I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio
Summary
Qui, presentiamo un protocollo introducendo una serie di nuovi esperimenti di ex-ovo e approcci di modellazione fisica per studiare la meccanica della morfogenesi durante primi torsione cervello embrionale di pulcino.
Abstract
Lo sviluppo embrionale è tradizionalmente studiato dal punto di vista della genetica biomolecolare, ma l’importanza fondamentale della meccanica nella morfogenesi è sempre più riconosciuta. In particolare, il tubo embrionale del pulcino cuore e cervello, che subiscono drastici cambiamenti morfologici come si sviluppano, sono tra i principali candidati per studiare il ruolo delle forze fisiche nella morfogenesi. Progressiva flessione ventrale e torsione verso destra del cervello embrionale tubolare pulcino accadere alle primissime fasi dell’organo-livello sinistra-destra asimmetria nello sviluppo embrionale del pulcino. La membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell’embrione ed è stata implicata nel fornire la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Qui presentiamo una combinazione di nuovo ex-ovo esperimenti e modelli per identificare i meccanismi di torsione cervello fisici. In fase di Hamburger-Hamilton 11, gli embrioni vengono raccolte e coltivati ex ovo (Media). La macchina virtuale viene successivamente rimosso utilizzando un tubo capillare tirato. Controllando il livello del fluido e sottoporre l’embrione a un’interfaccia liquido-aria, la tensione superficiale liquido dei media può essere utilizzata per sostituire il ruolo meccanico della macchina virtuale. Microchirurgia esperimenti sono stati eseguiti anche per modificare la posizione del cuore per trovare il conseguente cambiamento nella chiralità di torsione cervello. Risultati da questo protocollo illustrano i ruoli fondamentali della meccanica nella morfogenesi di guida.
Introduction
Ricerca moderna biologia inerente allo sviluppo in gran parte si concentra sullo sviluppo di comprensione dal punto di vista di genetica molecolare1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. è noto che fenomeni fisici svolgono un ruolo centrale nella morfogenesi, oppure la generazione di biologico forma14,15,16,17; Tuttavia, specifici meccanismi meccanici di sviluppo rimangono in gran parte. Ventrale flessione e torsione verso destra del tubo primitivo cervello dopo Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)18 sono i due principali processi che contribuiscono alla forma embrionale cambio19,20. In particolare, il meccanismo fisico alla base dello sviluppo torsionale nel cervello embrionale rimane in modo incompleto capito.
La torsione embrionale in embrione di pollo è tra i primi eventi morfogenetici di sinistra-destra (L-R) asimmetria in sviluppo. Quando il processo di asimmetria L-R viene perturbato, difetti di nascita come situs inversus, isomeriao eterotassia verificherà21.
Qui presentiamo un protocollo che unisce ex-ovo esperimenti22,23 con modellazione fisica per caratterizzare le forze meccaniche durante lo sviluppo iniziale del cervello embrionale. L’obiettivo del metodo presentato è quello di identificare le forze meccaniche responsabile torsione cervello e i fattori che influenzano il grado di torsione durante lo sviluppo iniziali12. Basato sull’osservazione sperimentale che la membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell’embrione, abbiamo supposto che la VM fornisce la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Pertanto, in questo metodo, abbiamo rimosso la parte di VM che copre l’area del cervello per scoprire gli effetti sulla torsione cervello. Inoltre, il metodo di applicazione fluido tensione superficiale è stato utilizzato per confermare il ruolo meccanico della macchina virtuale e fornire una stima della forza necessaria per torsione del cervello, che non era stato fatto in precedenza. Misurare le forze durante la morfogenesi embrionale è un compito impegnativo. In particolare, in uno studio pionieristico, Campàs e collaboratori24 ha sviluppato un nuovo metodo per quantificare lo stress cellulare utilizzando microgocce iniettato. Tuttavia, questo metodo è stato limitato alla misurazione di forze a livello cellulare, quindi non applicabile per sondare le forze a livello del tessuto o organismo. Il protocollo presentato in questo documento è stato sviluppato per parzialmente colmare questa lacuna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre fenomeni fisici giocano un ruolo integrante nella morfogenesi26,27,28,29,30, i meccanismi meccanici specifici, insieme con il coordinamento della meccanica e meccanismi molecolari, rimangono in gran parte inesplorate. È noto che il ventrale flessione e torsione verso destra del cervello primitivo sono due processi centrali che contribuiscono al precoce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C. riconosce il sostegno dal fondo di avvio di Dartmouth e Branco Weiss – Society for Science fellowship, amministrata dal Politecnico federale di Zurigo. Gli autori ringraziano la d. ssa Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo e Yunfei Shi per utili discussioni, nonché i revisori anonimi per i commenti. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto Grant No. DGE-1313911. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.
Materials
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
