Summary
Traditionelle Methoden zur Beurteilung der adipogenen Differenzierung sind billig und einfach zu bedienen, aber sind nicht spezifisch für Änderungen in der Genexpression. Wir haben einen Test zur Quantifizierung von mesenchymalen Zelldifferenzierung in Reifen Adipozyten mit einer Linie spezifische Marker entwickelt. Dieser Test hat vielfältige Anwendungen in Grundlagenforschung und klinischer Medizin.
Abstract
Einige Farbstoffe sind derzeit verfügbar für den Einsatz bei der Aufdeckung von Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Adipozyten. Farbstoffe, wie z. B. Öl rot O sind billig, einfach zu bedienen und häufig genutzte Laboratorien analysiert das adipogenen Potenzial der mesenchymalen Zellen. Sie sind jedoch nicht spezifisch für Veränderungen der Gentranskription. Haben wir einen Gen-spezifischen Differenzierung-Assay, analysieren, wenn eine mesenchymale Zellen sein Schicksal auf einer adipogenen Linie umgestellt hat. Immuno-Kennzeichnung gegen Fettsäure-bindende Protein-4 (FABP4), Abstammung-spezifische Marker für adipogenen Differenzierung ermöglicht Visualisierung und Quantifizierung von differenzierten Zellen. Es hat die Fähigkeit, adipogenen Differenzierung Potenzial von mesenchymalen Zellen in einem Format 96 gut Mikrotestplatte quantifizieren vielversprechende Auswirkungen auf eine Reihe von Anwendungen. Hunderte von klinischen Studien beinhalten die Verwendung von adulten mesenchymalen Zellen Stromazellen und es ist derzeit schwierig, therapeutische Ergebnisse innerhalb und vor allem zwischen solche klinischen Studien zu korrelieren. Dieser einfachen Hochdurchsatz-FABP4-Assay ist ein robustes Werkzeug für den Vergleich verschiedener Isolierung und Erweiterung Methoden und vorsieht, dass einen quantitative Assay Beurteilung des Potenzials der Differenzierung von Patienten gewonnenen Zellen. Dies ist besonders wichtig, die zunehmende Anerkennung der Heterogenität der Zellen wird verabreicht, um Patienten in mesenchymale Zellen Produkte gegeben. Der Test hat auch potenziellen Nutzen im Hochdurchsatz-Drogen-Screening, insbesondere Adipositas und Prä-Diabetes-Forschung.
Introduction
Die wichtigsten Anforderungen, hergestellt von der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) eine multipotente mesenchymale Stromazellen Zelle definieren gehört, dass die Zellen die Fähigkeit, in die adipogenen, osteogene und Chondrogenic Linien unterscheiden müssen 1. konventionelle Methoden zur Messung der Differenzierung in dieser drei Linien verlassen sich auf die Erkennung von makromolekularen Produkte mit chemischen Farben1. Farbstoffe wie Öl rot O (die Fette-Tröpfchen in den Zellen, die angereizte durchlaufen haben Flecken), sind billig und einfach zu bedienen; jedoch sie nicht erkennen, die konkreten Veränderungen in der Genexpression, die auftreten, wenn in jeder jeweiligen Lineage2mesenchymale Zellen zu differenzieren. Hier haben wir einen Differenzierung Assay entwickelt, der Proteinexpression adipogenen Abstammung-spezifische Marker, Fatty Acid Binding Protein 4 (FABP4)3,4,5quantifiziert. FABP4 wurde ursprünglich in murinen 3 t 3-L1 Adipozyten3 gefunden und wurde später entdeckt, um menschliche subkutanem Fettgewebe6ausgedrückt werden. Es ist ein cytosolischen Protein, das wirkt wie ein Chaperon, Fettsäure-Aufnahme von Zellen führen und ist in den Prozess der Lipolyse4.
Die Vorläuferzellen verwendet für die Differenzierung-Assays wurden abgeleitete mesenchymaler Stromazellen Fettzellen (ASC)7,8. ASC teilen viele Eigenschaften mit dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen (BM-MSCs), einer großen mesenchymale Stammzellen Bevölkerung in Erwachsene8,9. ASC bieten mehrere Vorteile gegenüber BM-MSCs in einer klinischen Anwendung höhere Ausbeute der Zellen von leichter zugänglich Gewebe Quellen8,9isoliert werden kann. Eine isolierte Zellpopulation muss bestimmten Kriterien als ASC definiert werden. Zunächst müssen sie festhalten an Kunststoff Gewebe Kulturgefäße in standard Kultur Bedingungen1zeigen. Sie müssen auch bestimmte Oberflächenantigen Ausdruck1zeigen. Unkultiviert ASCs zeichnen sich durch positive Oberflächenantigen Ausdruck von CD34, CD73, CD90, geringe Expression von CD105 und negativen Ausdruck von CD45 und HLA-DR-10. ASC gereinigt durch Kultivierung auf Kunststoff für 28 Tage (Anhänger gereinigt ASCs) zeigen positive Ausdruck von CD73, CD90 und CD105 und negativen Ausdruck von CD34, CD45 und HLA-DR10. Schließlich müssen die Zellen die Fähigkeit, sich in verschiedenen Abstammungslinien1,7,8differenzieren behalten.
Adipogenen Differenzierung Protokolle induzieren markante Hochregulation des FABP4 Ausdrucks unter anderen Adipocyte Abstammung Genen, so wir Immunchemie, um FABP4 Protein in den Zellen zu visualisieren, und dann FABP4 Ausdruck der Ebene der einzelnen Zelle quantifiziert eine automatisierte fluoreszierende High-Content-Screening Mikroskop. Diese Methode ist vorteilhaft gegenüber traditionellen Farbstoffe wie es hochspezifische Bestätigung des Adipocyte-Linie Differenzierung ermöglicht. Solchen gen spezifische Linie Assays mit hohem Gehalt screening-Verfahren auch kombiniert ermöglichen Quantifizierung der Anteil der Zellen innerhalb einer heterogenen Zelle Zubereitung, die Differenzierung nach einer bestimmten Linie fähig sind. In unseren Studien haben wir die FABP4-Assay um Verlust adipogenen Differenzierung Potenzial der frisch isolierte ASC nach Zellkultur zu bestätigen.
Protocol
1. Vorbereitung ASCs für Differenzierung Assays
- Zellkultur-Reagenzien vorzubereiten und lebenden Zellen in einem sterilen Gewebekultur-Haube zu behandeln.
- Bereiten Sie A0 Medium: Dulbecco geändert Eagle Medium und Hams F12 Medium (DMEM/F12), 1 X Glutamax, 1 X Penicillin/Streptomycin.
- Bereiten Sie komplette ASC Medium: DMEM/F12, 1 X glutamax, 1 X Penicillin/Streptomycin, fötalen Rinderserum 10 %.
- Verwendung Anhänger gereinigt ASC in ein Auffanggefäß T75 Kultur erweitert. Bestätigen Sie die Reinheit der ASC mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS)10.
- Lösen Sie Zellen, indem alle mittelständischen aus T75 Kultur Kolben entfernen und Hinzufügen von 2 mL der Zelle Dissoziation Enzym.
- Lassen Sie die Kultur-Küvette in den Inkubator (37 ° C, befeuchtet, 5 % CO2) für ca. 5-10 min. Nehmen Sie die Kultur-Küvette aus dem Inkubator und tippen Sie fest auf der Seite des Kolbens. Überprüfen Sie, ob die Zellen aus der Kultur-Flasche mit einem inversen Mikroskop getrennt haben.
- T75 Kultur Kolben 13 mL A0 Medium hinzufügen.
- Übertragen Sie 15 mL in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 400 X g für 5 min.
- Den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL der kompletten ASC Medium.
- Führen Sie eine Anzahl von Zellen mit Hemocytometer.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension zu einer Konzentration von 25.000 Zellen mL-1 in kompletten ASC Medium.
- Alle Peripherie-Brunnen von den 96-well-Platte (Flachboden) 200 µL A0 Medium hinzufügen. Dies reduziert die Verdunstung der Brunnen mit Zellen in der Mitte.
- Übertragen Sie 200 µL Zellsuspension auf einen Microwell-Teller, eine endgültige Zelldichte von 5 x 103 Zellen pro gut zu erreichen. Vier Brunnen sind für jede Behandlungsgruppe (dreifacher technische Wiederholungen und eine keine primären Antikörper-Kontrolle für Immunocytochemistry (ICC)) erforderlich.
- Lassen Sie Microwell Platte im Inkubator (37 ° C, befeuchtet, 5 % CO2) bis Zellen erreichen Zusammenfluss (3-4 Tage).
(2) Induktion Differenzierung der ASC
- Bereiten Sie adipogenen Differenzierung Medium durch die Ergänzung von kompletten ASC-Medium mit 1 µM Dexamethasome, 10 µM Insulin und 200 µM Indometacin. Das vollständige Differenzierung Medium liegt stabil bei 4 ° C für 1 Monat, so dass nur stellen je nach Bedarf für 1-Assay. Shop bei 4 ° C und bei Bedarf erhitzen eine aliquote auf 37 ° C im Wasserbad.
- Nach 3-4 Tagen Microwell Teller aus Inkubator und ersetzen Sie die Hälfte des Kulturmediums mit adipogenen Differenzierung Medium.
- Führen Sie eine mittlere Änderung alle 2-3 Tage.
Hinweis: Optimale adipogenen Differenzierung erfordert 14 Tage Kultur in Differenzierung Medium. Differenzierte Zellen sind mit traditionellen Farbstoff basierend Flecken und Gen-spezifischen Flecken analysiert.
3. Färbung zur Differenzierung - traditionelle Farbstoff basierenden Flecken
- Bereiten Sie 4 % Formaldehyd-Lösung von 16 % Formaldehyd mit PBS verdünnen. Nur im Experiment benötigt und Store dicht verschlossen in einem Zentrifugenröhrchen zu verdünnen.
Achtung: Formaldehyd ist Karzinogen der potenziellen und kann zu Reizungen führen, Nase, Rachen und Lunge beim Einatmen. Führen Sie alle Verfahren im Zusammenhang mit Formaldehyd unter einem Abzug. - Bereiten Sie Öl rot O-Stammlösung durch Auflösen von 300 mg in 100 mL Isopropanol.
- Nehmen Sie die Microwell-Platte aus dem Inkubator. Die folgenden Schritte können in einer nicht-sterilen Umgebung durchgeführt werden.
- Entfernen Sie alle Mittel aus Brunnen und fixieren Sie Zellen mit 4 % Formaldehyd für 30 min.
- Bereiten Sie während der Inkubationszeit Öl rot O funktionierende Lösung. Arbeitslösung besteht aus 6 Teilen Öl rot O Lager mit 4 Teilen destilliertem Wasser (dH2O). Mischen Sie gut und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 20 min, vor dem Filter mit 0,2 µm-Filter-Einheit. Arbeiten Lösung ist nur für 2 h stabil.
- Entfernen Sie alle Formaldehyd aus Brunnen durch pipettieren.
- Waschen Sie Zellen einmal mit 60 % Isopropanol und lassen Sie die Vertiefungen vollständig, bevor Sie fortfahren trocknen.
- Jede Vertiefung 50 µL Arbeitslösung Öl rot O hinzufügen und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Öl rot O Lösung entfernen und sofort dH2O. Wash mit dH2O 4 Mal vor Betrachtung unter Lichtmikroskop hinzufügen.
(4) Färbung zur Differenzierung - Gen spezifischen Antikörper
- Bereiten Sie Stammlösung Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS vor) durch Auflösen von 80 g NaCl, KCl 2 g und 30 g Tris-Base zu 1 L dH2O (pH 8). Bereiten Sie funktionierende Lösung durch Verdünnung 01:10 mit dH2O. Store bei Raumtemperatur.
- Immunobuffer (IB) vorbereiten (1 % fetalen bovine Serum (FBS) in TBS). Beschriften Sie die 15 mL Zentrifugenröhrchen mit Datum und Lagerung bei 4 ° C. IB kann für 1 Woche ab Eingang verwendet werden.
- Bereiten Sie 0,25 % Kasein Blocker durch Auflösen von 0,5 g Casein und 0,195 g Natriumazid in 200 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor). Lösen Sie vollständig Zutaten unter Rühren über Nacht auf. Aliquot in 15 mL Zentrifuge Tuben und Shop in einem Gefrierschrank-20 ° C. Aufgetauten Kasein-Lösungen können für 1 Monat bei 4 ° C gehalten werden.
- Bereiten Sie DAPI Lösung durch Verdünnung Lager DAPI 1: 200 in El Store bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.
- Bereiten Sie Lager Thiomersal Lösung (10 mg mL-1) durch Auflösen von Thiomersal in sterilen PBS. Bei 4 ° C lagern und entsprechende beträgt 0,4 mg mL-1 für den Einsatz zu verdünnen.
- Fix und permeabilize Zellen mit eiskalten Methanol (96-well-Platte) für 5 min. Waschen Zellen einmal mit 200 µL des TBS.
- Block mit 50 µL 0.25 % Casein bei Raumtemperatur für 10 min und einmal waschen mit TBS.
- Fügen Sie 50 µL Primärantikörper in IB verdünnt (siehe Tabelle 1 für Antikörper Details) und inkubieren Sie mit Deckel für 1 h geschlossen.
- Einmal waschen Sie, mit 200 µL des TBS und dann 3 Mal mit TBS für 5 min mit sanftes Schaukeln.
- Fügen Sie 50 µL Sekundärantikörper in IB verdünnt (siehe Tabelle 2 für Antikörper Details) mit 1: 2000 DAPI in jedem, inkubieren mit Deckel geschlossen für 1 h Cover der Platte mit Folie Foto Ausbleichen zu verhindern.
- Einmal mit TBS, waschen und dann zweimal mit TBS für 15 min mit sanftes Schaukeln.
- Entfernen Sie alle TBS und fügen Sie 200 µL Thiomersal-Lösung hinzu.
- Bewahren Sie Platte bei 4 ° C, bis Bildgebung vor Licht geschützt auf.
(5) Bildgebung Zellen mit einem High-Throughput-Mikroskop
- Analysieren Sie Zellen befleckt mit Gen spezifische Antikörper und Fluorophor konjugierten Sekundärantikörper (Immunfluoreszenz) mit einem hohen Content Screening-Mikroskop mit begleitenden Software gesteuert.
- Laden Sie die Microwell-Platte in den Mikroskoptisch. Wählen Sie auf der Platte Übernahme drücken Bild bei mittlerer Reichweite Vergrößerung (10 X-Objektiv). Sicherstellen Sie, dass die Aufnahmen von der Mitte jedes gut mit 50 µm-Abstand zwischen jedem Standort um sicherzustellen, dass diese eine Zelle in zwei benachbarte Felder nicht angezeigt wird.
- Wählen Sie die Brunnen zum Bild.
- Wählen Sie den entsprechenden Kanalkombinationen, Belichtungszeit und Z-Offset Parameter. Siehe Tabelle 3 für weitere detaillierte Informationen über jedes Filter (ergänzende Tabelle 2).
- Den Test mit dem Übernahme-Assistenten (Bilder werden automatisch auf Datenbankserver gespeichert) zu erwerben.
- Verwenden Sie alternative Kanalkombinationen, um Platten, befleckt mit Öl rot O. (ergänzende Tabelle3) zu erwerben.
(6) erworbene Bild analysieren
Hinweis: Remote-Zugriff auf die Datenbank Server ermöglicht schnelle und einfache Auswertung der Bilder erworben und Nutzung der Bildanalyse-Software.
- Offenen Zelle Scoring-Modul auf die Analyse-Software.
- Erkennen Sie Zellkerne mit DAPI-Kanal (nukleare Marker) und Segment-Kerne von Interesse mit benutzerdefinierten Parameter für Größe und signalisieren Sie Intensität über Hintergrund zu.
- Erkennen Sie FABP4 Signal mit FITC-Kanal. Segmentieren Sie differenzierte Zellen mit benutzerdefinierten Parametern für Größe und Signalleitungen Intensität über Hintergrund, alle FABP4 positive Regionen in jedem Bild auszuwählen.
- Öffnen Sie Transfluor Modul auf die Analyse-Software, Platten mit Öl rot O. befleckt zu analysieren
- Geben Sie die Größe und Intensität der Öl rot O gefärbten Regionen als "Gruben".
Representative Results
In dieser Studie wurden die adipogenen Differenzierung Potenzial der ASC mit 3 verschiedenen Methoden gemessen. Immunofluorescent Kennzeichnung von FABP4, zeigten, dass diese Marker, das Zytoplasma der lokalisiert Zellen differenziert und die Kennzeichnung mit DAPI-gekennzeichnete Kerne (Abbildung 1A) überlappt. Automatisierte Bildanalyse enthüllt einen 24,6 fachen Anstieg in % der FABP4 positive Zellen in der differenzierten Gruppe im ersten Durchgang Zellen im Vergleich zu 6,9 Falte Zunahme der späten Durchgang Zellen (Abbildung 1 b). Öl rot O Färbung auf Fett-Tröpfchen verteilt im ganzen Zytosol von differenzierten Zellen lokalisiert wurde, und die Kennzeichnung nur selten mit DAPI-gekennzeichnete Kerne überlappt; Es gibt jedoch aus Sichtprüfung, weniger Zellkerne Öl rot O Fett-Tröpfchen in den späten Durchgang Zellen im Vergleich zu frühen Übergang Zellen (Abbildung 2A) zugeordnet. Automatisierte Bildanalyse enthüllt einen 11.1 fachen Anstieg im Bereich der Öl rot O Flecken pro Zelle im ersten Durchgang Zellen und eine 53,9 Falte Zunahme Färbung Fläche pro Zelle in späten Durchgang Zellen (Abb. 2 b). Darstellung der beiden Flecken durchgeführt wurde, und dann quantifiziert mit Zelle Scoring (FABP4) oder Transfluor (Öl rot O) Modul in der Software (ergänzende Abbildung1, ergänzende Tabelle 2-5). Die Hochregulation des FABP4 Ausdrucks bestätigte Western-Blot Analyse (Abbildung 3, ergänzende Abbildung 5). Alle 3 Analysemethoden ergeben, dass frühe Passage ASCs höhere adipogenen Differenzierungspotenzial als späte Passage Zellen haben. Die adipogenen Differenzierung hatte keinen Einfluss auf die gesamte Zellzahl pro Bohrloch (ergänzende Abbildung2, 3). Die Kerne Größe der FABP4-positiven differenzierte Zellen war jedoch deutlich kleiner als Kontrollzellen für späte Passage ASC (ergänzende Abbildung 3).
Wir demonstriert, wie Zellen in Kultur ausgebaut waren, oder passagiert, den Anteil der Zellen in der Kultur der adipogenen Differenzierung verringerte, im Einklang mit bereits veröffentlichten Daten11fähig. Es ist wichtig zu beachten, dass Faktoren wie Alter, Body-mass-Index oder vorherige Krankengeschichte12 könnte nicht für die in dieser Studie kontrolliert und wahrscheinlich dazu, die Variabilität zwischen verschiedenen Spender Proben (ergänzende Tabelle1 beigetragen).
Abbildung 1 : FABP4 Immunolabelling zeigt, dass frühe Passage Zellen größere Differenzierungspotenzial als späteren Durchgang Zellen haben. (A) repräsentative Bilder der frühen und späten Passage, Kontrolle und differenzierten Zellen beschriftet mit DAPI (nukleare Fleck) und FABP4 werden neben zusammenführen und Segmentierung Bilder gezeigt. Die Segmentierung, die Anzeige von Bildern differenzierte Zellen mit einem grünen Overlay und undifferenzierte Zellen mit einer roten Überlagerung. (B) eine signifikante Zunahme FABP4 mit dem Ausdruck Zellen wurde mit adipogenen Differenzierung in frühe und späte Passage Zellen beobachtet, jedoch Anfang Passage Zellen demonstriert deutlich stärkeren Anstieg der Differenzierung als späte Passage Zellen (Mann-Whitney Testen * bezeichnet P < 0,05 und *** bezeichnet P < 0,001). Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Öl rot O Färbung zeigt, dass frühe Passage Zellen größere Differenzierungspotenzial als späteren Durchgang Zellen haben. (A) die repräsentative Bilder von DAPI (nukleare Fleck) und Öl rot O (grau, Lipid Droplet Fleck) sind neben zusammenführen und Segmentierung Bilder gezeigt. Die Segmentierung Bilder zeigen alle Kerne mit grünen Overlay und Öl rot O gefärbt Lipid Tröpfchen mit einer roten Überlagerung. (B) ein deutlichen Anstieg der Öl rot O Färbung Bereich wurde mit adipogenen Differenzierung beobachtet. Frühe Passage Zellen zeigte Großraum Öl rot O Flecken pro Zelle im Vergleich zu spät Durchgang Zellen. Bereich der Öl rot O Flecken pro Zelle (μm2) dient hier als ein Maß für die potenzielle adipogenen Differenzierung. Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM (Mann-Whitney-Test * bezeichnet P = < 0,05 und *** bezeichnet P = < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Western-Blot Analyse der FABP4 Proteinexpressionsgrad differenzierte früh und spät Passage ASCs. Semi-quantitative Analyse der optischen Dichte von FABP4 Bands in Relation zum Gesamt-Protein laden Steuerung, Beta-Actin (ACTB) zeigte, dass FABP4 Immunolabelling in frühe Passage und zu einem geringeren Grad spät Durchgang differenziert deutlich erhöht wurde Zellen. Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM (Mann-Whitney-Test * bezeichnet P = < 0,05 und *** bezeichnet P = < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Ziel-antigen | Isotype (Klon) | Arten | Verdünnung |
| FABP4 | Polyklonale | Kaninchen | 1: 100 |
Tabelle 1: Primärantikörper
| Ausrichtung auf Antikörper | Fluorophor-label | Arten | Verdünnung |
| Kaninchen-IgG | Alexa Fluor 488 | Ziege | 1: 200 |
Tabelle 2: Sekundäre Antikörper
Ergänzende Abbildung1: Überblick über das virtuelle Bild Analyseumgebung. Die gefärbten Zellen wurden abgebildet mit einem automatisierten, Hochdurchsatz-fluoreszierende Mikroskop Quelle der Befangenheit zu vermeiden. Bilder wurden aufgenommen mit ImageXpress Micro XLS, direkt in der MDCStore Data Manager-Datenbank gespeichert und zum Anzeigen durch virtuelle Desktop-Verbindungen, die Benutzer verwenden, zu optimieren und ihre spezifische Analyse Prüfparameter verfügbar gemacht. Bilder wurden mit einer speziellen "Autorun" analysiert, die mehrere verschiedene Benutzer "Arbeitsplätze" an die Autorun-Warteschlange senden können. Benutzer können ihre Daten über die virtuelle Instanz abrufen, wenn Sie ihre "Arbeit" abgeschlossen haben. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung2: Vergleich der insgesamt Zellenzahl pro Bohrloch des Steuerelements und differenzierte Brunnen für frühe und späte Passage ASC mit FABP4 gebeizt Platte. Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Steuerung und differenzierten Zellen für frühe und späte Passage ASC. Es gab mehr Zellen pro Bohrloch für frühe Passage Zellen im Vergleich zu spät Durchgang Zellen. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 3: Vergleich der insgesamt Zellenzahl pro Bohrloch des Steuerelements und differenzierte Brunnen für frühe und späte Passage ASC mit Öl rot O gebeizt Platte. Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Steuerung und differenzierten Zellen für frühe und späte Passage ASC. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 4: bei späteren Passagen hatte differenzierte Zellen, die FABP4 positiv waren deutlich kleineren Kerne Bereich als Zellen im Kontroll-Vertiefungen. Im ersten Durchgang gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied im Bereich der Kerne zwischen Kontrolle und differenzierte Zellen. Die angezeigten Daten sind im Durchschnitt über frühe Passage (p4; n = 8) oder späten Passage (p10; n = 4) Spender Proben, ± SEM (ungepaarten t Test *** bezeichnet P = < 0,001). Mittelwert ± SEM werden angezeigt.) Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Abbildung 5: Bilder der Western-blot Gele. Rot-Kanal zeigt Beta-Actin. Grün-Kanal zeigt FABP4 Immunolabelling. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Tabelle1: klinisch-Informationen der Spender Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Imaging-Einstellungen (FABP4) Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle3: Imaging-Einstellungen (Öl rot O) Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 4: Tabelle der verwendeten Parameter (FABP4). Zelle-Scoring-Modul. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 5: Tabelle der verwendeten Parameter (Öl rot O). Trans-Fluor-Modul. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Dieses Papier zeigt den nutzen und die Vorteile des FABP4 Immunolabelling genau zu erkennen und quantifizieren Reifen Adipozyten mesenchymaler Stromazellen Zellen abgeleitet. FABP4 ist in der Lage, Änderungen im Ausdruck einer Linie spezifisches Protein3,4,5 in Reifen Adipozyten, im Gegensatz zu anderen häufig Farbstoffe verwendet welches Label makromolekularen13,14 wechselt zu erkennen wie Öl rot O15, Nil rot16 und Sudan Schwarz17. FABP4 Immunolabelling ermöglicht eine Visualisierung und Analyse der Veränderungen in der zellulären Morphologie. Dies ist ein markanter Vorteil gegenüber zuvor beschriebenen Methoden verwenden quantitative reverse Transkription PCR (RT-qPCR), die Veränderungen auf der Ebene der Abschrift ohne jede Visualisierung5,18,19 analysiert ,20oder Durchflusszytometrie, die Zellen in Suspension20oder Western Blot-das erfordert erfordert Zellen lysiert werden, um Protein19,20zu isolieren. FABP4 Immunolabelling ist stabil in festen Zellen, nicht auslaufen in Lösung und wird eine cytosolische Protein als eine anhaftende Monolage von Zellen, gekennzeichnet mit dem Kern, so dass für einfache Visualisierung und Genauigkeit in der automatisierten Analyse hinzugefügt überlappen.
High-Content-Screening ist vorteilhaft, weil es schnell, präzise, reproduzierbare und Objektiv ist. Es bietet eine Plattform für kosteneffektive Nutzung von Reagenzien und Forscher Zeit, da Bildaufnahme und Analyse minimale manuelle Manipulation erfordern und verlassen Sie sich auf die automatische Verarbeitung des Instruments. Mehrere Faktoren wurden identifiziert als entscheidend für die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der High-Content-Screening Tests31. Die Quantifizierung von Antigen Ausdruck stützt sich auf die Bildqualität. Für erfolgreiche Bildanalyse, Bilder von jedem Kanal pro Bohrloch müssen in den Mittelpunkt rücken und fallen in eine optimale Dynamikbereich für Grauwerte (Auto setzen Einstellungen sind ideal). Aus der Fokus oder gesättigte Bilder zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Einige möglichen Einschränkungen der in diesem Artikel beschriebenen Methoden sind die folgenden. Die Forderung nach spezialisierten imaging Equipment und Analyse-Software. Zwar nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels, alternative open-Source-Software-Optionen (z. B. ImageJ32,33, Fidschi34, CellProfiler32,35) lässt sich ähnliches Bild Segmentierung durchzuführen Aufgaben; Allerdings erfordern sie die Fähigkeiten, um entweder herunterladen und online verfügbaren Makros anpassen oder Schreiben von Makros/Befehle für ihre spezifische Analyse-Pipelines. Alle automatisierten bildgebende Analyse Rohrleitungen inhärent ist ein Maß von Hintergrundgeräuschen. Dies kann weitgehend zugeschrieben werden Schmutz, schlechte Bild Qualität oder Analyse Fehler, unter Betonung der Notwendigkeit für sorgfältige Vorbereitung und sorgfältige Aufstellung der Bildverarbeitung und Analyse-Plattform. Das FABP4-Label bei Mäusen ist gefunden worden, um undifferenzierte Vorläuferzellen30zu erkennen; während die Steuerelemente in dieser Studie (bestehen aus undifferenzierten Zellen) sind frei von bestimmten FABP4 Färbung. Diese unzureichende punktet die Notwendigkeit der Überprüfung FABP4 Ausdruck undifferenzierten Stammväter in jedem biologischen Kontext, wo die Probe eingesetzt wird.
Um gültige Vergleiche zwischen den FABP4 Kennzeichnung und Öl rot O Färbung, die Ausgabe-Messungen von Bildanalyse benötigt, um biologisch relevant sein. Infolgedessen wurde die Messung, '% positive Zellen' für FABP4, und "Raum der Flecken pro Zelle" wurde verwendet für Öl rot O. Es ist bemerkenswert, dass die Maßnahme "% positive Zellen" nicht, für Öl rot O Zellen in unserer Studie gekennzeichnet verwendet wurde, denn es nicht möglich war, die gekennzeichneten fetten-Tröpfchen genau einem bestimmten Kern zuschreiben; die fetten-Tröpfchen waren sehr unterschiedlich in Größe, Anzahl und Verteilung über den Zellkörper und nur selten mit dem Kern überlappt. Öl rot O Färbung Variabilität besteht zwischen Zellen aus verschiedenen Gewebe Quellen; während die % positive Zellen Maßnahme war nicht angemessen für die aktuelle Studie, eine andere Gruppe hat es erfolgreich eingesetzt zur Quantifizierung Adipozyten abgeleitet menschliche Drüse Stammzellen22 wo erschien die Öl rot O-Färbung, als einen großen dicken Tropfen die erstreckte der Zytoplasma und überlappende mit Kernen und förderlichen Daten als % positive Zellen präsentiert werden.
Im Gegensatz dazu ist die Morphologie des FABP4 Immunolabelling konsistent in Adipozyten abgeleitet aus einer Palette von verschiedenen Gewebe Quellen23,24,25. Die Fähigkeit, den Anteil der Zellen innerhalb einer Kultur, die in der Lage, der Differenzierung zu quantifizieren hat eine Reihe von Anwendungen. Adulter mesenchymale Stromazellen Zellen halten bedeutende Versprechen für ein breites Spektrum von therapeutischen Anwendungen. Eine wichtige Frage, die mit klinischen Übersetzung entstanden ist die inhärente Variabilität in der Fähigkeit dieser Zellen zwischen Patienten26, zwischen Standorten der Isolierung27,28und zwischen Methoden zur Isolierung12 und Ausbau der Zelle Zahlen12 für den therapeutischen Einsatz. Es hat sich bisher gezeigt, dass Kulturen der Stromazellen adhärente Zellen sind häufig heterogen, mit einigen Zellen in der Lage, Differenzierung und einige nicht 12,17 als unsere FABP4 Assay für ASC Kulturen zeigt. Wie diese Tests, kombiniert mit Anreicherung Techniken, hilft Sub-Populationen innerhalb der heterogenen Kulturen in der Lage, Geschlecht-spezifische Differenzierung zu identifizieren. Mit einem standardisierten, quantifizierbaren Assay wie dieser FABP4-Assay, bietet eine einfache Methode für den Vergleich zwischen all diese Variablen und das Potenzial, therapeutische Ergebnisse innerhalb und zwischen den klinischen Studien zu bewerten.
Die Quantifizierung von FABP4 in einer teilautomatisierten Mode ermöglicht Objektivität und Reproduzierbarkeit in der Analyse über viele Spender Fällen und Proben. Außerdem wie die Bezeichnung zytoplasmatischen ist, es kann zur Hypertrophie (Vergrößerung des Adipocyte Größe) analysieren neben Hyperplasie (Zunahme Adipocyte), eine Auszeichnung, die von erheblicher Bedeutung in der Adipositas-Forschung, ist wo Hypertrophie ist stark verbunden mit adipösen Dysfunktion bei übergewichtigen Personen21. Die Adipositas-Epidemie hat eine erhebliche Menge an Interesse an der Ermittlung von Drogen in der Lage, Steuerung von Lipid-Lagerung angespornt. Dieser FABP4-Assay bietet auch eine einfache Ausgabe für das screening von Tausenden von Verbindungen für ihre Fähigkeit, Lipid-Ansammlung zu hemmen.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass die Geldgeber für das Fettgewebe und die Forschung Profis sammeln und uns zur Verfügung stellen dieser Ressource für Forschungszwecke. Wir würden gerne anerkennen, finanzielle Unterstützung von Allergan. Wir sind auch dankbar für die University of Auckland, Fakultät der medizinischen und Gesundheit Wissenschaften Performance basierte Forschungsfonds für die Finanzierung der Kosten für Videoing und Bearbeitung für die Einreichung der in diesem Artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
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