Summary
Adipojenik farklılaşma değerlendirirken geleneksel yöntemleri ucuz ve kullanımı kolay, ama gen ekspresyonu değişiklikler için belirli değildir. Mezenkimal hücre farklılaşması içine olgun adiposit bir soy belirli işaretçisi kullanarak ölçmek için bir tahlil geliştirdik. Bu tahlil temel araştırma ve klinik tıp arasında çeşitli uygulamalar vardır.
Abstract
Çeşitli boyalari şu anda Mezenkimal hücreler farklılaşma adiposit içine algılama içinde kullanılabilir. Ucuz, kolay ve yaygın olarak kullanılan boya, yağ kırmızı O gibi Mezenkimal hücreler Adipojenik potansiyelini analiz Laboratuvarları tarafından. Ancak, onlar özel değişiklikleri gen transkripsiyonu için değildir. Mezenkimal bir hücre bir Adipojenik soy gelenlerin kaderi değiştirdi çözümlemek için gene özgü farklılaşma tahlil geliştirdik. IMMUNO-etiketi karşı yağ asidi bağlayıcı protein-4 (FABP4), bir soy özgü marker Adipojenik farklılaşma, görselleştirme ve miktar farklılaşmış hücre etkin. Adipojenik farklılaşma potansiyeli 96 iyi Mikroplaka kartvizitlere Mezenkimal hücrelerin ölçmek yeteneği uygulamaları bir dizi için umut verici sonuçları vardır. Klinik çalışmalar yüzlerce yetişkin Mezenkimal stromal hücre kullanımı dahil ve şu anda içinde ve özellikle arasında böyle klinik tedavi sonuçları ilişkilendirmek zordur. Bu basit yüksek üretilen iş FABP4 tahlil hasta elde edilen hücre farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için bir nicel tahlil sağlar ve farklı yalıtım ve genişletme yöntemleri karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Bu hastalara Mezenkimal hücre ürünlerinde yönetilen hücreleri heterojen artan tanınması verilen özellikle önemlidir. Tahlil de yüksek işlem hacmi uyuşturucu tarama, özellikle ön şeker hastalığı ve obezite araştırma potansiyel yarar vardır.
Introduction
Uluslararası toplum için hücresel tedavi (multipotent Mezenkimal stromal hücre tanımlamak için ISCT) tarafından kurulan anahtar gereksinimleri hücreleri Adipojenik ve Osteojenik chondrogenic soy ayırmak için yetenek olmalıdır biridir 1. farklılaşma üç bu soy içine ölçme geleneksel yöntemlerle makromoleküllerin ürünleri kimyasal boyalar1kullanarak algılamayı güveniyor. Boya yağ kırmızı O, (Bu adipogenesis uğramıştır hücrelerdeki yağ damlacıkları lekeleri) gibi ucuz ve kullanımı kolay; Ancak onlar Mezenkimal hücrelerin her ilgili lineage2ayırt adlandırırken gen ifadesinde belirli değişiklikleri algılamak başarısız. Burada, bir Adipojenik lineage özgü marker, yağ asidi bağlayıcı protein-4 (FABP4)3,4,5için protein ifade quantifies bir farklılaşma tahlil geliştirdik. FABP4 başlangıçta fare 3T3-L1 adiposit3 ' te bulundu ve daha sonra insan deri altı yağ dokusu6' ifade edilecek keşfedilmiştir. Bu yağ asidi alımını hücreleri tarafından rehberlik için bir refakatçi olarak geçecek olan ve, lipoliz4sürecinde ilgilenmektedir sitozolik bir proteindir.
Farklılaşma deneyleri için kullanılan habercisi hücre adipose türetilmiş Mezenkimal stromal hücreler (ASCs)7,8vardı. ASCs kemik iliği elde edilen Mezenkimal Kök hücre (BM-MSCs), bir büyük Mezenkimal Kök hücre nüfus yetişkin8,9ile birçok özellikleri paylaşır. Derecede hücrelerinin daha fazla verim-ebilmek var olmak daha kolay erişilebilir hale doku kaynakları8,9izole ASCs bir klinik uygulamada, BM-MSCs üzerinde birkaç avantaj sunar. Bir izole hücre nüfus ASCs tanımlanacak bazı ölçütlere uyması gerekir. İlk olarak, standart kültür koşulları1' plastik doku kültürü damarları bağlılığı göstermek gerekir. Onlar da belirli yüzey antijeni ifade1göstermek gerekir. Kültürsüz ASCs, CD34, CD73, CD90, düşük CD105 ifadesidir ve CD45 ve HLA-DR10negatif ifade pozitif yüzey antijeni ifade tarafından karakterize edilmektedir. Plastiğin üzerinde 28 (yapışık ASCs saf) gün boyunca kültür tarafından saf ASCs CD73, CD90 ve CD105 olumlu ifade ve CD34, CD45 ve HLA-DR10negatif ifade gösterir. Son olarak, hücrelerin çeşitli soy1,7,8içine ayırt etmek için yetenek korumanız gerekir.
Biz İmmünokimya FABP4 protein hücreleri içinde görselleştirmek için kullanılan ve tek hücre düzeyinde FABP4 ifade sayısal Adipojenik farklılaşma protokolleri FABP4 ifade diğer adipocyte lineage genler arasında çarpıcı upregulation ikna etmek bir otomatik floresan yüksek içerik tarama mikroskop kullanarak. Adipocyte-lineage farklılaşma çok özel onay sağlar gibi bu yöntem geleneksel boyalar üzerinde avantajlıdır. Ayrıca yöntemleri tarama yüksek içerik ile kombine böyle gen belirli lineage deneyleri miktar orantılı bir türdeş olmayan hücre hazırlık içindeki belirli bir soy aşağı farklılaşma yeteneğine hücreleri etkinleştirin. Bizim çalışmalarda Adipojenik farklılaşma potansiyeli taze izole ASCs kaybı hücre kültürü sonra onaylamak için FABP4 tahlil kullanılır.
Protocol
1. farklılaşma deneyleri için ASCs hazırlanması
- Doku kültürü reaktifler hazırlamak ve steril doku kültürü başlıklı canlı hücreleri ele.
- A0 orta hazırlamak: Dulbecco modifiye kartal orta ve Ham'ın F12 orta (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x penisilin/streptomisin.
- Tam ASC orta hazırlamak: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penisilin/streptomisin, % 10 fetal sığır serum.
- ASCs, bir T75 kültür şişeye Genişletilmiş Kullanım yapışık saf. Floresans aktif hücre (FACS)10sıralama kullanarak ASCs saflığı onaylayın.
- Hücreleri tüm Orta T75 kültür balonun kaldırarak ve hücre ayrılma enzim 2 mL ekleyerek bağlantısını kesin.
- Kuluçka Gelişim makinesi (nemlendirilmelidir 37 ° C, % 5 CO2) kültür şişeye 5-10dk için bırakın. Kuluçka makinesi dışında kültür şişeyi al ve sıkıca şişesi yan dokunun. Hücreleri ters bir mikroskop kullanarak kültür balonun ayırdıktan kontrol edin.
- A0 Orta 13 mL T75 kültür şişesi ekleyin.
- 15 mL 15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 400 x g, santrifüj içine aktarın.
- Süpernatant atın ve hücre Pelet 1 mL tam ASC orta yeniden askıya alma.
- Hemasitometre kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin.
- Tam ASC Orta 25.000 hücreleri mL-1 konsantrasyon için hücre süspansiyon sulandırmak.
- A0 orta 200 µL 96 iyi plaka (düz dipli) tüm çevre kuyu ekleyin. Bu merkezi hücreleri içeren Wells buharlaşma oranı azaltır.
- Hücre süspansiyon, 200 µL iyi başına 5 x 103 hücre son hücre yoğunluğu elde etmek için bir microwell plaka aktarın. Dört kuyu her tedavi grubu (onaylatılacak teknik tekrarlar ve immunocytochemistry (ICC) için bir birincil antikor kontrol) için ihtiyaç vardır.
- Microwell plaka kuluçka (37 ° nemlendirilmelidir, C, % 5 CO2) hücre kadar ulaşmak izdiham (3-4 gün) bırakın.
2. ASCs farklılaşma inducing
- Adipojenik farklılaşma orta tam ASC orta 1 µM dexamethasome, 10 µM insülin ve 200 µM İndometazin ilave tarafından hazırlayın. Tam farklılaşma orta 4 ° C için 1 ay, 1 tahlil için gerekli böylece sadece yapmak stabil. Mağaza 4 ° C'de ve gerektiğinde bir aliquot su banyosu içinde 37 ° c ısı.
- 3-4 gün sonra microwell plaka kuluçka makinesi dışarı almak ve kültür orta yarısı Adipojenik farklılaşma orta ile değiştirin.
- Orta değiştirmek 2-3 günde gerçekleştirin.
Not: Optimum Adipojenik farklılaşma farklılaşma orta kültürünün 14 gün gerektirir. Farklılaştırılmış hücrelerin dayalı geleneksel boya lekeleri ve gene özgü lekeler kullanarak analiz edilir.
3. boyama farklılaşma için - geleneksel boya lekeleri dayalı.
- %4 formaldehit çözüm tarafından hazırlamak PBS ile % 16 formaldehit sulandrarak. Sadece deneme için gerekli miktarı ve sıkı bir santrifüj tüpü kapalı mağaza oranında seyreltin.
Dikkat: Formaldehit olası kanserojen olduğu ve burun, boğaz ve akciğerler inhalasyon üzerine tahrişe neden olabilir. Bir duman başlıklı formaldehit ile ilgili tüm yordamları gerçekleştirin. - Yağ kırmızı O hisse senedi çözüm 300 mg 100 ml isopropanol çözülerek hazırlayın.
- Microwell plaka kuluçka makinesi dışarı al. Aşağıdaki adımları non-steril bir ortamda gerçekleştirilir.
- Tüm Orta kuyulardan kaldırmak ve 30 dk için % 4 formaldehit ile hücreleri tamir.
- Kuluçka süresi sırasında yağ kırmızı O çalışma çözüm hazırlamak. Çalışma çözüm 4 parçaya distile su (dH2O) ile 6 parça petrol kırmızı O stok oluşmaktadır. Mix iyi ve 0.2 µm filtre birimini kullanarak filtre uygulamadan önce oda sıcaklığında 20 dakika için oturup bekleyin. Çözüm çalışma sadece 2s için stabil.
- Tüm formaldehit kuyulardan pipetting tarafından kaldırın.
- Hücreleri bir kez % 60 isopropanol ve kuyu tamamen devam etmeden önce kuru izin yıkayın.
- Her şey için 50 µL petrol kırmızı O çalışma çözüm ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Yağ kırmızı O çözüm kaldırın ve hemen dH2O. yıkama ile görüntüleme ışık mikroskop altında daha önce dH2O 4 kez ekleyin.
4. farklılaşma için - gen özel antikor boyama
- Tris tamponlu tuz (TBS) hisse senedi çözüm NaCl, KCl 2 g ve 30 g Tris tabanına dH2O 1 litre (pH 8) 80 g çözülerek hazırlayın. Çalışma çözüm 1:10 dH2O. mağaza oda sıcaklığında kullanarak sulandrarak hazırlayın.
- İmmunobuffer (IB) hazırlamak (% 1 fetal sığır serum (FBS) TBS içinde). 15 mL santrifüj tüpü tarihi ile etiket ve 4 ° C'de depolayın IB yapılan tarihinden itibaren 1 hafta boyunca kullanılabilir.
- % 0.25 kazein engelleyici 0.5 g kazein ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 200 ml sodyum azid 0.195 g çözülerek hazırlayın. Tamamen malzemeyi gecede karıştırarak tarafından çözülür. Aliquot 15 mL santrifüj tüpleri ve mağaza-20 ° C-dondurucu içine. Çözdürülen kazein çözümler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
- DAPI çözüm hisse senedi DAPI 1: 200 TBS. deposundaki ışıktan korunan 4 ° C'de sulandrarak hazırlayın.
- Hisse senedi thimerosal çözüm (10 mg mL-1) steril PBS thimerosal çözülerek hazırlayın. 4 ° C'de depolayın ve uygun miktarda kullanmak için 0.4 mg mL-1 oranında seyreltin.
- Düzeltmek ve buz gibi metanol (96 iyi plaka) 200 µL TBS. hemen ile 5 dk. yıkama hücreler için hücrelerle permeabilize
- 50 µL % 0.25 kazein, oda sıcaklığında 10 dakika ile engellemek ve TBS ile bir kez yıkamak
- IB içinde seyreltilmiş birincil antikorların 50 µL ekleyin ( Tablo 1 antikor Ayrıntılar için bakınız) ve 1 h için kapalı kapakları ile kuluçkaya.
- Bir kez 200 µL TBS ve hafif sallanan ile 5 dk sonra 3 kez TBS ile yıkayın.
- IB içinde seyreltilmiş ikincil antikorların 50 µL ekleyin ( Tablo 2 antikor Ayrıntılar için bakınız) 1 h. kapak plaka folyo ile fotoğraf ağartma önlemek için kapalı kapakları ile her 1:2000 DAPI ile kuluçkaya.
- TBS, hemen ile yıkama ve TBS ile iki kez sonra hafif sallanan ile 15 dakika.
- Tüm TBS kaldırın ve 200 µL thimerosal çözüm ekleyin.
- Plaka kadar görüntüleme ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
5. görüntüleme yüksek-den geçerek mikroskop kullanarak hücreleri
- Gene özel antikorlar ve fluorophore ile yazılıma eşlik eden ile kontrollü bir yüksek içerik tarama mikroskop kullanarak konjuge ikincil antikorlar (ayirt) lekeli hücreleri analiz.
- Microwell plaka mikroskop sahne içine yükleyin. Plaka satın alma denetimi, resim orta menzilli büyütmede (10 X objektif lens) seçin. Görüntüleri her şey, o bir hücre iki bitişik alanlara görünmüyor emin olmak için her siteye arasında 50 µm Aralık ortasından alınır emin olun.
- Wells görüntü seçin.
- Uygun kanal kombinasyonları, çekim hızı ve z-ofset parametreleri seçin. Tablo 3 ' e her filtreler (ek tablo 2) daha fazla bilgi için bakın.
- Tahlil (veritabanı sunucusu için görüntüleri otomatik olarak saklanır) alma sihirbazını kullanarak elde.
- Yağ kırmızı O. (ek tablo 3) ile lekeli tabaklar elde etmek için alternatif kanal kombinasyonunu kullanın.
6. analiz elde görüntüsü
Not: Uzaktan erişim veritabanı sunucusu sağlar hızlı ve kolay değerlendirilmesi alınan görüntüleri ve görüntü analiz yazılımı kullanımı.
- Açık hücre puanlama modülü analiz yazılımı.
- Hücre çekirdeği DAPI kanal (nükleer marker) ve faiz kesimi çekirdekleri boyutu için kullanıcı tanımlı parametreleriyle kullanma algılamak ve yoğunluğu arka plan üzerinde sinyal.
- FABP4 sinyal FITC kanal kullanarak bulmak. Tüm FABP4 olumlu bölgeler her resim seçmek için arka plan üzerinde boyut ve sinyal yoğunluğu için kullanıcı tanımlı parametreleri ile farklılaşmış hücreler kesiminde.
- Transfluor modülü plakaları yağı kırmızı O. ile lekeli çözümlemek üzere analiz yazılımı açın
- Yağ kırmızı lekeli bölgeleri 'çukurları' olarak O yoğunluğunu ve boyutu belirtin.
Representative Results
Bu çalışmada, ASCs Adipojenik farklılaşma potansiyeli 3 farklı yöntem ile ölçülür. FABP4, bu işaret sitoplazma lokalize gösterdi immünfloresan etiketleme hücreleri ayrıştırılan ve etiketleme DAPI etiketli çekirdeği ile (şekil 1A) üst üste. Otomatik görüntü analizi FABP4 pozitif hücrelerinin erken geçiş hücreleri 6.9 kat artış geç geçiş hücrelerdeki (şekil 1B) göre farklılaştırılmış grubunda Yüzde 24.6 kat artış saptandı. Kırmızı O petrol boyama yağ damlacıkları farklılaşmış hücreler sitozol dağınık için yerelleştirilmiş ve etiketleme nadiren DAPI etiketli çekirdeği ile üst üste; Ancak görsel denetim erken geçiş hücreleri (şekil 2A) göre geç geçiş hücrelerdeki yağ kırmızı O yağ damlacıkları ile ilgili daha az sayıda hücre çekirdeği vardır. Otomatik görüntü analizi erken geçiş hücreleri hücre ve hücre geç geçiş hücrelerdeki (şekil 2B) başına alan boyama bir 53,9 kat artış başına petrol kırmızı O boyama alanında bir 11.1 kat artış saptandı. Her iki lekeler görüntüleme gerçekleştirilmiş ve hücre puanlama (FABP4) veya Transfluor (yağ kırmızı O) modülü yazılım (ek şekil 1, ek tablo 2-5) kullanarak sayılabilir. FABP4 ifade upregulation Western blot analizi (şekil 3, ek Şekil 5) tarafından doğrulandı. Tüm 3 analiz yöntemleri erken geçiş ASCs geç geçiş hücreleri daha yüksek Adipojenik farklılaşma potansiyeli olduğunu açıkladın. Adipojenik farklılaşma iyi (ek Şekil 2, 3) başına toplam hücresini sayı etkilemedi. Ancak, FABP4 pozitif farklılaştırılmış hücrelerin çekirdeği boyutunu önemli ölçüde kontrol hücreleri geç geçiş ASCs sadece için daha küçük (tamamlayıcı şekil 3).
Hücre kültüründe genişletilmiş veya passaged, hücrelerinin Adipojenik farklılaşma azalmış, daha önce yayımlanmış veri11ile tutarlı yeteneğine kültür içinde yüzde olarak biz bunu gösterdi. Yaş, vücut kitle indeksi veya önceki tıbbi geçmiş12 gibi faktörler değil olabilir için bu çalışmada kontrollü ve büyük olasılıkla farklı donör örnekleri (ek tablo 1) arasında gözlenen değişkenliğin katkıda olduğunu unutmamak gerekir.
Resim 1 : FABP4 immunolabelling gösterir erken geçiş hücreleri daha ayrıştırması potansiyel daha sonraki geçiş hücreleri yok. A) erken ve geç geçiş, kontrol ve farklılaştırılmış hücrelerin DAPI (nükleer leke) ve FABP4 ile etiketli temsilcisi görüntüleri birleştirme ve segmentasyon görüntüleri ile birlikte gösterilir. Resimleri görüntüleme ayrılmasını yeşil kaplaması ile hücreleri ve kırmızı bir kaplaması ile farklılaşmamış hücreleri ayrıştırılan. B) erken ve geç geçiş hücrelerdeki Adipojenik farklılaşma ile hücreleri ifade FABP4 önemli bir artış gözlendi, ancak, erken geçiş hücreleri daha geç geçiş hücreleri (Mann Whitney ayrımında önemli ölçüde daha fazla artış gösterdi test * P gösterir < 0,05 ve *** P gösterir < 0.001). Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Yağ kırmızı O boyama gösterir erken geçiş hücreleri daha ayrıştırması potansiyel daha sonra geçiş hücreleri daha var. A) temsilcisi görüntüleri DAPI (nükleer leke) ve yağ kırmızı O (gri, lipid damlacık leke) birleştirme ve segmentasyon görüntüleri ile birlikte gösterilir. Yeşil kaplaması ile tüm çekirdeklerin segmentasyon görüntüleri tasvir ve lipid damlacıkları bir kırmızı kaplaması ile petrol kırmızı O lekeli. B) yağ kırmızı O boyama alanında önemli bir artış ile Adipojenik farklılaşma gözlendi. Erken geçiş hücreleri yağ kırmızı O leke geç geçiş hücrelere kıyasla hücre başına büyük bölümünü gösterdi. Yağ kırmızı O hücre başına (μm kalınlığında2) Boyama alanında kullanılan bir ölçü Adipojenik farklılaşma potansiyel olarak. Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM (Mann Whitney testi * P gösterir = < 0,05 ve *** P gösterir = < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Western blot analizi FABP4 protein ifade düzey farklılaştırılmış erken ve geç geçiş ASCs. Toplam protein yükleme denetim, beta aktin (ACTB), FABP4 immunolabelling erken pasajda ve ayrıştırılan daha az derece geç geçiş için önemli ölçüde artış olmuştur gösterdi bir oranı olarak FABP4 gruplarından yoğunluğu optik yarı kantitatif analiz hücreleri. Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM (Mann Whitney testi * P gösterir = < 0,05 ve *** P gösterir = < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hedef antijen | İzotip (Klon) | Türler | Seyreltme |
| FABP4 | Poliklonal | Tavşan | 1: 100 |
Tablo 1: Birincil antikor
| Antikor hedefleme | Fluorophore etiketi | Türler | Seyreltme |
| Tavşan IgG | Alexa fluoro 488 | Keçi | 1: 200 |
Tablo 2: İkincil antikor
Ek şekil 1: görüntü analiz sanal ortama genel bakış. Lekeli hücreleri herhangi bir kaynak önyargı önlemek için bir, yüksek-den geçerek otomatik floresan mikroskop kullanarak görüntüsü. Görüntüleri ImageXpress mikro XLS kullanılarak kazanılması, doğrudan MDCStore veri yöneticisi veritabanına kaydedilen ve görüntüleme aracılığıyla kullanıcılar optimize etmek ve onların belirli analiz parametrelerini sınamak için kullanın sanal masaüstü bağlantıları için kullanılabilir. Görüntüleri 'işler' autorun sırasına göndermek birden çok farklı kullanıcıların sağlayan bir özel 'autorun' örneği ile analiz edildi. 'Onların 'işler tamamlandığında kullanıcılar sanal örnek ile onların veri alabilirsiniz. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2: Toplam karşılaştırılması hücre sayısı kontrol kuyu başı ve kuyular için erken ve geç geçit ASCs, plaka lekeli FABP4 kullanarak farklı. Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM Denetim ve erken ve geç geçiş ASCs için farklılaşmış hücreler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı. Geç geçiş hücrelere göre erken geçiş hücreleri için iyi başına daha fazla hücre vardı. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek şekil 3: Toplam karşılaştırılması hücre sayısı kontrol kuyu başı ve kuyular için erken ve geç geçit ASCs, yağ kırmızı plaka lekeli O kullanarak farklı. Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM Denetim ve erken ve geç geçiş ASCs için farklılaşmış hücreler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek şekil 4: daha sonra pasajlar FABP4 olumlu olduğunu farklılaşmış hücreler hücreleri daha önemli ölçüde daha küçük çekirdek alanı denetim wells vardı. Erken pasajda denetim ve farklılaşmış hücreler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark çekirdek alanında yapıldı. Gösterilen veriler arasında erken geçiş ortalamasıdır (p4; n = 8) veya geç geçiş (p10; n = 4) donör örnekleri, ± SEM (Unpaired t test *** P gösterir = < 0.001). Ortalama ± SEM gösterilir.) Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 5: görüntüleri Western blot jelleri. Kırmızı kanalı beta-aktin gösteriyor. Yeşil kanal gösteriyor FABP4 immunolabelling. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 1: klinikopatolojik bilgi bağış Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 2: ayarları (FABP4) görüntüleme Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 3: ayarları (yağ kırmızı O) görüntüleme Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 4: tablo kullanılan analiz parametreler (FABP4). Hücre puanlama modülü. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 5: tablo kullanılan analiz parametreler (yağ kırmızı O). Trans Fluor modülü. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu kağıt yardımcı programı ve doğru algılamak ve olgun adiposit Mezenkimal stromal hücrelerden türetilmiş ölçmek FABP4 immunolabelling avantajlarını gösteriyor. FABP4 hangi etiket makromoleküllerin13,14 olur boyalar değişiklikleri bir soy belirli protein3,4,5 diğer yaygın aksine olgun adiposit'ifadesinde kullanılan tespit edebilmektedir petrol kırmızı O15, Nil kırmızı16 ve Sudan siyah17gibi. Görselleştirme ve değişiklikleri hücresel Morfoloji analizi için FABP4 immunolabelling sağlar. Önceden açıklanan yöntemleri kullanarak nicel ters transkripsiyon değişiklikler olmadan herhangi bir görüntüleme5,18,19 transkript düzeyde analiz eden PCR (RT-qPCR) üzerinde belirgin bir avantaj bu ,20veya süspansiyon20veya Western Blot bu olması için hücrelerin gerekli Akış Sitometresi hücrelerin protein19,20yalıtmak için lysed gerekir. FABP4 immunolabelling sabit hücrelerde stabil, çözümde kaçak değil ve ne zaman içinde hücre, yapisan bir monolayer etiketli sitozolik protein olmak kolay görüntüleme için izin ve doğruluk otomatik analizde ekledi çekirdek ile çakışır.
Çünkü hızlıdır, doğrudur, tekrarlanabilir ve objektif yüksek içerik tarama avantajlıdır. Resim alma ve analiz en az el ile manipülasyonu gerektirir ve araç otomatik işlenmesini itimat reaktifler ve araştırmacı zaman, maliyet etkin kullanımı için bir platform sağlar. Çeşitli faktörler doğruluğu için kritik olarak tespit edilmiştir ve tekrarlanabilirlik yüksek içerik tarama31deneyleri. Antijen ifade miktar görüntü kalitesi üzerinde dayanır. Başarılı görüntü analizi için her kanal başına iyi görüntülerden odakta olmalı ve bir en uygun dinamik gri değerler için aralıkta (ayarları otomatik maruz ideal). Dışarı-in odak veya hatalı sonuçlar doymuş görüntüleri yol açabilir.
Bu makalede açıklanan yöntemlerden potansiyel bazı sınırlamalar şunlardır. Özel görüntüleme ekipman ve analiz yazılımı gereksinimini. Bu makalenin kapsamı ise dışında alternatif açık kaynak yazılım seçenekleri (örneğin, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) benzer görüntü segmentasyonu gerçekleştirmek için kullanılabilir görevleri; ancak indirmek ve online kullanılabilir makrolar terzi veya makrolar/komutları onların belirli analiz boru hatları için beceri gerektirir. Arka plan gürültü seviyesi tüm otomatik görüntü analiz boru hatları için doğasında vardır. Bu büyük ölçüde enkaz için bağlanabilir dikkatli numune hazırlama ve görüntüleme ve çözümleme platformu dikkatli kurulum ihtiyacını vurgulayan kötü görüntü kalite veya çözümleme hatası. FABP4 etiket farelerde farklılaşmamış ataları30algılamak tespit edilmiştir; (Bu farklılaşmamış hücreleri oluşur) Bu çalışmada denetimlerde belirli FABP4 boyama yoksun olsa da. FABP4 ifade iade gerekliliği ataları nerede tahlil istihdam her biyolojik bağlamda farklılaşmamış bu eksik puanları.
FABP4 etiketleme ve yağ kırmızı boyama, O biyolojik ilgili olması gereken görüntü analizi üzerinden çıkış ölçümleri arasında geçerli karşılaştırmalar çizmek için. Sonuç olarak, ölçüm, "% pozitif hücreler" FABP4 için kullanılan ve "Hücre başına boyama alanı" petrol kırmızı O. için kullanıldı Bu ölçü birimi '% pozitif hücreler' petrol kırmızı etiketli yağ damlacıkları doğru belirli bir çekirdek için öznitelik mümkün değildi çünkü hücreleri çalışma etiketli O için kullanılmadı dikkat çekicidir; yağ damlacıkları önemli ölçüde çeşitli boyut, sayı ve dağıtım hücre vücut ve nadiren çekirdekle üst üste. Farklı doku kaynaklardan elde hücreleri arasında yağ kırmızı değişkenlik boyama O var; % pozitif hücreler ölçü geçerli çalışma için uygun değildi, başka bir grup başarıyla insan bezi kök hücre22 türetilmiş adiposit ölçmek için nerede petrol kırmızı O boyama yayılmış bir büyük şişman damlacık çıktı kullanılmış sitoplazma ve çekirdekleri ve % pozitif hücreler olarak sunulmak üzere etkinleştirme verileri ile örtüşen.
Buna ek olarak, FABP4 immunolabelling Morfoloji farklı doku kaynakları23,24,25aralığından elde edilen adiposit içinde tutarlıdır. Hücre farklılaşma yeteneğine sahip bir kültür içinde oranı ölçmek için bir sayı-in kullanma yeteneği. Yetişkin Mezenkimal stromal hücreler çok çeşitli tedavi kullanımlar için önemli sözü tutun. Bu hücreler hastalar26arasında yalıtım27,28siteler arasında ve yalıtım12 için yöntemler arasında kapasitesini doğal değişkenlik klinik çeviri ile ortaya çıkmıştır önemli bir sorun olduğunu ve terapötik kullanım için hücre sayıları12 genişlemesi. Bu daha önce gösterilmiştir yapisan stromal hücre kültürleri sık türdeş olmayan, bazı hücrelerin farklılaşma ve bazı değil 12,17 olarak bizim FABP4 ile tahlil ASC kültürler için gösterir. Bu şekilde deneyleri, zenginleştirme teknikleri ile kombine, heterojen kültürlerin lineage özgü farklılaşma yetenekli içinde alt nüfus tanımlanmasına yardımcı olacak. Bu FABP4 tahlil gibi standart, ölçülebilir tahlil sahip tüm bu değişkenler ve tedavi sonuçları içinde ve klinik çalışmalar arasında değerlendirmek için potansiyel arasında karşılaştırma için basit bir yöntem sağlar.
FABP4 miktar yarı otomatik bir biçimde objektiflik ve tekrarlanabilirlik analizde birçok donör servis taleplerini ve örnekler sağlar. Ayrıca etiketin sitoplazmik olduğu gibi bu sorunlara neden olabilir hipertrofisi (adipocyte boyutu büyütme) Hiperplazi (adipocyte numarası artış), ek olarak obezite araştırma, oldukça önem taşıyor bir ayrım olarak çözümlemeye nerede hipertrofisi şiddetle obez bireyler21adipose disfonksiyonu ile ilişkilidir. Obezite salgın önemli miktarda uyuşturucu lipid depolama kontrol yetenekli belirlenmesinde ilgi mahmuzlu vardır. Bu FABP4 tahlil de bileşikleri lipid birikimi etkisizleştirmek yeteneklerini için binlerce eleme için basit bir okuma sağlar.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Yağ doku ve toplamak ve bu kaynak araştırma kullanım için bize sağlar araştırma uzmanları bağış için minnettarız. Destek Allergan tarafından fon kabul etmek istiyoruz. Ayrıca videoyu ve düzenleme için bu makalenin gönderme maliyeti finansmanı için Auckland Üniversitesi, Tıp Fakültesi ve Sağlık Bilimleri performans dayalı Araştırma Fonu için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
