Sondering av fysiska krafter i tidig Chick embryonala morfogenes roller

Summary

Här presenterar vi ett protokoll att införa en uppsättning nya ex-ovo experiment och fysisk modellering tillvägagångssätt för att studera mekanik morfogenes under tidig chick embryonala hjärnan vridning.

Abstract

Embryonal utveckling studeras traditionellt ur Biomolekylär genetik, men den grundläggande betydelsen av mekanik i morfogenes är blir alltmer erkänt. I synnerhet embryonala chick hjärta och hjärna röret, som genomgår drastiska morfologiska förändringar eftersom de utvecklas, är bland de två främsta kandidaterna till studerar betydelsen av fysiska krafter i morfogenes. Progressiv ventrala böjning och höger vridning av tubulär embryonala chick hjärnan hända det tidigaste skedet av orgel-nivå vänster höger asymmetri i chick embryonal utveckling. Det vitelline membranet (VM) begränsar ryggsidan av embryot och har varit inblandade i att ge kraften som behövs att inducera vridning av hjärnans utveckling. Här presenterar vi en kombination av nya ex-ovo experiment och fysisk modellering för att identifiera mekaniken i hjärnan vridning. På Hamburger-Hamilton etapp 11, embryon skördas och odlade ex ovo (Media). VM är därefter bort med ett drog kapillärrör. Genom att kontrollera nivån av vätska och att utsätta embryot till en vätska-air interface, kan media flytande ytspänning användas för att ersätta den mekaniska rollen i VM. Mikrokirurgi experimenten utfördes också för att ändra positionen för hjärtat att hitta den resulterande förändringen i kiralitet av hjärnan vridning. Resultaten från detta protokoll illustrerar de grundläggande rollerna av mekanik i körning morfogenes.

Introduction

Modern utvecklingsbiologi forskning fokuserar till stor del på förståelse utveckling från perspektiv av molekylär genetik^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. det är känt att fysikaliska fenomen har en central roll i morfogenes eller generering av biologiska bilda^14,15,16,17; specifika mekaniska mekanismer för utveckling kvarstår dock till stor del outforskat. Ventrala fotled och höger vridning av primitiva hjärnan röret efter hamburgare-Hamilton etapp 11 (HH 11)¹⁸ är de två huvudsakliga processer som bidrar till embryonal form ändra^19,20. I synnerhet fortfarande den fysisk mekanism som underliggande torsional utvecklingen i embryonala hjärnan ofullständigt förstådda.

Den embryonala vridning i chick embryo är bland de tidigaste morphogenetic händelserna av vänster-höger (L-R) asymmetri i utveckling. När processen för L-R asymmetri är oroade, sker fosterskador som situs inversus, isomerieller heterotaxia ²¹.
Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar ex-ovo experiment^22,23 med fysisk modellering för att karakterisera mekaniska krafter under tidiga embryonala hjärnans utveckling. Målet med metoden presenteras är att identifiera de mekaniska styrkorna som är ansvarig för hjärnan vridning och de faktorer som påverkar graden av vridning under tidig utveckling¹². Baserat på experimentella observationen att det vitelline membranet (VM) begränsar ryggsidan av embryot, hypotesen vi att VM ger kraften som behövs att inducera vridning av hjärnans utveckling. Därför i denna metod bort vi del av den virtuella datorn som täcker området hjärnan att ta reda på effekterna på hjärnan vridning. Dessutom användes metoden att använda flytande ytspänning att bekräfta VM mekaniska roll och ge en uppskattning av den kraft som behövs för hjärnan torsion, som inte hade gjort tidigare. Mäta krafter under embryonala morfogenes är en utmanande uppgift. Noterbart i en banbrytande studie utvecklat Campàs och medarbetare²⁴ en ny metod för att kvantifiera de cellulära påfrestningar med injicerade microdroplets. Denna metod var dock begränsad till mäta krafter på cellnivå, därav ej tillämpligt sond styrkor på vävnad – eller organism-nivå. Det protokoll som presenteras i denna uppsats har utvecklats för att delvis fylla denna lucka.

Protocol

1. beredning av vävnadsodling Media Använd en 0.5 L flaska av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) med 4,5 g/L glukos, natriumvätekarbonat och L-glutamin som bas för kultur media. I en steril LAF, tillsätt 10 mL av antibiotika till 0,5 L av DMEM. Med steril pipett över 50 mL av DMEM antibiotika lösningen i en steril 50 mL koniska rör. Tillsätt 50 mL chick serum till återstående DMEM antibiotika lösningen i flaskan 0,5 L i sterila huven. Lagra den slutli…

Representative Results

I denna studie VM av embryot på HH11 har tagits bort från den främre änden av bröstkorg fotled. Embryona var fotograferad av ett OCT-system. I detta skede, har vridning av hjärnan rör inte startat (figur 1A). Efter att inkuberas till HH15-16, uppvisade embryon med deras VM bort minskad hjärnan tube torsion, cirka 35 grader (figur 1B) jämfört med styra embryon, som uppvisar vridning av runt 90 grader. När media nivån s…

Discussion

Medan fysikaliska fenomen spelar en viktig roll i morfogenes^{26,27,28,29,30}, om särskilda mekaniska mekanismer, tillsammans med samordning av mekaniska och molekylära mekanismer, förblir i stort sett outforskat. Det är känt att ventrala fotled och höger vridning av den primitiva hjärnan är två centrala processer som bidrar till tidig embryonal morfogen…

Materials

Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs	Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope	Thorlabs	GAN220C1
Silicone elastomer	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
Dissecting microscope	Leica	MZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Antibiotics	Sigma	P4083
Chick serum	Sigma	C5405
Micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-30
Filter paper	Whatman	5202-110
Phosphate buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Comsol MultiPhysics	Comsol
3D computer graphics software	Rhino 5
Microscope attached with OCT	Nikon	FN1
Digital single-lens reflex camera	EOS	Rebel T3i