De rol van fysieke krachten in vroege Chick embryonale morfogenese sonderen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de invoering van een reeks nieuwe ex-ovo experimenten en fysieke modellering benaderingen voor het bestuderen van de mechanica van de morfogenese tijdens de vroege embryonale hersenen torsie van het kuiken.
Abstract
Embryonale ontwikkeling wordt traditioneel bestudeerd vanuit het perspectief van biomoleculaire genetica, maar het fundamentele belang van mechanica in genuitdrukking wordt steeds steeds herkend. In het bijzonder de embryonale chick hart en de hersenen buis, die drastische morfologische veranderingen ondergaan als ze ontwikkelen, behoren tot de belangrijkste kandidaten te bestuderen van de rol van fysieke krachten in de voedselproductie. Progressieve ventrale buigen en naar rechts torsie van de hersenen van de tubulaire embryonale chick gebeuren in het vroegste stadium van orgel-niveau links-rechts asymmetrie van de chick embryonale ontwikkeling. Het vitelline membraan (VM) bedwingt de dorsale zijde van het embryo en is betrokken bij het verstrekken van de kracht die nodig is voor het opwekken van de torsie van de ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een combinatie van nieuwe ex-ovo experimenten en fysieke modellering ter identificatie van de mechanica van hersenen torsie. Stadium Hamburger-Hamilton 11 embryo’s zijn geoogst en gekweekte ex ovo (in de media). De VM wordt daarna verwijderd met behulp van een getrokken capillaire buis. Door het niveau van de vloeistof en het embryo te onderwerpen aan een vloeistof-air-interface, kan de vloeistof oppervlaktespanning van de media worden gebruikt ter vervanging van de mechanische rol van de VM. Microchirurgie experimenten werden ook uitgevoerd om te veranderen van de positie van het hart te vinden van de daaruit voortvloeiende verandering in de chiraliteit van hersenen torsie. Resultaten van dit protocol illustreren de fundamentele rol van mechanica in genuitdrukking rijden.
Introduction
Moderne ontwikkelingsbiologie onderzoek spitst zich grotendeels toe op het begrip ontwikkeling vanuit het perspectief van de moleculaire genetica1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. het is bekend dat lichamelijke verschijnselen een centrale rol in de voedselproductie spelen, of de generatie van de biologische14,15,16,17 vormen; specifieke mechanische mechanismen van ontwikkeling blijven echter grotendeels ongedwongen. Ventrale flexure en naar rechts torsie van de primitieve hersenen buis na Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)18 zijn de twee belangrijkste processen die bijdragen aan embryonale vorm wijzigen19,20. Met name blijft de fysieke mechanisme ten grondslag liggen aan de torsional ontwikkeling in de embryonale hersenen onvolledig begrepen.
De embryonale torsie in chick embryo is een van de vroegste morfogenetische gebeurtenissen van links-rechts (L-R) asymmetrie in ontwikkeling. Wanneer het proces van L-R asymmetrie is verstoord, zal geboorteafwijkingen zoals situs inversus, isomerieof heterotaxia 21optreden.
Hier presenteren we een protocol dat ex-ovo experimenten22,23 met fysieke modellering combineert te karakteriseren van mechanische krachten tijdens de vroege embryonale hersenontwikkeling. Het doel van de methode voorgesteld is het identificeren van de mechanische krachten die verantwoordelijk is voor de hersenen torsie en de factoren die invloed hebben op de mate van torsie tijdens de vroege ontwikkeling12. Gebaseerd op de experimentele observatie dat de vitelline membraan (VM) de dorsale zijde van het embryo bedwingt, veronderstelde we dat de VM de kracht die nodig is biedt voor het opwekken van de torsie van de ontwikkelende hersenen. Daarom in deze methode verwijderd wij het deel van de VM dat betrekking heeft op het gebied van de hersenen om erachter te komen de effecten op hersenen torsie. Bovendien, de methode voor het toepassen van vloeibare oppervlaktespanning werd gebruikt om te bevestigen de mechanische rol van de VM en een raming van de kracht die nodig is voor de hersenen torsie, die had niet eerder is gedaan. Het meten van de krachten tijdens de embryonale morfogenese is een uitdagende taak. Met name in een baanbrekende studie ontwikkelde Campàs en collega’s24 een nieuwe methode om te kwantificeren van de cellulaire benadrukt met ingespoten microdruppels. Deze methode was echter beperkt tot het meten van de krachten op het cellulaire niveau, dus niet van toepassing op de sonde krachten op weefsel – of organisme-niveau. Het protocol gepresenteerd in dit document werd ontwikkeld om gedeeltelijk vullen deze kloof.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl fysische verschijnselen een integrale rol in genuitdrukking26,27,28,29,30, specifieke mechanische mechanismen, samen met de coördinatie van de mechanische speelt en moleculaire mechanismen, blijven grotendeels onontgonnen. Het is bekend dat de ventrale flexure en naar rechts torsie van de primitieve hersenen zijn twee centrale processen die tot de vro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C. erkent de steun van Dartmouth opstarten Fonds en de Branco Weiss – Society for Science fellowship, beheerd door de ETH Zürich. De auteurs bedanken Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, Yunfei Shi voor nuttige discussies, alsmede de Anoniem reviewers voor opmerkingen. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant nr. DGE-1313911. Mening, bevindingen, en conclusies of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs (s) en weerspiegelen niet noodzakelijk de standpunten van de National Science Foundation.
Materials
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
