Summary
Les méthodes traditionnelles d’évaluation de la différenciation adipocytaire sont bon marché et facile à utiliser, mais ne sont pas spécifiques aux changements dans l’expression des gènes. Nous avons développé un test afin de quantifier la différenciation des cellules mésenchymateuses en adipocytes matures à l’aide d’un marqueur spécifique de la lignée. Ce dosage a diverses applications dans la recherche fondamentale et de la médecine clinique.
Abstract
Plusieurs colorants sont actuellement disponibles pour utilisation dans la détection de différenciation des cellules mésenchymateuses en adipocytes. Teintures, tels que l’huile rouge O, sont bon marché, facile à utiliser et largement utilisés par les laboratoires analysant le potentiel adipocytaire de cellules mésenchymateuses. Toutefois, ils ne sont pas spécifiques à l’évolution de la transcription du gène. Nous avons développé un test de différenciation de gène-spécifique pour analyser quand une cellule mésenchymateuse a passé son sort à une lignée adipocytaire. Immuno-étiquetage contre l’acide gras liaison protéine-4 (FABP4), un marqueur spécifique à la lignée de la différenciation adipocytaire, activé la visualisation et la quantification des cellules différenciées. La capacité de quantifier le potentiel de différenciation adipocytaire de cellules mésenchymateuses dans un format 96 puits microplaque influe prometteur pour un certain nombre d’applications. Des centaines d’essais cliniques impliquent l’utilisation de cellules stromales mésenchymateuses adultes et il est actuellement difficile de corréler les résultats thérapeutiques au sein et en particulier entre ces essais cliniques. Ce dosage simple de FABP4 haut débit fournit un test quantitatif pour évaluer le potentiel de différenciation des cellules dérivées de patient et est un outil robuste pour comparer les différentes méthodes d’isolement et d’expansion. Ceci est particulièrement important compte tenu de la reconnaissance croissante de l’hétérogénéité des cellules étant administré à des patients en produits de cellules mésenchymateuses. L’essai a aussi utilité potentielle dans le dépistage des drogues à haut débit, notamment dans la recherche de l’obésité et le pré-diabète.
Introduction
Une des exigences clés mis en place par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT) pour définir une cellule stromale mésenchymateuse multipotente est que les cellules doivent avoir la capacité de se différencier en l’adipocytaire, ostéogénique et lignées chondrogéniques 1. les méthodes conventionnelles de différenciation en ces trois lignées de mesure s’appuient sur la détection de produits macromoléculaires à l’aide de teintures chimiques1. Colorants tels que Oil Red O (dont les taches des gouttelettes de graisse dans les cellules qui ont subi l’adipogenèse), sont bon marché et facile à utiliser ; Toutefois, ils ne parviennent pas à détecter les changements précis dans l’expression des gènes qui se produisent lorsque les cellules mésenchymateuses se différencient en chaque lignage respectives2. Ici, nous avons mis au point un test de différenciation qui quantifie l’expression de la protéine à un marqueur de lignée spécifique adipocytaire, liant les acides gras protéine-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 se trouvait initialement dans murin 3 t 3-L1 adipocytes3 et découvrit plus tard de s’exprimer dans les tissus adipeux sous-cutanés6. C’est une protéine cytosolique, qui agit comme un chaperon pour guider l’absorption des acides gras par les cellules et est impliqué dans le processus de lipolyse4.
Les cellules précurseurs utilisés pour les tests de différenciation ont été adipeux cellules stromales mésenchymateuses dérivées (ASCs)7,8. ASCs partagent de nombreuses propriétés avec moelle osseuse cellules souches mésenchymateuses (BM-CSM), une population de grandes cellules souches mésenchymateuses adultes8,9. ASCs offrent plusieurs avantages sur BM-MSCs dans une application clinique, comme le plus grand rendement de cellules peut être isolée de tissus plus accessibles des sources8,9. Une population de cellules isolées doit répondre à certains critères pour être défini comme l’ASCs. Tout d’abord, elles doivent montrer respect des récipients de culture de tissu en plastique dans des conditions de culture standard1. Elles doivent aussi montrer l’antigène de surface spécifique expression1. ASCs incultes sont caractérisées par l’expression de l’antigène de surface positif de CD34, CD73, CD90, faible expression du CD105 et négative expression de CD45 et HLA-DR10. ASCs purifiées en cultivant sur le plastique pendant 28 jours (adhérent purifiée ASCs) montrent une expression positive de CD73, CD90 et CD105 et expression négative de CD34, CD45 et HLA-DR10. Enfin, les cellules doivent conserver la capacité de se différencier en différents lignages1,7,8.
Protocoles de différenciation adipocytaire induisent upregulation saisissante d’expression FABP4 parmi les autres gènes de lignée adipocytaire, donc nous immunochimie permettant de visualiser FABP4 protéine dans les cellules et ensuite quantifié FABP4 expression au niveau de la cellule unique en utilisant un microscope de dépistage automatisé à haute teneur fluorescent. Cette méthode est avantageuse sur teintures traditionnelles car elle permet la confirmation très spécifique de la différenciation adipocytaire lignée. Ces tests de lignée spécifique de gène combinées à haute teneur également les méthodes de dépistage permettent de quantifier la proportion de cellules au sein d’une préparation de cellules hétérogènes qui sont capables de différenciation vers le bas une lignée particulière. Dans nos études, nous avons utilisé le test FABP4 pour confirmer la perte de potentiel de différenciation adipocytaire des CRA fraîchement isolées après culture cellulaire.
Protocol
1. préparer l’ASCs pour des dosages de différenciation
- Préparer des réactifs de culture de tissus et manipuler des cellules vivantes dans un capot de vitroplants stérile.
- Préparer A0 milieu : milieu d’Eagle modifié Dulbecco et du jambon F12 Medium (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x pénicilline/streptomycine.
- Préparer le milieu complet de NCP : DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x pénicilline/streptomycine, sérum de veau fœtal 10 %.
- Adepte de l’utilisation purifiée NASC, étendu dans un flacon de culture T75. Confirmer la pureté de l’ASC à l’aide de fluorescence-lancée de cellules tri (FACS)10.
- Détacher les cellules en supprimant tous les moyen dans le flacon de culture T75 et ajouter 2 mL d’enzyme de dissociation cellulaire.
- Laisser le flacon de culture dans l’incubateur (37 ° C, humidifiée, 5 % de CO2) pendant 5-10 min. Prenez le flacon de culture hors de l’incubateur et tapoter fermement du côté du ballon. Vérifier si les cellules ont détaché du flacon de culture à l’aide d’un microscope inversé.
- Ajouter 13 mL de milieu de A0 à un flacon de culture T75.
- Transférer 15 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu complet de NCP.
- Effectuer un nombre de cellules à l’aide de hémocytomètre.
- Diluer la suspension de cellules à une concentration de 25 000 cellules mL-1 en milieu complet de NCP.
- Ajouter 200 µL de milieu A0 dans toutes les loges de la périphérie de la plaque 96 puits (fond plat). Cela réduit le taux d’évaporation des puits contenant des cellules dans le centre.
- Transférer 200 µL de suspension cellulaire à une plaque de microtitration pour atteindre une densité finale de 5 x 103 cellules par puits. Quatre puits sont nécessaires pour chaque groupe de traitement (en triple répétitions techniques et un aucun contrôle de l’anticorps primaire pour l’immunocytochimie (ICC)).
- Laisser la plaque de microtitration dans l’incubateur (37 ° C, humidifié, 5 % de CO2) jusqu'à cellules portée confluence (3-4 jours).
2. induisant la différenciation des cra
- Préparez moyen de différenciation adipocytaire en complétant le milieu ASC complet avec 1 µM dexamethasome, de 10 insuline µM et de 200 µM l’indométhacine. Le support complet de différenciation est stable à 4 ° C pendant 1 mois, faire ainsi seulement tel que requis pour l’analyse de 1. Magasin à 4 ° C et, le cas échéant, faire chauffer une partie aliquote à 37 ° C au bain-marie.
- Après 3-4 jours, prenez la plaque de microtitration hors incubateur et remplacez la moitié bouillon de culture par moyen de différenciation adipocytaire.
- Effectuer un changement de moyen tous les 2-3 jours.
Remarque : La différenciation adipocytaire optimale nécessite 14 jours de culture dans un milieu de différenciation. Les cellules différenciées sont analysés en utilisant les taches de teinture traditionnelle basée et taches de gène-spécifique.
3. coloration de différenciation - teinture traditionnelle base de taches
- Préparer la solution de formaldéhyde à 4 % 16 % formaldéhyde avec PBS de dilution. Diluer seulement le montant nécessaire pour l’expérimentation et le magasin hermétiquement scellé dans un tube à centrifuger.
ATTENTION : Le formaldéhyde est un cancérigène potentiel et peut causer une irritation de nez, gorge et poumons après inhalation. Effectuez toutes les procédures relatives au formaldéhyde dans une hotte de laboratoire. - Préparer la solution mère Oil Red O en dissolvant 300 mg dans 100 mL d’isopropanol.
- Prendre la plaque de microtitration hors de l’incubateur. Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans un environnement non stérile.
- Retirer tous les moyen de puits et de fixer les cellules avec 4 % de formaldéhyde pendant 30 min.
- Au cours de la période d’incubation, préparer la solution de travail Oil Red O. Solution de travail comprend 6 stock d’huile rouge O de pièces d’eau de 4 parties distillées (dH2O). Bien mélanger et laisser reposer à température ambiante pendant 20 min, avant de filtrer à l’aide de 0,2 unité de filtre µm. Solution de travail n’est stable pendant 2 h.
- Supprimer tous formaldéhyde provenant de puits en pipettant également.
- Laver les cellules avec 60 % isopropanol et laissez que les puits sécher complètement avant de procéder.
- Ajouter 50 µL de solution de travail Oil Red O dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Retirer l’huile rouge O solution et ajouter immédiatement dH2O. Wash avec dH2O 4 fois avant Regarde un sous microscope optique.
4. coloration de différenciation - gène spécifique anticorps
- Préparer la solution mère de Tris buffered saline (TBS) en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl et 30 g de Tris Base à 1 L de dH2O (pH 8). Préparer la solution de travail en diluant 01:10 à l’aide de dH2O. magasin à la température ambiante.
- Préparer immunobuffer (IB) (1 % bovine sérum fœtal (SVF) au SCT). Étiqueter le tube à centrifuger 15 mL avec date et conserver à 4 ° C. IB peut être utilisé pour 1 semaine de la date.
- Préparez bloqueur de caséine de 0,25 % en dissoudre 0,5 g de caséine et 0,195 g d’azide de sodium dans 200 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissoudre complètement les ingrédients en remuant pendant la nuit. Aliquote dans des tubes à centrifuger 15 mL et magasin dans un congélateur à-20 ° C. Solutions de caséine décongelés peuvent être conservées à 4 ° C pendant 1 mois.
- Préparer la solution de DAPI en diluant stock DAPI 1 : 200 dans les directives du SCT. magasin à 4 ° C, abri de la lumière.
- Préparer solution stock thimérosal (mg 10 mL-1) en dissolvant du thimérosal dans du PBS stérile. Conserver à 4 ° C et diluer les montants appropriés à 0,4 mg mL-1 pour une utilisation.
- Difficulté et permeabilize des cellules avec du méthanol glacee (plaque de 96 puits) pour les cellules de lavage de 5 min. une fois avec 200 µL du SCT.
- Bloc avec 50 µL de 0,25 % de caséine à température ambiante pendant 10 min et laver une fois avec les directives du SCT.
- Ajouter 50 µL d’anticorps primaires dilué dans de l’IB (voir le tableau 1 pour des détails d’anticorps) et incuber à couvercle fermé pendant 1 h.
- Laver une fois avec 200 µL du SCT et puis 3 fois avec le SCT pendant 5 min avec le doux balancement.
- Ajouter 50 µL d’anticorps secondaires dilué dans de l’IB (voir le tableau 2 pour les détails de l’anticorps) avec 1 : 2000 DAPI dans chacune, incuber avec couvercle fermé pendant 1 h. de la couverture de la plaque avec une feuille pour prévenir le blanchiment photo.
- Laver une fois avec le SCT, puis deux fois avec le SCT pour 15 min avec le doux balancement.
- Retirez tous les SCT et ajouter 200 µL de solution de thimérosal.
- Stocker la plaque à 4 ° C, abri de la lumière jusqu'à ce que l’imagerie.
5. imagerie de cellules à l’aide d’un Microscope à haut débit
- Analyser les cellules colorées avec un fluorophore et des anticorps spécifiques de gènes conjugués Anticorps secondaires (immunofluorescence) en utilisant un microscope de haute teneur dépistage contrôlé avec qui accompagne le logiciel.
- Charger la plaque de microtitration dans la platine du microscope. Le contrôle d’acquisition de plaque, sélectionnez l’image à un grossissement de moyenne portée (objectif 10 X). Assurez-vous que les images sont tirées du centre de chaque puits, avec 50 µm espacement entre chaque site pour vous assurer que les lymphocytes n’apparaissent pas dans les deux champs adjacents.
- Sélectionnez les puits à l’image.
- Sélectionnez les combinaisons de canal approprié, les temps d’exposition et les paramètres de z-offset. Voir tableau 3 pour des informations plus détaillées de chaque filtres (supplémentaires Tableau 2).
- Acquérir le dosage à l’aide de l’Assistant d’acquisition (les images sont automatiquement stockés au serveur de base de données).
- Utilisez les combinaisons de canal alternatif pour acquérir des plaques colorées au rouge huile O. (supplémentaires Tableau 3).
6. analyser l’Image acquise
Remarque : Accès distant à la base de données serveur Active évaluation rapide et facile des images acquises et l’utilisation du logiciel d’analyse de l’image.
- Module de cellule marquant ouvert sur le logiciel d’analyse.
- Détecter les noyaux des cellules à l’aide de canal DAPI (marqueur nucléaire) et les noyaux de segment d’intérêt avec des paramètres définis par l’utilisateur pour la taille et intensité au-dessus de fond du signal.
- Détecter le signal de FABP4 à l’aide de canaux FITC. Segmenter les cellules différenciées avec des paramètres définis par l’utilisateur pour l’intensité de taille et de signal au-dessus de fond pour sélectionner toutes les régions de positif de FABP4 dans chaque image.
- Ouvrez le module Transfluor sur le logiciel d’analyse pour analyser les plaques colorées avec l’huile rouge O.
- Spécifiez la taille et l’intensité des Oil Red O teinté de régions comme des « puits ».
Representative Results
Dans cette étude, on a mesuré le potentiel de différenciation adipocytaire des CRA avec 3 différentes méthodes. Étiquetage par immunofluorescence des FABP4, ont montré que ce marqueur localisée dans le cytoplasme des cellules différenciées, et l’étiquetage se chevauchait avec les noyaux marquées au DAPI (Figure 1 a). Analyse d’image automatisé a révélé une multiplication 24,6 % de cellules positives FABP4 dans le groupe différencié en cellules de passage précoce par rapport à l’augmentation de 6,9 fois dans les cellules de passage tardif (Figure 1 b). Huile rouge O coloration a été localisée à graisses gouttelettes dispersées dans le cytosol des cellules différenciées, et l’étiquetage chevauche rarement marquées au DAPI noyaux ; de l’inspection visuelle, il y a cependant moins noyaux cellulaires associés avec des gouttelettes de graisse huile rouge O dans les cellules de passage tardif par rapport aux premières cellules de passage (Figure 2 a). Analyse d’image automatisé a révélé une augmentation de 11,1 pli dans le domaine de Oil Red O coloration par cellule dans des cellules de passage précoce et une multiplication 53,9 coloration de surface par cellule dans des cellules de passage tardif (Figure 2 b). Imagerie des deux taches a été effectué et ensuite quantifiée à l’aide de la cellule marquant (FABP4) ou Transfluor (Oil Red O) module dans le logiciel (figure1 complémentaire, supplémentaire tableau 2-5). L’upregulation d’expression FABP4 a été confirmée par Western Blot (Figure 3, complémentaire de la Figure 5). Toutes les méthodes d’analyse 3 a révélé que début ASCs passage supérieure différenciation adipocytaire potentielle que les cellules de passage tardif. La différenciation adipocytaire n’affecte pas le nombre total de cellules par puits (supplémentaires Figure 2, 3). Toutefois, la taille de noyaux de cellules différenciées FABP4 positives a été significativement plus petite que les cellules contrôle fin passage ASCs seulement (supplémentaire Figure 3).
Nous avons démontré que comme cellules ont été développés dans la culture, ou repiquées, le pourcentage de cellules dans la culture capable de différenciation adipocytaire une diminution, en conformité avec les données précédemment publiées11. Il est important de noter que des facteurs comme l’âge, indice de masse corporelle ou anciens antécédents médicaux12 pas pourraient être contrôlées pour cette étude et probablement contribués à la variabilité entre les échantillons de donneurs différents (complémentaire du tableau 1).
Figure 1 : FABP4 immunomarquage montre que les premières cellules de passage ont une plus grande différenciation potentielle que les cellules de passage ultérieurs. A) images représentatives de passage précoce et tardif, de contrôle et de cellules différenciées étiquetées avec DAPI (tache nucléaire) et FABP4 figurent aux côtés de fusion et segmentation. La segmentation d’images afficheront différenciés de cellules avec une superposition de verte et cellules non différenciées avec une superposition en rouge. B) une augmentation significative de FABP4 exprimant des cellules a été observée avec la différenciation adipocytaire dans les cellules de passage tôt ou tard, toutefois, premières cellules de passage ont démontré une augmentation significativement plus élevée dans la différenciation que les cellules de passage tardif (Mann Whitney test * dénote P < 0,05 et *** dénote P < 0,001). Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Oil Red O coloration montre que les premières cellules de passage ont une plus grande différenciation potentielle que les cellules de passage ultérieurs. A) les images représentatives de DAPI (tache nucléaire) et Oil Red O (gris, teinté de gouttelettes lipidiques) apparaissent aux côtés de fusion et segmentation. Les images de segmentation représentent tous les noyaux avec overlay vert et Oil Red O colorées des gouttelettes lipidiques avec une superposition en rouge. B) une augmentation significative dans la zone de coloration rouge de l’huile O a été observée avec la différenciation adipocytaire. Cellules de passage précoces ont montré une plus grande zone de tache d’huile rouge O par cellule par rapport à des cellules de passage tardif. Le domaine de Oil Red O coloration par cellule (μm2) est utilisé ici comme une mesure de la différenciation adipocytaire potentielle. Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM (test de Mann Whitney * dénote P = < 0,05 et *** dénote P = < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse par transfert Western de niveau d’expression de protéines FABP4 de passage différencié au début et fin ASCs. Analyse semi-quantitative de la densité optique des bandes FABP4 comme un rapport de contrôle de chargement de protéines totales, actine beta (ACTB), a montré que FABP4 immunomarquage augmente significativement dans passage précoce et à un passage tardif de moindre degré différencié cellules. Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM (test de Mann Whitney * dénote P = < 0,05 et *** dénote P = < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Antigène cible | Isotype (clone) | Espèces | Dilution |
| FABP4 | Polyclonaux | Lapin | 1/100 |
Tableau 1 : Anticorps primaire
| Ciblage des anticorps | Étiquette de fluorophore | Espèces | Dilution |
| IgG de lapin | Alexa Fluor 488 | Chèvre | 1 : 200 |
Tableau 2 : Anticorps secondaire
Supplémentaire Figure 1 : vue d’ensemble de l’environnement virtuel d’analyse image. Les cellules colorées ont été projetés à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé et à haut débit afin d’éviter toute source de partialité. Images acquises à l’aide de ImageXpress Micro XLS, ont été enregistrées directement dans la base de données du gestionnaire de données de MDCStore et mis à disposition pour consultation par le biais de connexions Bureau virtuelles, qui aux utilisateurs d’optimiser et de tester leurs paramètres d’analyse spécifique. Des images ont été analysés avec une instance dédiée « autorun » qui permet à plusieurs utilisateurs différents envoyer des « emplois » à la file d’attente de l’autorun. Utilisateurs peuvent récupérer leurs données via les instances virtuel une fois terminées leurs « emplois ». S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Supplémentaire Figure 2 : comparaison du total count / puits de contrôle de cellules et différenciés des puits pour passage précoce et tardif CRA, à l’aide de FABP4 teint plaque. Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM Il n’y avait aucune différence statistiquement significative entre le contrôle et les cellules différenciées pour passage précoce et tardif ASCs. Il y avait plus de cellules / puits pour les cellules de passage précoces par rapport aux cellules de passage tardif. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Supplémentaire Figure 3 : comparaison du total count / puits de contrôle de cellules et différenciés des puits pour passage précoce et tardif CRA, à l’aide d’huile rouge O teint plaque. Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM Il n’y avait aucune différence statistiquement significative entre le contrôle et les cellules différenciées pour passage précoce et tardif ASCs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Supplémentaire Figure 4 : À des passages plus tard, des cellules différenciées qui ont été FABP4 positif étaient significativement plus petite superficie de noyaux que les cellules dans les puits de contrôle. Il n’y avait aucune différence statistiquement significative dans le domaine des noyaux entre contrôle et cellules différenciées au passage au début. Les données affichées sont la moyenne partout au passage précoce (p4 ; n = 8) ou passage tardif (p10 ; n = 4) échantillons de donneurs, ± SEM. (test t non apparié. *** dénote P = < 0,001). Moyenne ± SEM sont affichées.) S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Supplémentaire Figure 5 : Images of Western blot des gels. Couche rouge représente beta-actine. Canal vert représente FABP4 immunomarquage. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Supplémentaire tableau 1 : information anatomopathologiques des donateurs S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
Supplémentaires Tableau 2 : imagerie des paramètres (FABP4) S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
Supplémentaires Tableau 3 : imagerie des paramètres (Oil Red O) S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
Supplémentaires Tableau 4 : tableau des paramètres d’analyse utilisés (FABP4). Module de pile de Scoring. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
Complémentaires tableau 5 : tableau des paramètres d’analyse utilisés (Oil Red O). Module de trans Fluor. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Cet article démontre l’utilité et les avantages de FABP4 immunomarquage avec précision détecter et quantifier des adipocytes matures dérivées de cellules stromales mésenchymateuses. FABP4 est capable de détecter des changements dans l’expression d’un lignage protéine spécifique3,4,5 dans les adipocytes matures, contrairement aux autres communément utilisé des colorants quelle étiquette macromoléculaire change13,14 comme Oil Red O15, Nil rouge16 et noir Soudan17. FABP4 immunomarquage permettant la visualisation et l’analyse des changements dans la morphologie cellulaire. Il s’agit d’un avantage distinctif par rapport aux méthodes décrites précédemment à l’aide de la transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) qui analyse les changements au niveau de la transcription sans aucune visualisation5,18,19 ,20, ou écoulement cytometry nécessitant des cellules en suspension20ou Western Blot qui fonctionne avec pour être lysées pour isoler les protéines19,20. FABP4 immunomarquage est stable dans les cellules fixes, ne fuit pas en solution et étant une protéine cytosolique quand étiquetés d’une monocouche adhérente des cellules, se chevauchent avec le noyau permettant une visualisation facile et ajouté la précision dans l’analyse automatique.
Dépistage de haute teneur est avantageuse, car il est rapide, précis, reproductible et objective. Il fournit une plate-forme pour une utilisation rentable des réactifs et temps de chercheur, puisque analyse et acquisition d’images exigent une manipulation manuelle minimale et s’appuient sur le traitement automatique de l’instrument. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme essentiels à la précision et la reproductibilité de la projection de haute teneur dosages31. La quantification de l’expression de l’antigène s’appuie sur la qualité de l’image. Pour l’analyse des images réussies, images de chaque canal par puits doivent être mise au point et relèvent d’une dynamique optimale pour les valeurs de gris (paramètres Auto exposer sont idéales). Sortie de focus ou saturée d’images conduisent à des résultats erronés.
Certaines limites possibles des méthodes décrites dans cet article sont les suivants. L’obligation pour le logiciel spécialisé de matériel et d’analyse d’imagerie. En dehors de la portée du présent article, les options logicielles alternatives open source (par exemple, ImageJ,32,33, Fidji34, CellProfiler32,35) peuvent être utilisées pour effectuer la segmentation d’images similaires tâches ; Toutefois, ils nécessitent les compétences nécessaires pour télécharger et adapter des macros disponibles en ligne ou écrire des macros/commandes pour leurs pipelines d’analyse spécifique. Un niveau de bruit de fond est inhérent aux pipelines tous automatisés d’analyse d’imagerie. Cela est attribuable en grande partie aux débris, image mauvaise qualité analyse erreur ou, en insistant sur la nécessité d’une préparation attentive et minutieuse mise en place de la plateforme d’imagerie et d’analyse. L’étiquette de FABP4 chez la souris a été trouvé pour détecter les cellules souches indifférenciées,30; alors que les contrôles dans cette étude (qui se composent de cellules indifférenciées) sont dépourvues de coloration spécifique de FABP4. Ce scores sous la nécessité d’archiver les FABP4 expression indifférencié progéniteurs dans chaque contexte biologique où l’essai est employé.
Afin d’établir des comparaisons valables entre l’étiquetage FABP4 et Oil Red O coloration, les mesures de sortie de l’analyse de l’image devait être biologiquement pertinente. Par conséquent, la mesure, « % des cellules positives » a été utilisée pour FABP4, et « zone de coloration par cellule » a été utilisé pour l’huile rouge O. Il est à noter que la mesure « % des cellules positives » n’était pas utilisée pour Oil Red O étiquetés cellules dans notre étude, parce qu’il n’était pas possible d’attribuer les gouttelettes de gras marqués avec précision à un noyau donné ; les gouttelettes de matière grasses varient considérablement en taille, nombre et répartition à travers le corps de la cellule et se chevauchent rarement avec le noyau. Oil Red O coloration variabilité existe entre les cellules provenant de tissus différentes sources ; alors que le % positive cellules mesure n’était pas approprié pour la présente étude, un autre groupe a utilisé avec succès pour quantifier les adipocytes provenant de cellules souches humaines glande22 où la coloration à l’huile rouge O est apparue comme une grosses gouttelettes de graisses qui s’étend sur le cytoplasme et superposées avec des noyaux et porteur de données soient présentées comme des cellules positives %.
En revanche, la morphologie des FABP4 immunomarquage Concorde dans les adipocytes provenant d’une gamme de tissus de différentes sources23,24,25. La capacité de quantifier la proportion de cellules au sein d’une culture capable de différenciation a un certain nombre d’applications. Cellules stromales mésenchymateuses adultes significatifs semblent prometteurs pour un large éventail d’utilisations thérapeutiques. Une question importante qui a surgi avec la traduction clinique est la variabilité inhérente à la capacité de ces cellules entre patients26, entre les sites d’isolement27,28et entre les méthodes d’isolement12 et l’expansion des cellules numéros12 pour un usage thérapeutique. Il a été démontré précédemment que les cultures de cellules stromales adhérentes sont fréquemment hétérogènes, avec quelques cellules capables de différenciation et d’autres non 12,17 , comme notre FABP4 dosage montre pour les cultures de l’ASC. Dosages comme ceci, combiné avec des techniques d’enrichissement, permettra d’identifier les sous-populations au sein de cultures hétérogènes capables de différenciation de la lignée spécifique. Avoir un test standardisé, quantifiable tels que cet essai de FABP4 fournit une méthode simple pour la comparaison entre toutes ces variables et la possibilité d’évaluer des résultats thérapeutiques dans et entre les essais cliniques.
La quantification des FABP4 de façon semi-automatique permet d’objectivité et la reproductibilité dans l’analyse à travers de nombreux cas, donateurs et échantillons. En outre que l’étiquette est cytoplasmique, il peut être éventuellement utilisé pour analyser l’hypertrophie (élargissement de la taille de l’adipocyte) en plus de l’hyperplasie (augmentation de nombre d’adipocytes), une distinction qui est d’une importance considérable dans la recherche sur l’obésité, où l’hypertrophie est fortement liée à la dysfonction adipeuse chez les personnes obèses21. L’épidémie d’obésité, ont suscité beaucoup d’intérêt dans l’identification des médicaments capables de contrôler le stockage des lipides. Ce dosage FABP4 fournit également une lecture simple pour le dépistage des milliers de composés pour leur capacité à inhiber l’accumulation de lipides.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers les bailleurs de fonds des tissus adipeux et les professionnels de la recherche qui collectent et nous fournissent cette ressource pour la recherche. Nous tenons à remercier financement par Allergan. Nous sommes également reconnaissants à l’Université d’Auckland, Faculté de médecine et santé des fonds de recherche de Sciences de la Performance basée pour financer le coût de filmer et d’édition pour la présentation de cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
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