt die Prüfung der Endoreduplikation innerhalb der Knolle beschränkt sich auf nur ein paar Studien, vielleicht zum Teil auf einen Mangel an ein zuverlässiges Protokoll, wie die oben genannten rohen Vorbereitungen inkonsistente Ergebnissen führen. Während solche Ansätze auch für Blätter die Knolle Proben erleben Sie schwere Abbau und eine Fülle von Lärm in Form von Schutt arbeiten, Differenzierung der Gipfel bestehend aus Kernen mit unterschiedlichen C-Werte fast unmöglich machen. Dies ist möglicherweise aufgrund von Unterschieden in zelluläre Zusammensetzung und eine Fülle von Zelltrümmer in Knolle Zellen (zB. Stärke speichern Amyloplasten). Um diese Hürde zu überwinden, haben wir vor kurzem ein zuverlässiger Protokoll für den Erwerb der unterscheidbaren Gipfel Durchflusszytometrie der Kartoffelknollen entwickelt. Die Frequenz der Zellen innerhalb jeder Gipfel kann dann verwendet werden, für die Berechnung der genauen Endoreduplikation gestaffelt nach verschiedenen Genotypen oder verschiedene Gewebe, aus die eine Knolle besteht. Das Protokoll, das eine modifizierte Protoplasten Extraktion Methode14,15 Antezedens beschäftigt beschriebenen Flow Cytometry11, zeigte erhebliche Unterschiede innerhalb der Kartoffel Verwandten, Sorten und Gewebe16 . Hier stellen wir das Protokoll im Detail durch die Auswertung EI im Kontext der Diploidie, Gewebe und Knolle Größe.
Das Protokoll enthaltenen sieht, dass Forscher mit einem Mittel zur Beurteilung Endoreduplikation innerhalb von Kartoffelknollen, deren modifizierte Mobilfunk Inhalte und erhöhte Zellengröße scheinbar anderen Flow Cytometry Präparaten entgegen. Das Protokoll stützt sich auf Protoplasten Generation als ein Mittel zur Reduzierung von Lärm und Schmutz, wobei nuklearen Integrität. Zuvor, Forscher haben ähnliche Vorbereitungen für besonders widerspenstigen Flow Cytometry Proben beschrieben sowie Knolle Protoplasten zur Untersuchung einer Vielzahl von Themen wie Pathogenese19,20genutzt. Nach unserem Kenntnisstand haben keine jedoch die Verwendung von solchen Knolle Protoplasten mit Durchflusszytometrie zum Zweck des Studiums Endoreduplikation kombiniert. Darüber hinaus fanden wir die Verwendung von Protoplasten zuverlässiger als typische grobe Vorbereitungen sowie die Technik in den beiden nur andere Studien zur Beurteilung der Knolle Endoreduplikation6,7genutzt werden. Hier besprechen wir die Mängel des Protokolls, potenzielle Fallstricke in seiner Ausführung und Probe Vorbereitung und Ergebnisse von einem typischen Experiment, das sie beschäftigt.
Trotz der Dienstprogramm und Wiederholbarkeit des Protokolls Knolle Flow Cytometry hat es ein paar Schwächen, die diskutiert werden sollte. Um zu beginnen, ist das Protokoll zeitintensiv, zwei Übernachtungen Inkubationen erfordern. Darüber hinaus erfordert das Protokoll einige teuren Reagenzien, insbesondere die Cellulasen und Macerozyme. Darüber hinaus sind die Vorbereitungen sehr zeitkritische, erniedrigende innerhalb weniger Stunden, die wodurch Durchsatz innerhalb eines einzigen Tages eingeschränkt werden kann, vor allem, wenn viele Veranstaltungen gewünscht werden. Zu guter Letzt ist das Protokoll, während zuverlässig, empfindlich auf Fehler im Rahmen der Probenvorbereitung, die alle scheinen die Kerne und niedriger Qualitätsergebnisse zu Schäden führen. Beispielsweise kann mikrobieller Kontamination während der Plasmolyse und Protoplasten Generation Schritte (1 – 3,4) durch unsachgemäße aseptische Technik auftreten. Probe Verunreinigungen, während den Erfolg einer Probe nicht immer auszuschließen scheint, Qualität der erhaltenen Histogramme, wieder wahrscheinlich wegen Schäden an den Kernen drastisch zu verringern.
Wie bereits erwähnt sind die größten Nachteile des Protokolls Kosten, Zeit und Empfindlichkeit zu Fehlern. Forscher sollten Maßnahmen ergreifen, um diese zu mildern. Da Kosten Forscher, die beabsichtigen, die Anwendung des Protokolls zu viele Proben können prüfen, ändern die Enzymkonzentrationen und/oder die Dauer der Verdauung Schritt als verschiedene Gewebe und Genotypen variieren in Reaktionsfähigkeit. Dies beinhaltet die Möglichkeit der Filterung und recycling der ES die bisher aber nicht nachgewiesen wurde hier21eingesetzt. Für die Zeit, in unserer Beobachtung ist es möglich, mit der ersten Inkubation (Plasmolyse Schritt) zu verzichten und noch extrahieren Protoplasten; jedoch werden ihre Integrität und Fülle leiden, das wirkt sich negativ auf Ergebnisse. Um die Verschlechterung der Proben zu verringern sollten Forscher, dass einige Flow Cytometry Ansätze die Verwendung von Fixiermittel (z.B. Formaldehyd beinhalten), Probe Integrität22zu bewahren. Dies ist möglicherweise ein nützliches Mittel sowohl Verschlechterung zu verhindern und eine Probe Speicher anstatt Protoplasten Eintreibungskosten und Flow Cytometry Auftritt am selben Tag wie präsentiert erlauben. Ein weiteres Mittel zur Verhinderung der Abrieb der Kerne möglicherweise einen Nuklease-Hemmer ES und/oder FBC gehören; während 2-Mercaptoethanol keine spürbaren Veränderungen während der Entwicklung erfolgen, haben andere Inhibitoren hierin nicht getestet.
In unserer Beobachtung ist der kritischste Schritt Schritt 4.4, die Entfernung von allen Plasmolyse Waschlösung vor der Zugabe des Puffers Flow Cytometry (FCB). Wenn auch ein kleines Volumen (< 10 µL) bleibt, die Proben sind viel eher abgebaut werden, die auf eine schlechte oder sogar fehlerhafte Stichprobe führen können. Dies ist wahrscheinlich auf Verunreinigungen innerhalb der Enzymlösung (z.B. Nukleasen, Proteasen)23,24 , die schnell die Kerne während der Inkubationszeit und Zeit zwischen Probe läuft, auch bei geringen Konzentrationen beeinträchtigen. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Dauer der Inkubation PI und RNase Schritte. Wie im Protokoll erwähnt, bleiben die Proben nicht stabil für mehr als ein paar Stunden nach Zugabe der FCB so Forscher entscheiden können, die diese Schritte, um Platz für weitere Proben oder langwierige Durchflusszytometrie kürzen läuft aus niedrigen Kerne Konzentrationen. Dies erfordert auch den Forscher zu prüfen, einen Kompromiss zwischen der Anzahl der Ereignisse pro Probe und Gesamtzahl der Proben ausgeführt werden oder die Verwendung von Fixiermittel wie bereits erwähnt in Betracht ziehen.
Unterschiede zwischen Gewebe und Genotypen
Um Ergebnisse Vertreter des Protokolls zu bieten haben wir zwei einfache Experimente bestätigen bereits berichtet Variation von Gewebe und untersuchen den Einfluss der Diploidie und Genotyp entwickelt. Die Ergebnisse des Experiments Gewebe zeigen, dass das Protokoll reproduzierbare Ergebnisse liefert, wie Mark Gewebe wieder gefunden wurde, um die höchste EI zu haben. Etwas überraschend Parenchym Gewebe, das nicht zuvor bewertet hatte einen EI-Wert vergleichbar mit kortikalen Gewebe und deutlich niedriger als Mark. Dies war unerwartet, wie Parenchymzellen zumindest am Ende der Laufzeit in der Regel größer als entweder Mark oder kortikale Zellen sind. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Knollen (90-130 g) zu unreif für die Parenchymzellen, die am Ende der Laufzeit voll ausgebaut und erreicht ihre maximale C-Werte25haben die Mehrheit der Knolle Volumen umfassen. Dies könnte auch erklären, warum die Dihaploid (VT_SUP_19) und die doppelte Dihaploid (VT_SUP_19 4 X) zeigte deutlich mehr EI als CV Superior Knollen; Während jeder Genotyp Knollen etwa gleichgroßen entnommen wurden, ist die maximale Größe der Knollen von VT_SUP_19 oder der isogenen tetraploiden viel kleiner als der der Stammvater. So kann es sein, dass sie größere EI einfach angezeigt weil sie größer im Vergleich zu ihrer Maximalgröße erreichbar waren. Alternativ kann der Unterschied eine Folge der genetischen Ergänzung sein erhielt VT_SUP_19 von seiner tetraploiden Stammvater. Eine andere Möglichkeit ist, dass die genomische Reduktion, die Gewinnung von der Dihaploid aus der tetraploiden aufgetreten entlarvt schädlichen Allele was anlagenweite Stress, das auch gezeigt worden kann, hat um zu erhöhten EI26beitragen. Allerdings zeigt dies, dass die sorgfältige Prüfung Forscher beschäftigen müssen, bei der Auswahl der Knollen und Gewebe für den Vergleich von EI-Werte, vor allem zwischen Genotypen verwendet werden.
Zukünftige Anwendungen
Das Protokoll in diesem Artikel beschriebenen bietet Forschern ein wichtiges Instrument für Verständnis Endoreduplikation in Kartoffel. Es kann für Studien in der genetischen und ökologischen Komponenten der Endoreduplikation, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung über Knolle Gewebe und Bewertung der natürlichen Variation erlauben. Letztlich kann Endoreduplikation ein viel versprechendes Ziel zur Verbesserung der Kartoffel, ein Unternehmen machen, erfordern eine zuverlässige Mittel zur Bewertung.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde von der National Science Foundation Award Anzahl 1237969, “Entwirren der Heterozygotie, allelische Zusammensetzung und Copy Number Variation der Kartoffel” finanziert und USDA spezielle Grant 2014-34141-22266 (University of Maine), RV
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |