Summary
Nukleinsyre degradering arkivering vev, svulst heterogenitet og mangel på frisk frosne vevsprøver kan negativt påvirke kreft diagnostiske tjenester i rutinelaboratorier over hele verden. Dette manuskriptet beskriver optimalisering av et panel av biomarkers bruker en multiplex magnetiske perle analysen for å klassifisere brystkreft.
Abstract
Nukleinsyre degradering arkivering vev, svulst heterogenitet og mangel på frisk frosne vevsprøver kan negativt påvirke kreft diagnostiske tjenester i rutinelaboratorier over hele verden. Gene forsterkning og uttrykk diagnostiske tester arkivinnhold materiale eller materiale som krever transport til vedlikehold laboratorier, trenger en mer robust og nøyaktig test tilpasset gjeldende kliniske arbeidsflyter. Vår forskningsteam optimalisert bruk av Invitrogen™ QuantiGene™ Plex analysen (Thermo Fisken Naturvitenskapelig) å kvantifisere RNA i arkivmateriale bruker forgrenet-DNA (bDNA) teknologi for Luminex xMAP® magnetiske perler. Gene expression analysen beskrevet i dette manuskriptet er en roman, rask og multiplex metode som kan nøyaktig klassifisere brystkreft i ulike molekylær subtyper, utelater subjektivitet av tolkning i imaging teknikker. I tillegg lav input materiale kreves, heterogene svulster kan være laser microdissected med Hematoxylin og Eosin (H & E) farget deler. Denne metoden har et bredt spekter av mulige programmer inkludert svulst klassifisering med diagnostiske potensial og måling av biomarkers i flytende biopsier, som ville tillate bedre pasient ledelse og sykdommen overvåking. I tillegg er kvantitativ måling av biomarkers i arkivmateriale nyttig i onkologi research tilgang til biblioteker av klinisk kommenterte materiale, der retrospektiv studier kan validere potensielle biomarkers og sin kliniske utfall korrelasjon.
Introduction
Optimalisering av RNA basert analyser med formalin-fast parafin-embedded (FFPE) arkivmateriale er utfordrende på grunn av variasjoner i kirurgiske vev behandling og nedbrytning av RNA skyldes formalin brukes for vev integritet bevaring1, 2. For å overvinne begrensning av resultater nøyaktig gene expression studier fra arkivmateriale, brukt vår gruppe bDNA multiplex magnetiske perle analysen. I stedet for enzymatisk forsterkning av en mål-mal bruker bDNA teknologien hybridisering av bestemte sonder og forsterkning av en reporter signal3. Kort anerkjennelse sekvenser av fangst og gjenkjenning sonder er utformet til å hybridize kort fragmenter av målet RNA4. I tillegg overvinner bruk av vev homogenates som direkte utgangsmaterialet i denne analysen, uunngåelige tap av RNA som analyser krever forutgående RNA utvinning og rensing. Signalforsterkning, bruk av kort anerkjennelse sekvenser og utelukkelse av en rensing trinnet bidrar til reduksjon i teknisk variant av analysen. Teknologien gir muligheten til å multiplex analysen (opptil 80 RNA mål) og måle uttrykk for et panel av mål fra lav materiale inngang. Denne protokollen beskriver utarbeidelsen og flekker av for laser microdissection. Flekker på membran lysbildene lette avbilding av svulsten og histologiske arkitektur å gi nøyaktige utvalg og profilering av: (1) svulst og normal kanaler i brystvev, og (2) ondartet cellen kloner i heterogene svulster.
Molekylær klassifisering av brystkreft er en prosess som interrogates molekylære markører for å kategorisere pasienten svulster i tre molekylær klasser, dvs., luminal, menneskelige epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2)-beriket, og basal undertype. HER2-beriket undertypen er godt definert, med høy uttrykk for HER2 reseptoren, på grunn av ERBB2 genet forsterkning, kombinert med lav eller fraværende østrogenreseptor (ER) og progesteron reseptor (PgR). Luminal undertypen er generelt positive for ER og basale undertypen er i de generelle negativ for tre reseptorer (HER2, ER, PgR) og betydelig overlapper med trippel negative bryst kreft (TNBC) diagnostiske undertype5,6. Andre markører brukes til å fastsette epitel og mesenchymal egenskaper. Fibronectin (FN1) er en viktig komponent i bryst vev mesenchymal batterirommet. Økt FN1 uttrykk er ledsaget av høy Ki67 flekker, og viser en signatur for mer invasiv svulst7,8 og er forbundet med metastasering9. Interessant, ble FN1 funnet for å være til stede i microvesicles fra kreftceller, som forårsaket aktiveringen av mitogenic signaler i mottakerens fibroblaster10. Derfor sirkulerer microvesicles som exosomes er en potensiell markør for tidlig oppdagelse eller metastasering og tilbakefall11.
Svulst området utvalg for bryst kreft transcriptional subtyping blitt recurrently utført av macrodissection12,13. For å overvinne vev heterogenitet og øke følsomhet, har vi pålitelig kombinert klassisk vev flekker multiplex molekylær profilering metoder. Som et bevis på prinsippet, er to distinkte bryst kreft kloner definert ved sin epithelial mesenchymal signatur og metastatisk potensial. Arbeidsflyten beskrevet protokollen kan lett oversatt til gjeldende kliniske oppsett og brukes å selektivt isolere og karakterisere vev subtyper med målrettet mRNA profilering.
Protocol
Etiske godkjenning for bruk av bryst vev materialet i denne studien ble innhentet fra universitet forskning etikk Committee (UREC) av University of Malta (Ref: 22/2012).
1. vev forberedelse
- Bruk passende H & E prosedyrer14, forberede farget referanse vev deler og digitalt skanne lysbilder for referanse under microdissection.
- Bruker en mikrotom, kutt 20 µm vev deler på et RNAse uten vannbad på 40 ° C. Samle delene på membran lysbilder for laser microdissection med ren, RNase-dekontaminert utstyr og materialer.
- Tørr membran lysbildene på 37 ° C i en tørking inkubator over natten. Flekk bruker de riktige H & E prosedyre15 molekylærbiologi klasse løsninger og øke flekker tidspunktet for Hematoxylin til 6 min. Eventuelt flekken membran lysbildene med de riktige immunohistochemical protokoller16.
2. laser Microdissection
- Angi skyve grensene og kalibrere scenen bevegelse.
- Flytte visningen laser på et tomt område på et membran lysbilde. Kalibrere laser fokus ved å skyte en laser skutt på økende fokus intervaller (5%) til laser begynner å pierce gjennom membranen. Tegn og microdissect alle former og finetune laser fokus å maksimere effektiviteten laser under laser dissection.
- Øke hastigheten på scenen-bevegelsen til et punkt der laser disseksjon effektiviteten ikke er svekket. Kalibrer laser ved den valgte linsen og kalibrere på nytt hvis endre mål (laser hastighet på 1-15%), fokus på 70-75%, og makt på 90-100% ved 4 X målet.
- Skanne farget membran lysbildene med 4 X målet.
- Velg og omringe målområder for microdissection på membran lysbildet. Laser dissekere en minimal flate 42 mm2. Registrere området dissekert for å finne volumet av prøven homogenisere bufferen skal brukes.
- Bruk cap heis mekanismen for å hente dissekert delen på diffuser caps merket rør knyttet til riktig appendage. Hvis delen dissekert ikke hentes på hetten, gjenta laser Disseksjon av området.
3. vev Lysis
Merk: Flere løsninger og materiale leveres sammen med kits nevnt i Tabellen for materiale.
- Forbered nødvendig homogenisere blanding volumet for eksempel lysis bruker homogenisere løsning og proteinasen K i 60:1 forholdet.
- Pipetter 2,4 µL av homogenisere løsning i hver rør for hver 1 mm2 av vev, vortex for 10 s på maksimal hastighet og sentrifuger ved romtemperatur for 5 s 2500 x g.
- Inkuber i en oppvarming blokk ved 65 ° C i 12 – 18 h med skjelvende på 600 rpm.
- Sentrifuge lysates 21000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Bruker en pipette, nøye Sug opp klare nedbryting og støte inn i et merket frisk rør. Unngå aspirating vev/membran fragmenter som dette kan redusere kvaliteten på resultatene.
- Lagre klart nedbryting i-80 ° C fryser.
4. hybridisering-baserte analysen
- Utfør følgende forberedelser.
- Forvarm lysis blandingen ved å plassere reagensflasken i en inkubator på 37 ° C i 30 min og bland forsiktig ved inversjon.
- Hvis homogenates vev er frosset, tine ved romtemperatur og ruge på 37 ° C for 30 min. Vortex prøvene på den maksimale hastigheten etter inkubasjon.
- Angi risting inkubator på 54 ° C og plasser sonden i temperatur validering kit i en tom godt av en 96-brønns plate. Kontroller temperaturen på den digitale termometeret og delta temperaturen risting inkubator korrigere noen temperaturforskjell etter 2 timer.
- Tine og vortex sonden satt og blokkerer reagens for 10 s, sentrifuger ved romtemperatur for 5 s på 2500 x g og holde på is.
- Hold proteinasen K ampullen på is under bruk.
- Sonicate fange perler på 46 KHz i 3 minutter, deretter vortex på maksimumshastigheten for en annen 3 min.
- Forberede en 25 µL arbeider perle blanding per brønn ved å skalere opp følgende reagensene tilsvarende: 4,25 µL Nuclease-fritt vann, 16.65 µL av lysis blanding, 1.00 µL av blokkering reagens, 0,10 µL proteinasen k, 0,50 µL av fange perler, 2,50 µL av sonden.
- Vortex arbeider perle blandingen for 10 s med maksimal hastighet, deretter Pipetter 25 µL/godt i magnetiske deleplaten.
- Pipetter 25 µL vev homogenate til en magnetisk separasjon 96-brønns plate og 25 µL homogenisere løsning 3 brønner som de tomme feltene.
- Forsegle magnetiske deleplaten bruker en klar plast press sel og Plasser platen i kuvøse på 54 ± 1 ° C 18 – 22 h mens riste på 600 rpm.
- Forberede en 1 X vask buffer løsning for 24 brønner ved å blande 31,5 mL RNase gratis vann med 0,1 mL vask buffer komponent 1 og 1,67 mL vaske bufferen komponent 2.
- Fjerne platen fra inkubator. Still inn temperaturen av risting inkubator til 50 ± 1 ° C.
- Montere magnetiske deleplaten på håndholdt magnetisk plate vaskemaskinen og lås på plass. Fjern forseglingen press og vente 1 min for de magnetiske perlene å avgjøre.
- Vask trinn: Invertere magnetiske deleplaten montert på platen over vasken og blot forsiktig på et papir fjerne rester løsning. Bruke en flerkanals pipette legge 100 µL av 1 X buffer vaskeløsning i hver brønn vente 15 s. Gjenta dette trinnet for å vaske platen 3 ganger.
- Pipetter 50 µL av pre forsterker reagensen i hver brønn. Tetning av platen med en aluminium plate segl og riste platen på 800 rpm for 1 min ved romtemperatur. Inkuber 1t på 50 ± 1 ° C mens riste på 600 rpm.
- Gjenta steg 4,9 (vask trinn).
- Pipetter 50 µL av forsterker reagensen i hver brønn. Tetning av platen med en aluminium plate segl og riste platen som i trinn 4.10.
- Gjenta steg 4,9 (vask trinn).
- Vortex etiketten sonden for 10 s med maksimal hastighet. Legge til 50 µL av etiketten sonde i hver brønn. Seal og riste platen (trinn 4.10).
- Gjenta steg 4,9 (vaske trinn).
- Vortex Streptavidin phycoerythrin (SAPE) for 10 s med maksimal hastighet. Legge til 50 µL av SAPE i hver brønn. Seal og riste platen (trinn 4.10).
- Gjenta steg 4,9 (vask trinn) unntatt bruk SAPE vaske bufferen i stedet for vask buffer løsning.
- Legge til 130 µL av SAPE vaskebuffer hver brønn og sel plate med en aluminium plate segl. Riste platen på 800 rpm ved romtemperatur for 3 min.
- Oppstart den magnetiske perle analysatoren. Utføre kalibrering og verifisering rutinen ved å følge instruksjonene fra produsenten.
- Definere en protokoll på den magnetiske perle analyzer bruker følgende parametere: utvalgsstørrelsen: 100 µL; DD Gate: 5000-25,000; Tidsavbrudd: 90 s; Perle hendelse/perle Region: 100; og klikk Neste. Velg respektive perle tallene i panelet og Definer regionene perle med respektive målet gener som angitt av produsenten.
- Legge til en ny analyse ved å velge "opprette satsvise bruker en eksisterende protokollen" kategorien grupper . I plate oppsett angi brønnene som Ukjent eller tom, henholdsvis og gi en etikett for hvert utvalg i Samples -panelet.
- Fjern aluminium plate forseglingen fra 96-brønns reaksjon plate. Løs ut platen brettet ved å klikke på utløserknappen , laste inn platen i den magnetiske perle analysatoren. Klikk trekke| Kjøre Batch å starte analyserer. Etter lesing, løse ut og fjerne 96-brønns platen. Rengjør og stenge den magnetiske perle analysatoren som anbefalt av produsenten.
5. analyse
- I Batch| Kategori, Velg filen respektive analyse og klikker Eksporter to.csv . Åpne the.csv fil med et regnearkprogram.
- Observere perle teller og utelate noen resultater med < 40 perler/område.
- Jevne ut verdiene av Tom og arbeide ut standardavviket (SD) og grensen for påvisning (LOD) (tom gjennomsnitt + (3xSD)) per mål genet. Angi verdiene lavere enn LOD som usett.
Merk: Hvis noen av normalisering uttrykk verdiene er uoppdaget, anse eksempeldataene som utilstrekkelig. Vurdere uttrykk verdier over 20.000 som over øvre følsomhet grensen. Lysates av disse prøvene skal utvannet og re-analyseres. - Trekk tom gjennomsnittet fra rådata per genet.
- Beregne det geometriske gjennomsnittet av valgte normalisering genene per prøve. Normalisere personlige eksempeldata respektive geometriske middelverdien.
- Analysere data på data vitenskap plattformer eller bruker definerte algoritmer.
- Importere dataene til dataene vitenskap plattformen ved å klikke Legg til Data. Dra datafilen inn i Prosessen arbeidsområde og koble til en [Velg attributter] operatør, deretter til en viktigste komponenten analyse (PCA) operatør, og deretter til result havnen.
- I Velg attributtet operatør velge delsettet med data som normalisert genet og en nominell variabel som bryst kreft undertype. Kjøre prosessen klikker spill. Velg det:punktdiagram 3D farge"i diagramstilen og den nominelle variabelen i fargefeltet i kategorien diagrammer . Vurdere PCA data variasjon på en 3-dimensjonal tomt.
Representative Results
Metoden beskrevet er brukt for samtidig måling av 40 utskrifter i H & E farget (figur 1), microdissected (figur 2) degradert høyt FFPE materiale. Bruker denne metoden, viser vi nøyaktig karakterisering av reseptor status (figur 3A), klassifisering av svulster i luminal og basal molekylær subtyper17og differensial uttrykk for mesenchymal markøren, FN1, når du sammenligner svulst og matchet kontroll vev (figur 3B), i ulike reseptor positive og negative subtyper.
Figur 1: genuttrykk med H & E farget materiale. Sammenheng mellom en uttrykk profil avledet fra en unstained kvinne svulst delen sammenlignet med en farget svulst inndeling. [Pearson korrelasjon p-verdi = 5.34E-26]. Gjengitt med tillatelse17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Laser microdissection FFPE vev. (A) H & E farget lysbildet. (B) Immunohistochemical flekker ER uttrykk; (C) HER2 immunohistochemical flekker; (D) unstained kvinne 20 µm delen på laser microdissection membran lysbilder. Gule pilen viser et område på invasjonen svulst som ikke er klart avgrenset grunn av flekker. (E) A 20 µm delen farget med H & E for bedre avgrensning av interesseområder. Hvite pilene angir laser disseksjon stien mens den røde pilen viser laser fokus under disseksjon. Alle illustrasjoner ble tatt på 10 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: uttrykk for (A) reseptoren status og (B) mesenchymal markør FN1, i brystet tumor sammenlignet matchet normal. Klassisk diagnostiske bryst kreft subtyper defineres som diagnostiske resultatet med immunohistochemistry og fluorescens i situ hybridisering (fisk) for HER2 tvetydig immunohistochemical flekker. Normalisert uttrykk for (A) HER2 og ER, (B) FN1 målt ved hybridisering-baserte analysen er illustrert i HER2 positiv, ER positiv og TNBC saker sammenlignet med pasienten matchet normal brystvevet. Kruskal Wallis Test statistikken (K-W χ2) viser at uttrykk for HER2 er signifikant (p < 0,05) høyere i tumor vev i motsetning til den samsvarende normalt vev i HER2 positiv kohort og betydelig lavere i TNBC kohort. ER uttrykket ble ikke funnet for å være betydelig høyere i tumor vev i motsetning til matchet normal i ER positiv og TNBC kohorter. FN1 er betydelig høyere i svulst vevet i HER2 og ER positiv subtyper og viser en trend mot blir betydelig opphøyet i tumor vev i TNBC kohort. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Case study: svulst heterogenitet. Morphologically distinkte svulster microdissected og behandlet som forskjellige prøver. (A) master skanning av H & E delen. (B, C) En 10 x og 40 x forstørrelse, for hver svulst morfologi identifisert. (D) Immunohistochemical flekker for ER på 10 x forstørrelse. (E) Immunohistochemical flekker for Ki67 på 10 x forstørrelse viser en høyere mitotisk aktivitet i svulst 1. (F) normalisert uttrykk nivåer for ESR1 genet i hver svulst viser relativt høy og like uttrykk mellom svulster som forventet fra immunohistochemical resultatet. (G) normalisert uttrykk nivåer av FN1, en mesenchymal markør, hvor økt FN1 uttrykk er ledsaget av høy Ki67 flekker viser en signatur for en mer invasiv svulst. Inverse er observert i svulst 2, som synes å være en tregere voksende svulst med lavere ondartet potensial representert ved redusert FN1 uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
En perle-baserte multiplex bDNA analysen var optimalisert for å kvantifisere genuttrykk på degradert RNA FFPE bryst kreft vev og normal bryst kanaler. Optimalisere analysen, normalisere involvert utvikle en algoritme for å klassifisere brystkreft svulster i luminal og basal subtyper 8 kjente biomarkers og 5 potensielle gener. Data normalisering ble gjort ved hjelp av permutasjoner av normalisering gener. Valg av normalisering genene var basert på beste prediksjon av reseptor status ved hjelp av Luminal/Basal klassifiserer gener. For å klassifisere Luminal/Basal subtyper fra FFPE vev, var normalisering genene valgt Beta-utgangen (ACTB), Glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan tilpasses for bruk i andre diagnose og forskningsområder etter tilstrekkelig utvalg av normalisering genet settet. En viktig anvendelse av denne metoden i forskning sektor er måling av biomarkers i arkivmateriale som er godt kommentert med kliniske utfall. Dette kunne validere potensielle prediktiv markører i retrospektiv studier, raskt og nøyaktig, og unngå langsiktige prospektive studier venter sykdom-fri overlevelse og total overlevelse data. Vår gruppe er for tiden undersøker bruk av analysen å oppdage reseptor-positiv exosomes, som krever utvikling av en ny algoritme med alternative normalisere gener for data normalisering. Bruk av flytende biopsier og robust gene expression analyser vil tillate høy gjennomstrømning multiplex analyser tilpasset pasient ledelse under behandling, og gir et middel til å følge behandling effekt, potensielle tilbakefall på grunn av motstand mot terapi, og metastatisk kapasitet av svulsten.
Denne metoden har også et bredt spekter av mulige anvendelser i diagnostisering av svulster og er tilpasset den gjeldende diagnostiske arbeidsflyten. De viktigste fordelene med denne metoden i feltet diagnostiske inkluderer: (1) gjennomføring av høy gjennomstrømning analyser, (2) unntatt subjektivitet og tvetydig resultater fra bilde-baserte målinger, (3) nøyaktig påvisning av flere mål samtidig, som forbedrer nøyaktigheten og minimere bruken av dyrebare pasientprøvene, og (4) ingen krav til høyt spesialiserte fasiliteter og menneskelige ressurser. Optimalisert prøvetaking prosessen, sammen med lav input materiale kreves for perle-baserte multiplex analysen, innrømmer undersøkelse av svulst heterogenitet; ved hjelp av laser microdissection nøyaktig skille flere foci av ondartet vev fra samme pasient delen, er det mulig å sammenligne flere genuttrykk mellom dem og sammenfallende normalt vev (Figur 4). Lav er materiale avgjørende for minnediagnostiseringsprogrammet på svulst biopsier som gir begrenset tumor vev. Kapasiteten til analysen å måle genuttrykk fra degradert RNA prøver kan lett transport av prøver for analyse i institusjon eller vedlikehold laboratorier. I tillegg var hele delen analyse også mulig å bruke H & E farget materiale (figur 1).
Suksessen til denne protokollen, er det viktig å: (1) sikre riktig utvalg av svulst området/s som er lysed for analysen og (2) utvikle godt optimalisert og godkjent data normalisering algoritmer, for hver genet uttrykk panel og/eller personlige Prognostisk eller prediktiv biomarkers. Tidligere avhenger av teknisk erfaring av tekniker/vitenskapsmann utfører prøvetaking. Det anbefales å ta en ekstra core og forberede en vev microarray (TMA) i samme format til multiplex magnetiske perle analysen (96-brønns format). Dette vil gi et arkiv av svulst som kopi av prøver brukes for RNA-baserte analysen. TMAs kan også vurderes med andre teknikker for oppfølging forskning eller validering av resultatene. Utvikling av normalisering algoritmer er avhengig av materialet etterforsket og normalisering genene valgt for normalisering. Ulike paneler med å normalisere gener velges basert på nivå og variasjon av uttrykket i eksemplet analysert og dette varierer mellom kreft vev fra forskjellige steder, exosomes plasma eller sirkulerende kreftceller. Validering av analysen omfatter prøve behandling siden forskjellige preparater vil også resultere i forskjellige normalisering algoritmer.
For å oppsummere, bruk av bDNA teknologi i kombinasjon med magnetiske perle teknologi og valg av riktig panel av målet gener, vil gi den ekstra fordelen av måle genuttrykk direkte i vev lysates avledet fra små mengder pasienten materiale, inkludert microdissected materiale, exosomes og sirkulerende kreftceller. I tillegg til oppdagelsen av svulst heterogenitet har riktig bruk av paneler potensial til å oppdage svulst avledet exosomes for tidlig diagnostikk og tidlig deteksjon av anfall. Siden det er ikke behov for et nukleinsyre forsterkning trinn, signalforsterkning bruker bDNA teknologi, kombinert med perle-baserte multipleks, måler flere byggkorn under klinisk kommenterte arkivmateriale og gi en ressurs for biomarkør validering.
Disclosures
The Invitrogen™ QuantiGene™ Plex analysen er proprietære av Thermo Fisken Naturvitenskapelig.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av (1) et bryst kreft prosjekt stipend (2014-2016) finansiert av handlingen for Breast Cancer Foundation og ALIVE 2013 gjennom forskning, innovasjon og utvikling stoler (RIDT) av University of Malta, (2) fakultet & Kirurgi, University of Malta og (3) prosjektet ACT finansiert av Malta Rådet for vitenskap og teknologi gjennom FUSION: The R & I teknologi utvikling programmet 2016. Utgivelsen av dette manuskriptet støttes gjennom Jove-Luminex stipendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
- Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
