בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול היכרות עם ערכת ניסויים לשעבר-ovo חדשים וגישות מודלים פיזיים ללמוד את המכניקה של מורפוגנזה במהלך המוקדמות פיתול המוח העוברי צ’יק.
Abstract
התפתחות באופן מסורתי נלמדת מנקודת המבט של גנטיקה למערכות ביולוגיות, אך החשיבות הבסיסית של מכניקה ב מורפוגנזה מזוהה הופכת יותר ויותר. בפרט, הבחורה עובריים הלב והמוח התחתית, אשר עוברים שינויים מורפולוגיים דרסטי כפי שהם מפתחים, הן בקרב המועמדים הממשלה ללמוד את התפקיד של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה. כיפוף הגחון מתקדמת, פיתול rightward של המוח צ’יק עובריים צינורי יקרה בשלב המוקדם של איברים ברמת משמאל המשווע התפתחות האפרוח. קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, היה מעורב במתן את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. כאן אנו מציגים שילוב של ניסויים לשעבר-ovo חדשים ובאופן פיזי מידול כדי לזהות את המכניקה של פיתול המוח. המבורגר-המילטון שלב 11, העוברים הם קצרו ותרבותית ex ovo (בתקשורת). ה-VM יוסר לאחר מכן באמצעות צינור קפילרי משך. על ידי השליטה הרמה של הנוזל ובאיומים העובר לממשק נוזל-אייר, מתח הפנים נוזלים של התקשורת יכול לשמש כדי להחליף את תפקיד מכני של VM. תיאום הניסויים בוצעו גם לשנות את המיקום של הלב למצוא תוצאות השינוי כיראליות של פיתול המוח. תוצאות של פרוטוקול זה להמחיש את תפקידי היסוד של המכניקה נהיגה מורפוגנזה.
Introduction
ביולוגיה התפתחותית מודרנית המחקר מתמקד בעיקר פיתוח ההבנה מנקודת המבט של גנטיקה מולקולרית1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ידוע כי התופעה הפיזית לשחק תפקיד מרכזי מורפוגנזה, או הדור של ביולוגית טופס14,15,16,17; עם זאת, מנגנונים מכניים ספציפי של פיתוח נשארים מחקר כלשהו. Flexure הגחוני פיתול rightward של הצינור המוח הפרימיטיבי לאחר המבורגר-המילטון שלב 11 (HH 11)18 הם שני תהליכים עיקריים שתורמים צורה עוברית לשנות19,20. בפרט, המנגנון הפיזי שבבסיס פיתוח הכיווניות של המוח העוברי נשאר שהיישום מובן.
פיתול מתחלקים ב צ’יק העובר הוא בין האירועים morphogenetic המוקדם של אסימטריה (Lr) משמאל בפיתוח. כאשר התהליך של אסימטריה L-R הוא מוטרד, מומים מולדים כגון סיטוס אינברסוס, isomerismאו heterotaxia תתרחש21.
כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לשעבר-ovo ניסויים22,23 עם מידול הפיזי כדי לאפיין כוחות מכני במהלך התפתחות המוח העוברי מוקדמת. מטרת השיטה המובאת היא לזהות את הכוחות מכני אחראי פיתול המוח ואת הגורמים המשפיעים על מידת פיתול במהלך התפתחות מוקדמת12. על סמך התצפית ניסיוני קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, שיערנו כי ה-VM מספק את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. לכן, בשיטה זו, אנו להסיר את החלק של ה-VM שמכסה את האזור במוח כדי לגלות את ההשפעות על פיתול המוח. יתר על כן, השיטה של החלת נוזלים מתח נעשה שימוש כדי לאשר את תפקיד מכני של VM ולספק הערכה של הכוח הדרוש עבור פיתול המוח, אשר לא נעשה בעבר. מדידת הכוחות במהלך מורפוגנזה עובריים הוא משימה מאתגרת. ראוי לציין, במחקר חלוצי, Campàs ועמיתים24 פיתח שיטה לכמת את הלחצים הסלולר באמצעות microdroplets מוזרק. עם זאת, שיטה זו הייתה מוגבלת למדידת כוחות ברמה התאית, ולכן לא ניתן ליישום כדי לחקור את הכוחות על רקמות או אורגניזם-ברמת. פרוטוקול הציג נייר זה פותחה כדי חלקית למלא את החלל הזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד פיסיקליות לשחק תפקיד אינטגרלי מורפוגנזה26,27,28,29,30, למנגנונים מכאניים הספציפיים, יחד עם קואורדינציה של מכונות, המנגנונים המולקולריים, להישאר נחקרו במידה רבה. זה ידוע כי flexure הגחוני של פיתול rightward ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z.C. מאשר התמיכה של קרן הפעלה דארטמאות והחברה ברנקו וייס – לאחווה המדע, מנוהל על ידי ETH ציריך. המחברים תודה ד”ר לארי א טאבר, Benjamen א Filas, גואו Qiaohang, ו Yunfei שי לדיונים מועיל, כמו גם הבודקים אנונימי להערות. חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת על-ידי הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה תחת גרנט מס DGE-1313911. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
