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Neuroscience

Eine objektive und reproduzierbare Test der olfaktorischen Lern- und Diskriminierung bei Mäusen

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57142
* These authors contributed equally

Summary

Hier trainieren wir Mäuse auf eine assoziative Lernaufgabe Geruch Diskriminierung zu testen. Dieses Protokoll ermöglicht auch Studien zu lernen-induzierten strukturellen Veränderungen im Gehirn.

Abstract

Geruchssinn ist die vorherrschende sensorische Modalität bei Mäusen und beeinflusst viele wichtige Verhaltensweisen, einschließlich der Nahrungssuche, Raubtier-Erkennung, Paarung und Elternschaft. Wichtig ist, können Mäuse zuordnen neue Gerüche mit bestimmten Verhaltensreaktionen Einblick in olfaktorische Schaltung Funktion trainiert werden. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Ausbildung Mäuse auf ein Go/No-Go operant Lernaufgabe. Bei diesem Ansatz Mäuse sind auf Hunderten von automatisierten Tests täglich für 2 – 4 Wochen trainiert und können dann auf neuartige Go/No-Go Geruch Paare beurteilen olfaktorische Diskriminierung, oder verwendet werden, für Studien über wie Geruch lernen die Struktur oder Funktion des die olfaktorischen verändert getestet werden Stromkreis. Darüber hinaus bietet die Maus Riechkolben (OB) Integration von Erwachsenen geboren Neuronen. Interessanterweise erhöht olfaktorische lernen das Überleben und die synaptischen Verbindungen dieser Neuronen Erwachsenen geboren. Dieses Protokoll ist daher, kombinierbar mit anderen biochemischen, elektrophysiologischen und bildgebenden Techniken Lernende und Tätigkeit-abhängige Faktoren zu untersuchen, die neuronale überleben und Plastizität zu vermitteln.

Introduction

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Die Maus OB, wo Geruch Informationen zuerst das zentrale Nervensystem (ZNS) eingibt, liefert ein hervorragendes Modell um Erfahrung-abhängige strukturelle Veränderungen zu untersuchen. OB Schaltungs integriert kontinuierlich Erwachsenen geboren Neuronen in einer Aktivität-abhängigen Weise. Erwachsenen geboren Neuron Vorstufen Teilen aus von Vorfahren, die die subventricular Zone angrenzend an der seitlichen Ventrikel1Linie. Bei der Migration in den OB, diese neuronalen Vorstufen überleben, zu unterscheiden, und integrieren Sie als hemmende Granulat Zellen oder Apoptose2zu unterziehen. Auswahl für das Schicksal der Zelle wird durch olfaktorische Aktivitäten, einschließlich der olfaktorischen lernen3,4,5,6beeinflusst. Nach der Integration treten lernen-induzierte Synaptische Veränderungen in Granulat Zellen während einer zweiwöchigen kritische Periode7,-8. Somit eignen sich Assays für olfaktorische lernen für die Prüfung wie Erfahrung-abhängigen Plastizität Einflüsse strukturelle und funktionelle Reorganisation einer ausgereiften Gehirn-Schaltung.

Dieses Protokoll bietet eine olfaktorische Ausbildungsansatz mithilfe einer operanten Konditionierung Paradigmas. In dieser Aufgabe sind Wasser entzogen Mäuse ausgebildet, um eine Testversion Timeout-Strafe ein Geruch ("Go" Geruch) mit einer Wasser-Belohnung und einen anderen Geruch ("No-Go" Geruch) zugeordnet. Mäuse-Fortschritt durch eine abgestufte Reihe von Ausbildungsphasen im Laufe von 2-4 Wochen. Wenn die Ausbildung abgeschlossen ist, Mäuse reagieren auf den Go oder No-Go Geruch mit diskreten, entsprechende Verhaltensweisen (Suche nach Wasser Belohnung auf Go Studien und nicht der Suche nach Wasser Belohnung über No-Go-Studien) (Abb. 1A). Nach der Ausbildung abgeschlossen, ist Mäuse können weiter mit chemisch ähnlichen Geruch Paare in Frage gestellt werden, um Diskriminierung zu testen oder zu umgestellt werden Studien untersuchen wie olfaktorische lernen die Struktur oder Funktion des die OB. verändert Obwohl Geruch Diskriminierung Aufgaben zuvor beschrieben wurden, die meisten verlassen sich auf subjektive Messungen z. B. Anzahl der schnüffelt zwischen zwei Geruchsstoffe9,10. Darüber hinaus ist die Notwendigkeit für die menschliche Bewertung solcher Aufgaben auch zeitintensiv. Die Go/No-Go olfaktorische Lernaufgabe beschrieben in diesem Protokoll bietet eine unvoreingenommene, direkte Messung der Geruch Diskriminierung und olfaktorischen lernen.

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Protocol

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Alle Mäuse dienten unter ein Protokoll nach NIH-Standards vom Baylor College of Medicine institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. In diesem Protokoll verwendeten Mäuse waren alle erwachsenen Mäusen (> 6 Wochen alt) auf C57BL6/j Hintergrundinformationen und enthalten sowohl männliche als auch weibliche Mäuse. Nach Ausbildung/Inszenierung Aufgaben sind Mäuse in ihre Heimat Käfig zurück.

1. Aufbau und allgemeine Regeln für die Verwendung von operantes Lernen Box (Abbildung 1B, C)

  1. Montieren Sie eine Maus-Kammer mit Kammerboden. Halten Sie die Trainings-Box in einer verkehrsarmen, schwach beleuchteten Bereich um Ablenkungen zu vermeiden.
  2. Bohren Sie jedes Wasser-Anschluss mit einem kleinen Loch an der Spitze erlauben eine 18-Gauge-Nadel, Wasser im Hafen zu verzichten.
  3. Füllen Sie Glasflasche mit Geruchsstoff aufgelöst in Mineralöl (wöchentlich ersetzt), und ziehen Sie fest an der Kappe.
  4. Verbinden Sie 18-Gauge-Nadel mit Silikonschlauch. Stechen Sie Glassockel Fläschchen mit 18-Gauge-Nadel, und schließen Sie andere Silikonschlauch auf die Einnahme der Geruch Häfen.
  5. Platzieren Sie jedes Silikonschlauch in eine Geruch-Ventil.
  6. Die Vakuumleitung an die Geruch-Ports anschließen.
  7. Ein Stab aus Metall halten beimessen Sie zwei 10 mL Spritzen, und schließen Sie Schläuche an die Spritzen. Verbinden Sie die andere Seite des Schlauches mit einer Nadel 18 G. Passen Sie die Nadel in die Bohrung der Nase Poke-Port auf der Maus-Kammer. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauches, das Wasserventil.
  8. Füllen Sie die zwei 10 mL Spritzen mit Nagetier Trinkwasser.
  9. Verbinden Sie eine Air-Flow-Meter mit dem Lufteinlass und erhalten Sie Luftstrom bei 3 – 5 L/min zu.
  10. 2 Ventile, 2 Geruch Ventile, 2 Wasser-Anschlüsse, Geruch Port und macht auf das USB-Interface-System zu verbinden. Schließen Sie alle Ventile auf "Output" Ports, den Geruch und Wasser Häfen zu 'Input' Häfen. Schließen Sie alle Geräte Strom Ausgänge aus dem USB-Interface-Box an, und zu guter Letzt schließen die USB-Interface-Box an.
  11. Passen Sie die Vakuum-Saug zur Vermeidung von Kreuzkontamination von Gerüchen zwischen Studien.
  12. Verwenden Sie Geruch-spezifische Schlauch Verbindung Duftstoff Fläschchen an die Kammer.

(2) Maus-Zubereitung: 1 – 3 Tage

  1. Mäuse in 3 Gruppen unterteilen: Kontrolle (keine olfaktorische Schulung notwendig), Pseudo-ausgebildete (Mäuse, die Belohnung oder Bestrafung nach dem Zufallsprinzip erhalten), und Gruppen ausgebildet. Setzen Sie Pseudo-ausgebildete Mäuse auf die Ausbildung Box und Geruch Lieferung aus, sondern bieten Sie keine olfaktorische Ausbildung, weil das Ergebnis von Belohnung und Strafe nach dem Zufallsprinzip verbunden ist mit dem Geruch geliefert.
    Hinweis: Die Pseudo-ausgebildete Gruppe wird das Training Paradigma unter den "Pseudotraining"-Phasen durchlaufen. Ausgebildete Mäuse werden alle Stufen der Ausbildung abzuschließen. Pseudotraining ist optional, wenn der Zweck des Experiments ist es, assay für Verhaltensunterschiede Geruch Diskriminierung oder lernen. Das Protokoll vorausgesetzt, hier fügt dieser Gruppe, wenn der Experimentator neuronalen Unterschiede vor und nach dem Training untersuchen will. Die pseudotrained Gruppe würde dann für die passive Geruch Belichtung und nicht-olfaktorische Verwandte Training steuern.
  2. Beginnen Wasser Einschränkung bei Mäusen auf 40 mL/kg/Tag. Vermeiden Sie Körpergewicht Verlust mehr als 20 % der Tiere Grundlinie Gewicht zur Vermeidung von Stress (Abb. 2A).
  3. Wiegen Sie die Mäuse täglich, um sicherzustellen, dass sie über 80 % der Grundlinie Gewicht sind. Wenn eine Maus unterhalb dieser Schwelle fällt, entfernen Sie die Maus aus der Studie und ermöglichen Sie freien Zugang zu Wasser.
  4. Alle Umweltfaktoren im gesamten Protokoll einschließlich Temperatur, Lärm und streunende Gerüche (einschließlich persönliche Körper und Parfüm/Köln/Deodorant-Düfte) konstant zu halten.
    Hinweis: Wie bei allen Tierverhalten testen, können kleine Veränderungen der Umwelt stark Ergebnisse beeinflussen.

3. Anleitung für alle Stufen

  1. Trainingssoftware für jede Stufe unten Code. Starten Sie die Software auf der behavioral Software.
    Hinweis: Codierung für alle Stufen in zusätzliche Codierung Dateien enthalten sind. Daten für 20 Wanderwege sind gruppiert, wie eine einzelne Block und Maus Performance über Blöcke angezeigt wird. Darüber hinaus kann jede Stufe wiederholt werden auf einer Maus für eine Anzahl von Tagen bis Fertigstellungskriterien erfüllt sind.
  2. Halten Sie Mäuse nicht im Feld "Verhalten" für mehr als 60 min/Tag.
  3. Saubere Maus Abfälle aus dem Käfig, bevor jede Maus in den Käfig übertragen werden. Sprühen Sie und wischen Sie die Kammer mit 70 % Ethanol, Maus Geruch Ablenkung zu minimieren.

4. Ausbildung Stufe 1: Zuordnen von Wasser Belohnung mit einem Center Nase Poke, 1 – 3 Tage

  1. Ordnen Sie in dieser Phase Mäuse mit einer Wasser-Belohnung bei der Auseinandersetzung mit den Wasser-Anschluss zu
  2. Ausbildung Stufe 1 Programmieranleitung
    1. Programmieren Sie diese Phase nur Wasser Lieferung Port verwenden. Lassen Sie die Maus eine Wasser-Belohnung für jede Nase Poke.
      Hinweis: Das Programm gibt die Dauer des Verfahrens und die Gesamtzahl der Wasser belohnt die Maus erhalten.
  3. Legen Sie die pseudotraining Stufe 1 Programmierung Training Stufe 1 identisch.
  4. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Konfigurieren Sie Feld Verhalten mit einem Wasser-Anschluss in der Mitte und mit allen Seite Ports nicht zugegriffen werden. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie der Stufe 1-Programm zu.
  5. Betrachten dieser Phase als abgeschlossen, wenn die Maus 100 Versuche innerhalb von 60 min. entfernen erreicht die Maus aus der Kammer nach 60 min oder 100 Studien wurden abgeschlossen (Abbildung 2B).
    Hinweis: Aufgrund von individuellen Unterschieden, werden einige Mäuse natürlich unterlassen Feld zu erkunden.
  6. Wenn Unterstützung benötigt wird, liefern Sie manuell Wasser in den Wasser-Anschluss. Wiederholen Sie diese Bühne für bis zu 3 Tage.
    Hinweis: Mäuse, die bereits ausgebildet werden können weitere Parität zu halten und zu halten auf flüssige Beschränkung wiederholt werden. Es ist auch möglich, eine ganze Gruppe auf Stufe 2 zu fördern, wenn der Konzerndurchschnitt 100 Studien/60 min erreicht. Dadurch wird für alle Mäuse, Ausbildung am selben Tag fortzusetzen.

5. Ausbildung Stufe 2: Seitenanschluss Wasser Belohnung zuordnen Zentrum Port Nase Poke, 1 – 5 Tage

  1. Lassen Sie in dieser Phase die Mäuse stecken Sie ihre Nase in Zentrum Port und erhalten dann sofort eine Wasser-Belohnung auf der Seite-Häfen.
  2. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Konfigurieren Sie das und jeder nachfolgende Phase mit 2 Wasser Anschlüsse an den Seiten und dem Geruch-Hafen in der Mitte. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie der Stufe 2-Programm.
  3. Ausbildung Stufe 2 Programmieranleitung
    1. Bieten Sie die Maus eine Belohnung sofort Wasser auf beiden Seiten nach einer Nase Poke ins Zentrum Geruch Druckstutzen. Ausgabeparameter für diese Stufe eingestellt, als die Dauer der Prüfung, die Anzahl der Versuche eingeleitet und die Anzahl der Wasser-Belohnungen erhalten innerhalb von 5 s von einer Nase Poke.
  4. Legen Sie die pseudotraining Stufe 2 Programmierung Ausbildung Stufe 2 identisch.
  5. Diesem Zeitpunkt als abgeschlossen zu betrachten, wenn ein Minimum von 40 Studien erfolgen in 60 min, mit mindestens 25 % Wasser Belohnungen erhalten innerhalb von 5 s von der Mitte Port Nase Poke. Entfernen Sie die Maus nach Abschluss dieser Phase (Abbildung 2C) hat.
    Hinweis: Das Trainingsprogramm berechnet den Prozentsatz von Wasser Belohnungen erhalten rechtzeitig um Abschluss dieser Phase zu bestimmen. Mäuse wie schnell unterscheiden sich zwar in Abschluss dieser Phase, die meisten Mäuse Fertigstellungskriterien innerhalb von 5 Tagen erreicht. Jedoch wenn eine Maus dieser Phase nicht innerhalb von 5 Tagen abgeschlossen wurde, nicht voraus die Maus in die nächste Phase. Diese Maus wird aus der Kohorte entfernt werden.

6. Ausbildung Stufe 3: Zuordnen von Wasser Belohnung mit einem bestimmten Geruch und innerhalb eines bestimmten Zeitfensters, 1 – 3 Tage

  1. Lassen Sie in dieser Phase die Mäuse, die einen gehen (s +) Geruch auf eine Nase Poke im Zentrum Port erhalten. Anschließend liefern Wasser Belohnung auf eine Nase Poke in die Seite Wasser Anschlüsse innerhalb von 5 s.
  2. Ausbildung Stufe 3 Programmieranleitung
    1. Die s + Geruch in der Mitte Geruch Port zu liefern.
    2. Die Wasser-Belohnung zu liefern, wenn die Maus die Seite-Häfen innerhalb von 5 steckt s Lieferung einer Geruch.
      Hinweis: Das Programm beginnt mit nur erfordern ein 100ms Nase Stich ins Zentrum Port um eine Wasser-Belohnung zu erzielen. Sobald die Maus Zentrum Port für die richtige Menge an Zeit in 80 % der Studien stößt, die Zeitdauer von einer Nase Poke erforderlich für eine Wasser-Belohnung von 50 ms erhöht wird bis zu 400 ms.
    3. Legen Sie die Ausgabeparameter identisch mit Stufe 2.
  3. Festlegen der pseudotraining Stufe 3-Programmieranleitung als Training Stufe 3. Jedoch schließen Sie nicht die s + Geruch an den Geruch Anwendungsbereitstellungs-Controller, um sicherzustellen, dass die s + Geruch nicht mit Wasser Belohnung verbunden ist.
  4. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Die gleiche Konfiguration auf Stufe 2 eingestellt.
    2. Die s + Geruch an den Geruch Anwendungsbereitstellungs-Controller anschließen. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie der Stufe 3-Programm zu. Sobald diese Phase abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus.
  5. Berücksichtigen Sie es gibt mehr als 60 Belohnungen innerhalb von 60 min (Abbildung 2D) dieser Phase als vollständig.

7. Etappe 4A: Zuordnen von No-Go (s-) Geruch und Timeout Strafe, 1 – 2 Tage

  1. Stellen Sie in dieser Phase die Mäuse ein No-Go-Geruch (s-). Bieten Sie eine Auszeit-Strafe für die Mäuse, die fälschlicherweise auf die Wasser-Anschlüsse gehen nach der No-Go-Geruch riechen.
  2. Ausbildung Stufe 4A Programmieranleitung
    1. Liefern Sie nur den s + Geruchsstoff in dieser Phase zu Beginn identisch mit Stufe 3. Beginnen Sie nach Mäusen komplett 40 Studien random Lieferung der Gerüche, s + und S-Gerüche aufzunehmen. Programm 2-s Timeout Strafe, wenn die Maus versucht, eine Wasser-Belohnung suchen nach präsentiert die No-Go-Geruch.
      Hinweis: Um Hilfe bei der Unterscheidung von Go vs. No-Go, IR-Standlicht manipuliert werden können, so dass sie auf während Go Geruchsstoffe und berühren während No-Go-Geruchsstoffe. Die Lichter fungieren als sekundäre Cue, Mäuse in der Erstausbildung zu unterstützen. Wenn Mäuse mit den Lichtern ausgebildet sind, sollten sie unter Go Training ohne Licht zu bestätigen, dass sie die Aufgabe mit Gerüchen gelernt haben.
    2. Legen Sie die Ausgabeparameter als Dauer der Studie, Anzahl der Versuche eingeleitet, Anzahl der Versuche abgeschlossen, % richtig und Gesamtzahl der Belohnungen erhalten.
  3. Pseudotraining Stadium 4A Programmieranleitung dasselbe als Trainingsphase 4 mit Ausnahme von s + s und S-Gerüche werden von Anfang an nach dem Zufallsprinzip vorgestellt. Geben Sie Wasser Belohnung oder Timeout Strafen nach dem Zufallsprinzip, ungeachtet der Aufgabenleistung.
  4. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Set-Box-Konfiguration als vorherige Stufe 3.
    2. S + und S-Geruch, der Geruch Anwendungsbereitstellungs-Controller anschließen. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie das Bühnenprogramm 4A. Schalten Sie nach den Mäusen komplett 40 versuchen das Programm, nach dem Zufallsprinzip die Gerüche zu liefern. Sobald diese Phase abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus.
  5. Berücksichtigen Sie es gibt 40 Studien mit > 60 % richtigen Antworten dieser Phase als vollständig.

8. Etappe 4 b: Zuordnen von No-Go (s-) Geruch und Time Out Strafe, 5 – 11 Tage

  1. Ausbildung Stufe 4 b Programmieranleitung
    1. Dieser Phase identisch mit Stufe 4A, zu machen, jedoch ist die Timeout-Strafe für Versuch Wasser Belohnung nach einer S-Geruch 4 s.
  2. Legen Sie die Pseudotraining Stufe 4 b Programmieranleitung identisch mit Stufe 4A, aber Wasser Belohnung und Auszeit Strafe werden nach dem Zufallsprinzip pro Testversion geliefert.
  3. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Set-Box-Konfiguration als vorherige Stufe 4A.
    2. S + und S-Geruch, der Geruch Anwendungsbereitstellungs-Controller anschließen. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie das Bühnenprogramm 4 b. Berücksichtigen diese Phase abgeschlossen gibt es > 100 Versuche innerhalb von 60 min mit Genauigkeit > 85 % (Abb. 2E)
  4. Überwachen Sie den maximalen und minimalen Prozentsatz korrekt für jede Sitzung, jede Maus Fortschritt in dieser Phase zu verfolgen. Ca. 85-90 % der Mäuse erreichen Fertigstellungskriterien für diese Phase. Schließen Sie Mäuse, die Fertigstellung dieser Phase für die Go/No-Go Testphase nicht erreichen.
  5. (Optional) Am Ende dieser Phase gelten Sie ein Umkehr-Training, wo der Geruch Fläschchen Plattform Go/No-Go Geruchsstoffe eingeschaltet sind. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht mit einen anderen Reiz, wie das Geräusch der Ventile die Seite Ports zugeordnet sind.

9. Go/No-Go assay Aufgabe: 1 Tag, 20 Min per Mausklick pro Tag

  1. Betrachten Sie dies als die letzte Etappe zur Genauigkeit der Geruch Verbände erkennen und lernen, Geruch Paare diskriminieren zu bestimmen.
    Hinweis: Neuartige Geruchsstoffe werden genutzt für S + / S-testen Sie wie lange Tiere nehmen, um neue Zusammenhänge zu lernen. Strukturell ähnlichen Geruchsstoff Paare werden verwendet, um die Aufgabe schwieriger. Beispiele hierfür sind 1-Butanol vs. 1-Pentanol, Isoamyl Acetat vs. Isoamyl Butyrat und + Carvon vs. - Carvon.
  2. Programmieranleitung
    1. Lassen Sie die Trainings-Software die Länge der Nase Poke ermitteln. Programmieren Sie ein 300 ms Nase Stich ins Zentrum Geruch Port, die Aufgabe auszuführen.
    2. Setzen die Ausgabeparameter identisch mit Stadium 4 b, außer nicht mit jedem Licht geführt, Hinweise.
  3. Box-Konfiguration und Maus-setup
    1. Set-Box-Konfiguration als vorherige Stufe 4 b.
    2. S + und S-Geruch, der Geruch Anwendungsbereitstellungs-Controller anschließen. Legen Sie eine Maus in der Kammer. Schließen Sie die Maus-Kammer und beginnen Sie der Bühne Go/No-Go-Programm zu. Setzen Sie die Mäuse, die das olfaktorische Lernaufgabe zu neuartigen Paare von chemisch ähnliche Gerüche gelernt haben.
      Hinweis: Wildtyp-Mäusen mit ausreichenden Geruch Diskriminierung erreichen > 85 % Genauigkeit mit neuartigen Geruchsstoffe nach ca. 10-20 Blöcke oder 200-400 Studien(Abbildung 3).

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Representative Results

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Wenn Mäuse die olfaktorischen Lernaufgabe gelernt haben, können sie jetzt neuartige Geruch Paare mit Belohnung und Bestrafung verknüpfen. Diese ausgebildeten Mäuse beginnen normalerweise mit etwa 50 % Genauigkeit auf die Go/No-Go-Aufgabe. Der richtigen Prozentsatz kann durch Test Block als eine Lernkurve für neuartige Geruch Paare(Abbildung 3)dargestellt. Innerhalb 10 Block-Studien, die meisten Mäuse weniger als 30 min durchführen zu nehmen, sind die Mäuse in der Lage, richtig zu unterscheiden zwischen Gerüche mit mehr als 85 % Genauigkeit (rote Linie). Dies zeigt, dass unser Protokoll Wildtyp-Mäusen, eine Wasser-Belohnung und zum anderen mit einem Timeout Strafe ein Geruch zugeordnet erfolgreich trainiert hat. Um die Diskriminierung Fähigkeiten zwischen zwei Kohorten zu beurteilen, können diese Daten weitergehend analysiert werden, um die Anzahl der Studien erforderlich, um 85 % Leistungsfähigkeit (Abbildung 3B) zu erreichen oder um die durchschnittliche Prozent korrekt zu vergleichen, nach Kompetenz erreichen.

Wenn Mäuse die Aufgabe vertraut sind, können Geruch Paare geändert werden, um erhöhen oder verringern Sie die Schwierigkeit der Aufgabe. Beispielsweise erhöht verringert die Geruch-paar-Konzentration die Schwierigkeit der Aufgabe (Abb. 3C). Diese Analyse kann die Schwelle der Erkennung für verschiedene Mäuse Kohorten offenbaren. Darüber hinaus können Geruch Paare geändert werden, um mehr strukturell ähnlich geworden (d. h. Enantiomere oder einzelne Kohlenstoff Unterschiede). Geruch-Mischungen können auch verwendet werden, Erhöhung der Schwierigkeit der Aufgabe (d.h., 40/60 Mischung vs. Mischung von 30/70).

Mäuse sind auch in der Lage, frühere Gelehrte Geruch Paare erinnern. Nach einer Wartezeit von 7 Tagen seit der Lernaufgabe, erfuhr eine Rückruf-Test-Show, die Wildtyp-Mäusen zuvor schnell merken können Geruch Verbände (Abbildung 3D).

Figure 1
Abbildung 1 : Go/No-Go Ausbildung Paradigma und Geräte-Konfiguration. (A) Mäusen reagieren richtig durch entweder herbeiführende Wasser während gehen Geruch Präsentation oder durch Verzicht bei No-Go-Geruch-Präsentation. (B) das Verhalten-Box ist so konfiguriert, dass nur ein einzigen Wasser-Anschluss erreichen Sie in Phase 1 und alle nachfolgende Stufen eine zentrale Geruch Druckstutzen und zwei Wasser-Anschlüsse enthalten. Blauer Kreis: Wasser Anschluss. Grüner Kreis: Geruch Port. (C) Geruch Lieferung mit einem Geruch Ventil für jeden Geruch eingezäunt ist. Lufteinlass Überdruck führt zu einem Verteiler. Rote Pfeile zeigen positive Luft Druckleitung in das vorbereitete Geruch Fläschchen (roter Kreis). Blauer Pfeil zeigt Luft/Geruch Mischung verlassen die Geruch-Fläschchen und ein Geruch-Ventil (hellblauen Kreis) auf der Durchreise und betreten einen weißen Air Box zu integrieren. Oranger Pfeil zeigt Überdruck Luft geht an einem Zentralregler Ventil (orangefarbener Kreis) zur Integration von Box zu positiver Luftdruck Geruch/Luft-Gemisch von Integrator-Box, der Geruch Druckstutzen (unteren schwarzen Pfeil) drücken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Trainingsdaten. (A) Mäuse Körpergewicht Prozentsatz fällt nicht unter 80 % während auf flüssige Beschränkung. Rote Linie = 80 %-Schwelle. N = 8 Mäuse. (B) Stufe 1 Trainingsergebnisse zeigen die Anzahl der Mitte Port stochert in 60 min Wasser Belohnung erhalten. N = 8 Mäuse. Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts. (C) Stufe 2 Ausbildung Ergebnisse Prozentsatz von Wasser Belohnungen erhalten innerhalb von 5 zeigen s von Mitte Nase Poke. Rote Linie ist die Schwelle von 25 %. Meine Prozentsatz mit grauen Hervorhebung als Standardfehler des Mittelwerts. N = 8 Mäuse. (D) Stufe 3 kumulativen belohnt zeige Zahl der Belohnungen von 8 Mäuse an Tag 1 und Tag 2 der Ausbildung erhielt. Rote Linie ist 60 Belohnung Schwellen. Fehlerbalken sind Standardabweichung. (E) Stufe 4 b Genauigkeit Ergebnisanzeige Prozent richtige Antworten für Phase 4 b. Rote Linie liegt bei 85 % der Schwelle. Durchgezogene schwarze Linie ist gemein und Standardfehler des Mittelwerts ist grau hervorgehoben. N = 4 Mäuse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vertreter ergibt sich für Go/No-Go Aufgabe. (A) Go/No-Go Aufgabe für 2 neue Geruchsstoffe (s + = Isoamyl Acetat/S-= Amyl Acetat) nach Mäusen auf Eugenol (s +) und Eukalyptol (s-) ausgebildet wurden. N = 5 Mäuse mit Standardfehler von Mittelwert in grau. Grüne Linie ist 50 % Genauigkeit, rote Linie ist die Schwelle 85 % Genauigkeit. (B) Beispiel für Go/No-Go-Aufgabe für eine Maus, die ein schneller Lerner im Vergleich ein langsamer Lerner-Maus für Hexanol (s +) und Buttersäure (s-) wäre. (C) Go/No-Go Aufgabe für unterschiedliche Partialdrücke von Hexanol (s +) und Buttersäure (s-). (D) Fähigkeit von Mäusen, Geruch paar 7 Tage nach dem Training zu erinnern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Das Nagetiere olfaktorische System bietet ein einzigartiges Modell um sensorische abhängigen Plastizität zu studieren. Hier präsentieren wir eine olfaktorische lernen Paradigma um Mäuse zuzuordnende Geruchsstoff Paare entweder eine Belohnung oder Strafe zu trainieren. Durch diese Lernaufgabe können nachgeschalteten Stromkreis Änderungen in späteren Experimenten (Elektrophysiologie, in Vivo neuronale Bildgebung, usw.) untersucht werden. Nach der Fertigstellung werden Mäuse lernen, zur Durchführung einer einfachen Geruch wartenden Aufgabe um eine Wasser-Belohnung mit einem Geruch und eine Timeout-Strafe mit einem anderen Geruch zu verknüpfen.

Da dies ein Verhaltens-Assay, wir empfehlen eine gleichmäßige Verteilung von Alter und Geschlecht unter experimentellen Nutzung und Tiergruppen zu kontrollieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Bedingungen zwischen Mäusen gehalten werden so konstant wie möglich. Beispielsweise sicherstellen Sie, dass die Mäuse Handler und Lichtverhältnisse während des Trainings konstant bleiben. Wenn viele Mäuse wie erwartet nicht die Aufgabe ausführen, stellen Sie sicher die folgenden Bedingungen erfüllt sind: (1) halten Sie das Verhalten Setup so leise wie möglich. (2) Wasser nehmen die Mäuse ausreichend. Wir finden, dass sogar nach einem ganzen Tag der Wasserentzug, viele Mäuse nicht ausreichend genug vom Zentrum Port 1 Stagebox Fertigstellungskriterien zu trinken. (3) zu Beginn jeder neuen Maus überprüfen Sie die Geruch/Ventile und Rohre um die richtige Platzierung zu gewährleisten. (4) Riechstoffe variieren in ihrer Flüchtigkeit und daher einige verdunstet schneller als andere. Ersetzen Sie leichter flüchtigen Geruchsstoffe mit höheren Dampfdruck statt wöchentlich, täglich, besonders, wenn niedrigere Konzentrationen verwendet werden.

Dieses Protokoll kann nach dem experimentellen Zweck geändert werden. Wenn die Lernzeit in Stufe 4 b wichtig ist, kann dann es ratsam, keine Gerüche bis zu diesem Zeitpunkt zu entfernen sein. Dies stellt sicher, dass olfaktorische lernen bei Stufe 4 b beginnt. Um dies zu erreichen, haben wir dieses Protokoll durch den Geruch von Stufe 3 entfernen und durch das Auslassen von Stadium 4A ganz durchgeführt. Mäuse haben eine schwierigere Zeit Fertigstellungskriterien mit dieser Methode zu erreichen, aber das gibt auch wertvolle Informationen für wie schnell Mäuse diese Aufgabe zum ersten Mal lernen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass Mäuse haben in verschiedenen Phasen Anspruch bis olfaktorische Tests durchgeführt werden können. Daher kann zwar nicht von unserem Labor gesehen, eine Manipulation Wahrnehmung behindern, dass Stufe 4 b konsequent nicht erreicht wird. Wir haben versucht, dieses Problem zu negieren, indem sichergestellt wird, dass jeder einzelne Schritt ausreichend lang genug ist, damit die meisten Mäuse mit dem nächsten Schritt der Ausbildung zu absolvieren. Wenn eine Maus nicht Fertigstellungskriterien für eine Stufe auch nach der vollen Ausbildungszeit erreicht, entfernen wir die Maus aus der Kohorte. Dies ermöglicht es uns, das Studium fortzusetzen, ohne auf jeder einzelnen Maus warten. Eine weitere Einschränkung ist, dass wir noch haben, dieses Protokoll zu anderen Tiermodellen, die wichtig für den Bereich der Geruchssinn zu verlängern. Ratten, haben zum Beispiel bei der Enthüllung der neuronalen Funktion innerhalb der OB11,12wesentlich beigetragen. Aufgrund ihrer Intelligenz haben Ratten auch schneller als Mäuse13,14Lernzeiten. Trotz dieser Einschränkungen haben wir wegen ihrer genetischen Lenkbarkeit zur Durchführung von Zelle Art bestimmte Manipulationen und Aufnahmen15Mäuse für dieses Protokoll.

Die meisten vorhandenen Protokolle verwenden Sie Unterschiede im Geruch schnuppert oder Zeit weiter, um Gerüche, Diskriminierung oder lernen,4,6,9,10,16anzugleichen. Dieses Protokoll kann Diskriminierung eine Testversion von Testversion direkt messen. Darüber hinaus kann dies messen, die genaue Anzahl der Versuche jede Maus lernen, einen Verein muss. Dieser vollautomatische Ansatz entfernt jede menschliche Vorurteile aus der Datenanalyse. Futtertiere entzogen wurden auch erfolgreich für olfaktorische lernen eingesetzt. Wasser entzogen Mäuse wurden aufgrund der erhöhten Anzahl von Studien ausgewählt, die eine Maus mit Wasser über Essen16durchführen kann.

Als implantierbares Aktivität Monitoren wie bewertet-Index (Grinsen) Objektive und mehrgliedrige Elektroden weiter zu verbessern, wir bald in der Lage, diese Technologien zu kombinieren, mit diesem Protokoll17,18möglicherweise. Durch die Erfassung relevanter Hirnareale Form während des olfaktorischen Lernens, ist es möglich, wie neuronale Aktivitäten ändern während des assoziativen Lernens zu erforschen. Dies kann helfen, offenbaren grundlegende neurowissenschaftliche Fragen wie wie Neuronen Informationen anders während des Lernens zu kodieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte und keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Dieses Protokoll eignet sich von der früheren Arbeit in unserem Labor (Huang Et al. 8). alle hier beschriebene Methoden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) vom Baylor College of Medicine genehmigt worden. Es wird von der McNair Medical Institute, NINDS Grant R01NS078294, B.R.A., NIH IDDRC Grant U54HD083092, NIDDK Stipendium F30DK112571 JMP und NINDS Grant F31NS092435, CKM unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass vial Qorpak GLC-01016
Silicon Tubing Thermo Scientific 86000030
18 gauge needles BD 305196
1-Butanol Sigma Aldrich 437603
Propionic Acid Sigma Aldrich 402907
Mouse Chamber Med Associates ENV-307W
Chamber Floor Med Associates ENV-307W-GFW
Water Port Med Associates ENV-313W Need two
Odor stimulus Med Associates ENV-275 Contain 2 valves to gate odor delivery 
Odor Port Med Associates ENV-375W-NPP
USB Interface Med Associates DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter VWR 97004-952
Behavioral software Med Associates SOF-735 This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software Med Associates SOF-731 This software formats the data to Excel
Training Software Med Associates DIG-703A-USB This software is used to program each training stage
Water Valve Neptune Research 225P012-11 This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve Neptune Research 360P012-42 This valve is used to gate the odor delivery. Need Two

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6, (5), 507-518 (2003).
  2. Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22, (14), 6106-6113 (2002).
  3. Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102, (27), 9697-9702 (2005).
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Eine objektive und reproduzierbare Test der olfaktorischen Lern- und Diskriminierung bei Mäusen
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Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).More

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).

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