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Biology

एक वंश विशिष्ट मार्कर के साथ Mesenchymal कोशिका Adipogenic विभेदक क्षमता का विज़ुअलाइज़ेशन और ठहराव

Published: March 31, 2018 doi: 10.3791/57153
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 4,5, 1, 1,6, 1,7
1School of Biological Sciences, The University of Auckland, 2Research School of Biology, The Australian National University, 3Auckland Cancer Society Research Centre, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 4Department of Plastic Surgery, Counties Manukau District Health Board, 5Department of Surgery, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 6Biomedical Imaging Research Unit, Faculty of Medical and Health Sciences, The University of Auckland, 7Maurice Wilkins Centre, The University of Auckland

Summary

adipogenic विभेद का आकलन करने के पारंपरिक तरीकों सस्ते और प्रयोग करने में आसान हैं, लेकिन जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए विशिष्ट नहीं हैं । हम परिपक्व adipocytes में एक वंश विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर mesenchymal कोशिका भेदभाव यों तो एक परख विकसित की है । इस परख बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक चिकित्सा में विविध आवेदन किया है ।

Abstract

कई रंजक adipocytes में mesenchymal कोशिकाओं के भेदभाव का पता लगाने में उपयोग के लिए वर्तमान में उपलब्ध हैं । इस तरह के तेल लाल ओ के रूप में रंजक, सस्ते, उपयोग करने के लिए आसान है और व्यापक रूप से mesenchymal कोशिकाओं की adipogenic क्षमता का विश्लेषण प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता है । हालांकि, वे जीन प्रतिलेखन में परिवर्तन करने के लिए विशिष्ट नहीं हैं । हम एक जीन विशेष भेदभाव परख विकसित किया है विश्लेषण जब एक mesenchymal सेल एक adipogenic वंश को अपनी किस्मत बदल गया है । इंयूनो-फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन के खिलाफ लेबलिंग-4 (FABP4), adipogenic भेदभाव के एक वंश-विशिष्ट मार्कर, सक्षम दृश्य और विभेदित कोशिकाओं के ठहराव । एक 96 अच्छी तरह से microplate प्रारूप में mesenchymal कोशिकाओं के adipogenic भिंनता क्षमता यों तो आवेदनों की एक संख्या के लिए निहितार्थ का वादा किया है की क्षमता । नैदानिक परीक्षणों के सैकड़ों वयस्क mesenchymal stromal कोशिकाओं का उपयोग शामिल है और यह वर्तमान में चिकित्सीय परिणामों के भीतर और विशेष रूप से इस तरह के नैदानिक परीक्षणों के बीच सहसंबंधी बनाना मुश्किल है । यह सरल उच्च प्रवाह FABP4 परख रोगी-व्युत्पंन कोशिकाओं की भिंनता क्षमता का आकलन करने के लिए एक मात्रात्मक परख प्रदान करता है और अलग अलगाव और विस्तार के तरीकों की तुलना के लिए एक मजबूत उपकरण है । यह विशेष रूप से mesenchymal सेल उत्पादों में रोगियों के लिए प्रशासित किया जा रहा कोशिकाओं के विविधता की बढ़ती मान्यता को देखते हुए महत्वपूर्ण है । परख भी उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग में संभावित उपयोगिता है, विशेष रूप से मोटापा और पूर्व मधुमेह अनुसंधान में ।

Introduction

एक प्रमुख सेलुलर थेरेपी (ISCT) के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा स्थापित आवश्यकताओं के लिए एक multipotent mesenchymal stromal सेल को परिभाषित है कि कोशिकाओं को adipogenic, osteogenic और chondrogenic वंश में अंतर करने की क्षमता होनी चाहिए 1. इन तीन प्रजातियों में भेदभाव को मापने के पारंपरिक तरीकों macromolecular रासायनिक रंजक1का उपयोग कर उत्पादों का पता लगाने पर भरोसा करते हैं । इस तरह के तेल लाल ओ के रूप में रंजक (जो कोशिकाओं है कि adipogenesis आया है में मोटी बूंदों दाग), सस्ते और प्रयोग करने में आसान कर रहे हैं; लेकिन वे जीन अभिव्यक्ति में विशिष्ट परिवर्तन है कि जब mesenchymal कोशिकाओं को प्रत्येक संबंधित वंश2में अंतर का पता लगाने में विफल । यहां, हम एक भेदभाव परख जो quantifies एक adipogenic वंश के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति विशिष्ट मार्कर, फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन-4 (FABP4)3,4,5विकसित की है । FABP4 शुरू में murine 3T3-L1 adipocytes में पाया गया था3 और बाद में मानव चमड़े के नीचे वसा ऊतक6में व्यक्त किया जा करने के लिए खोज की थी । यह एक cytosolic प्रोटीन है, जो एक निगरानी के रूप में कार्य करता है के लिए कोशिकाओं द्वारा फैटी एसिड को ग्रहण गाइड और lipolysis की प्रक्रिया में शामिल है4।

अग्रदूतों अंतर परख के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं वसा व्युत्पंन mesenchymal stromal कोशिकाओं (ASCs)7,8थे । ASCs अस्थि मज्जा के साथ कई गुणों का हिस्सा-व्युत्पंन mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (बीएम-MSCs), एक प्रमुख mesenchymal वयस्कों में स्टेम सेल जनसंख्या8,9। ASCs एक नैदानिक आवेदन में बीएम-MSCs पर कई लाभ प्रदान करते हैं, कोशिकाओं की अधिक से अधिक उपज के रूप में अधिक आसानी से सुलभ ऊतक स्रोतों से अलग किया जा सकता है8,9. एक अलग सेल जनसंख्या के लिए कुछ मानदंडों को पूरा करने के लिए ASCs के रूप में परिभाषित की जरूरत है । सबसे पहले, वे मानक संस्कृति की स्थिति में प्लास्टिक ऊतक संस्कृति वाहिकाओं के पालन दिखाना चाहिए1। उंहें विशिष्ट सरफ़ेस antigen व्यंजक1भी दिखाना आवश्यक है । अनकल्चर्ड ASCs CD34, CD73, CD90, CD105 की कम अभिव्यक्ति और CD45 और एचएलए की नकारात्मक अभिव्यक्ति की सकारात्मक सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति की विशेषता है-डॉ10। 28 दिनों के लिए प्लास्टिक पर संवर्धन द्वारा शुद्ध ASCs (अनुयाई शुद्ध ASCs) CD73, CD90 और CD105 और CD34, CD45 और एचएलए की नकारात्मक अभिव्यक्ति की सकारात्मक अभिव्यक्ति दिखाने के लिए-10डॉ । अंत में, कोशिकाओं को विभिंन वंश1,7,8में अंतर करने की क्षमता बनाए रखने चाहिए ।

Adipogenic भेदभाव प्रोटोकॉल अंय adipocyte वंश जीन के बीच FABP4 अभिव्यक्ति के हड़ताली विनियमन प्रेरित है, तो हम immunochemistry का इस्तेमाल किया कोशिकाओं के भीतर FABP4 प्रोटीन कल्पना, और फिर एक सेल स्तर पर quantified FABP4 अभिव्यक्ति एक स्वचालित फ्लोरोसेंट उच्च सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करना । यह विधि पारंपरिक रंजक से अधिक लाभप्रद है क्योंकि यह adipocyte-वंश विभेद के अत्यधिक विशिष्ट पुष्टि को सक्षम करता है । इस तरह के जीन विशिष्ट वंश उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तरीकों के साथ संयुक्त परख भी एक विषम कोशिका तैयारी है कि एक विशेष वंश नीचे विभेद करने में सक्षम है भीतर कोशिकाओं के अनुपात के ठहराव सक्षम करें । हमारे अध्ययन में हम सेल संस्कृति के बाद हौसले से अलग ASCs के adipogenic भेदभाव की क्षमता की हानि की पुष्टि करने के लिए FABP4 परख का इस्तेमाल किया ।

Protocol

1. भेदभाव परख के लिए ASCs की तैयारी

  1. ऊतक संस्कृति रिएजेंट तैयार करने और एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में रहते कोशिकाओं को संभाल ।
  2. ए0 माध्यम तैयार करें: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और हैम के f12 मध्यम (DMEM/f12), 1x glutamax, 1x पेनिसिलिन/streptomycin ।
  3. पूर्ण ए एस सी मध्यम तैयार: DMEM/F12, 1x glutamax, 1x पेनिसिलिन/streptomycin, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम ।
  4. उपयोग अनुयाई शुद्ध ASCs, एक T75 संस्कृति कुप्पी में विस्तार किया । प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS)10का उपयोग करके ASCs की शुद्धता की पुष्टि करें ।
  5. T75 संस्कृति कुप्पी से सभी मध्यम निकालकर और सेल पृथक्करण एंजाइम के 2 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं को अलग करें ।
  6. मशीन (37 ° c, humidified, 5% कं2) 5-10 मिनट के लिए में संस्कृति कुप्पी छोड़ दें । संस्कृति की कुप्पी से बाहर ले मशीन और दृढ़ता से कुप्पी की ओर नल । जांच करें कि क्या कोशिकाओं एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग संस्कृति कुप्पी से अलग है ।
  7. एक T75 संस्कृति कुप्पी के लिए ए0 मध्यम के 13 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. 5 मिनट के लिए 400 x g पर एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और केंद्रापसारक में 15 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
  9. supernatant त्यागें और सेल गोली पूर्ण ए एस सी मध्यम के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित ।
  10. hemocytometer का उपयोग करके कोई कक्ष संख्या निष्पादित करें ।
  11. सेल निलंबन के लिए 25,000 कोशिकाओं की एक एकाग्रता को पतला एमएल-1 में पूर्ण ए एस सी मध्यम ।
  12. 96 अच्छी तरह से प्लेट के सभी परिधि कुओं के लिए ए0 मध्यम के 200 µ एल जोड़ें (फ्लैट नीचे) । इससे केंद्र में कोशिकाओं से युक्त कुओं का वाष्पीकरण दर कम हो जाता है.
  13. एक microwell प्लेट के लिए सेल निलंबन के 200 µ एल स्थानांतरण 5 एक्स 103 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक अंतिम सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए । चार कुओं प्रत्येक उपचार समूह (तपसिल तकनीकी दोहराता है और immunocytochemistry (आईसीसी) के लिए कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण) के लिए आवश्यक हैं ।
  14. microwell प्लेट को मशीन में छोड़ें (37 ° c, humidified, 5% CO2) तक कोशिकाओं तक पहुंचने संगम (3-4 दिन) ।

2. ASCs के भेदभाव उत्प्रेरण

  1. 1 µ एम dexamethasome, 10 µ एम इंसुलिन और 200 µ एम indomethacin के साथ पूर्ण ए एस सी मध्यम पूरक द्वारा adipogenic भेदभाव मध्यम तैयार करें । पूर्ण भेदभाव मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए स्थिर है, तो केवल के रूप में 1 परख के लिए आवश्यक बना । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और जब आवश्यक गर्मी पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक aliquot ।
  2. 3-4 दिनों के बाद, microwell थाली से बाहर ले मशीन और adipogenic भेदभाव मध्यम के साथ संस्कृति माध्यम के आधे की जगह ।
  3. हर 2-3 दिन एक मध्यम परिवर्तन करें ।
    नोट: इष्टतम adipogenic विभेद के लिए 14 दिनों की संस्कृति की आवश्यकता है । विभेदित कोशिकाओं पारंपरिक डाई आधारित दाग और जीन विशिष्ट दाग का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं ।

3. भेदभाव के लिए धुंधला-पारंपरिक डाई आधारित दाग

  1. पंजाबियों के साथ 16% formaldehyde कमजोर द्वारा 4% formaldehyde समाधान तैयार करें । केवल प्रयोग के लिए आवश्यक राशि और कसकर एक केंद्रापसारक ट्यूब में बंद की दुकान पतला ।
    सावधानी: Formaldehyde एक संभावित यलो है और साँस लेने पर नाक, गले और फेफड़ों में जलन पैदा कर सकता है. एक धुएं डाकू में formaldehyde से संबंधित सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करते हैं ।
  2. isopropanol के 100 मिलीलीटर में 300 मिलीग्राम भंग करके तेल लाल ओ स्टॉक समाधान तैयार करें ।
  3. microwell थाली से बाहर ले मशीन । एक गैर बाँझ वातावरण में निम्न चरणों का पालन किया जा सकता है ।
  4. कुओं से सभी मध्यम निकालें और 30 मिनट के लिए 4% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक ।
  5. मशीन समय के दौरान, तेल लाल ओ काम समाधान तैयार करते हैं । काम समाधान 4 भागों आसुत जल (डीएच2o) के साथ 6 भागों तेल लाल हे शेयर शामिल हैं । अच्छी तरह से मिश्रण और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं, 0.2 µm फिल्टर इकाई का उपयोग छानने से पहले । काम समाधान केवल 2 एच के लिए स्थिर है ।
  6. कुओं से pipetting करके सभी formaldehyde को हटा दें.
  7. 60% isopropanol के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और आगे बढ़ने से पहले कुओं को पूरी तरह सुखा दें ।
  8. तेल लाल ओ के 50 µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से काम कर समाधान और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  9. तेल लाल हे समाधान निकालें और तुरंत डीएच2o. धो के साथ डीएच2o 4 बार प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखने से पहले जोड़ें ।

4. भेदभाव के लिए धुंधला-जीन विशिष्ट एंटीबॉडी

  1. NaCl के 80 ग्राम, KCl के 2 ग्राम और Tris बेस के 30 g को डीएच2O (pH 8) के 1 L को भंग करके Tris बफ़र्ड खारा (टीबीएस) के शेयर समाधान तैयार करें । कमजोर द्वारा काम समाधान तैयार 1:10 कमरे के तापमान पर डीएच2ओ स्टोर का उपयोग कर ।
  2. तैयार immunobuffer (आईबी) (1% टीबीएस में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) । 4 डिग्री सेल्सियस पर तारीख और दुकान के साथ 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब लेबल । आईबी द्वारा किए गए दिनांक से 1 सप्ताह के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  3. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 0.5 ग्राम कैसिइन और ०.१९५ ग्राम सोडियम azide के 200 मिलीलीटर में भंग करके 0.25% कैसिइन अवरोधक तैयार करें । पूरी तरह से रात भर सरगर्मी से सामग्री को भंग । 15 मिलीलीटर में Aliquot ट्यूबों और एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर । गल कैसिइन समाधान 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  4. प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर टीबीएस. Store में कमजोर शेयर DAPI 1:200 द्वारा DAPI सॉल्यूशन तैयार करें ।
  5. बाँझ पंजाबियों में thimerosal भंग करके शेयर thimerosal सॉल्यूशन (10 मिलीग्राम एमएल-1) तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान और उपयोग के लिए 0.4 मिलीग्राम एमएल-1 के लिए उचित मात्रा में पतला ।
  6. फिक्स और permeabilize कोशिकाओं बर्फ के साथ ठंडा मेथनॉल (96 अच्छी प्लेट) के लिए 5 min. reवॉश कोशिकाओं के साथ एक बार 200 µ टीबीएस के एल.
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.25% कैसिइन के 50 µ एल के साथ ब्लॉक और टीबीएस के साथ एक बार धो लें ।
  8. आईबी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 µ एल जोड़ें (एंटीबॉडी विवरण के लिए तालिका 1 देखें) और ढक्कन के साथ मशीन 1 एच के लिए बंद कर दिया.
  9. टीबीएस के 200 µ एल के साथ एक बार धो, और फिर कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए टीबीएस के साथ 3 बार ।
  10. आईबी में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 µ एल जोड़ें (एंटीबॉडी विवरण के लिए तालिका 2 देखें) प्रत्येक में 1:2000 DAPI के साथ, ढक्कन के साथ मशीन 1 एच के लिए बंद कर दिया. फोटो-ब्लीचिंग को रोकने के लिए पन्नी के साथ प्लेट को ढक कर रखें.
  11. टीबीएस के साथ एक बार धो, और फिर दो बार टीबीएस के साथ 15 मिनट के लिए कोमल कमाल के साथ ।
  12. सभी टीबीएस निकालें और thimerosal समाधान के 200 µ l को जोड़ें ।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लेट, प्रकाश से इमेजिंग तक संरक्षित ।

5. एक उच्च प्रवाह माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग कोशिकाओं

  1. जीन विशिष्ट एंटीबॉडी और fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं का विश्लेषण (इम्यूनोफ्लोरेसेंस) एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोस्कोप के साथ सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित का उपयोग कर ।
  2. माइक्रोस्कोप चरण में microwell प्लेट लोड । प्लेट अधिग्रहण नियंत्रण पर, मध्यम दूरी आवर्धन (10x उद्देश्य लेंस) पर छवि का चयन करें । सुनिश्चित करें कि छवियां प्रत्येक अच्छी तरह से केंद्र से ली गई हैं, प्रत्येक साइट के बीच 50 µm रिक्ति के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक कक्ष दो निकटवर्ती फ़ील्ड्स में प्रकट नहीं होता है ।
  3. छवि के लिए कुओं का चयन करें ।
  4. उपयुक्त चैनल संयोजन, एक्सपोज़र समय और z-ऑफ़सेट पैरामीटर्स का चयन करें । प्रत्येक फ़िल्टर (अनुपूरक तालिका 2) की अधिक विस्तृत जानकारी के लिए तालिका 3 देखें ।
  5. अधिग्रहण जादूगर का उपयोग परख प्राप्त (छवियां स्वचालित रूप से डेटाबेस सर्वर पर संग्रहीत हैं) ।
  6. तेल लाल ओ (अनुपूरक तालिका 3) के साथ दाग प्लेटें प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक चैनल संयोजन का प्रयोग करें ।

6. विश्लेषण अधिग्रहीत छवि

नोट: डेटाबेस सर्वर के लिए दूरदराज के उपयोग की छवियों का अधिग्रहण और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग के त्वरित और आसान मूल्यांकन सक्षम बनाता है ।

  1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर कक्ष स्कोरिंग मॉड्यूल खोलें ।
  2. DAPI चैनल (नाभिकीय मार्कर) और आकार और संकेत तीव्रता ऊपर पृष्ठभूमि के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित मापदंडों के साथ ब्याज की खंड नाभिक का उपयोग कर सेल नाभिक का पता लगाएं ।
  3. FITC चैनल का उपयोग कर FABP4 संकेत का पता लगाएं । प्रत्येक छवि में सभी FABP4 धनात्मक क्षेत्रों का चयन करने के लिए आकार और पृष्ठभूमि के ऊपर संकेत तीव्रता के लिए पैरामीटर परिभाषित उपयोगकर्ता के साथ खंड विभेदित कोशिकाओं ।
  4. विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर खुला Transfluor मॉड्यूल तेल लाल ओ के साथ सना हुआ प्लेटों का विश्लेषण करने के लिए ।
  5. आकार और तेल लाल हे दाग क्षेत्रों के ' गड्ढ़े ' के रूप में तीव्रता निर्दिष्ट करें ।

Representative Results

इस अध्ययन में, 3 विभिन्न तरीकों के साथ ASCs की adipogenic विभेदक क्षमता को मापा गया । FABP4 के Immunofluorescent ्र से पता चला कि यह मार्कर विभेदित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य को स्थानीय है, और DAPI-बला नाभिक (figure1a) के साथ ्र छा जाता है । स्वचालित छवि विश्लेषण से पता चला एक २४.६ जल्दी बीतने कोशिकाओं में विभेदित समूह में FABP4 सकारात्मक कोशिकाओं के% में वृद्धि की तुलना 6.9 देर से यात्रा कोशिकाओं में वृद्धि गुना (चित्र 1b) । तेल लाल ओ धुंधला वसा बूंदों के लिए स्थानीयकृत था विभेदित कोशिकाओं के cytosol भर में फैलाया, और लेबलिंग शायद ही कभी DAPI के साथ छा-बला नाभिक; हालांकि दृश्य निरीक्षण से, कम सेल नाभिक जल्दी बीतने कोशिकाओं की तुलना में देर बीतने कोशिकाओं में तेल लाल ओ वसा बूंदों के साथ जुड़े रहे हैं (चित्रा 2a). स्वचालित छवि विश्लेषण से पता चला एक 11.1 तेल लाल के क्षेत्र में गुना वृद्धि ओ जल्दी बीतने कोशिकाओं में सेल प्रति धुंधला और एक ५३.९ देर से बीतने के कोशिकाओं में सेल के प्रति धुंधला क्षेत्र में वृद्धि गुना (चित्रा बीसी). दोनों दाग की इमेजिंग प्रदर्शन किया गया था, और फिर सेल स्कोरिंग (FABP4) या Transfluor (तेल लाल ओ) सॉफ्टवेयर में मॉड्यूल का उपयोग कर quantified (अनुपूरक आंकड़ा 1, अनुपूरक तालिका 2-5) । FABP4 अभिव्यक्ति के विनियमन पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 3, अनुपूरक चित्रा 5) द्वारा की पुष्टि की थी । सभी 3 विश्लेषण तरीकों से पता चला कि जल्दी बीतने ASCs उच्च adipogenic देर बीतने कोशिकाओं से अंतर क्षमता है । adipogenic भेदभाव कुल सेल संख्या के प्रति अच्छी तरह से प्रभावित नहीं हुआ (अनुपूरक आंकड़ा 2, 3) । हालांकि, FABP4-सकारात्मक विभेदित कोशिकाओं के नाभिक आकार काफी देर से पारित होने के लिए नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में छोटा था ASCs केवल (अनुपूरक आंकड़ा 3) ।

हमने दिखाया है कि के रूप में कोशिकाओं को संस्कृति में विस्तार किया गया, या पारित, adipogenic भेदभाव के लिए सक्षम संस्कृति के भीतर कोशिकाओं का प्रतिशत कम, पहले से प्रकाशित डेटा के अनुरूप11। यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि उम्र के रूप में कारकों, शरीर द्रव्यमान सूचकांक या पिछले चिकित्सा इतिहास12 इस अध्ययन में के लिए नियंत्रित नहीं किया जा सकता है और संभावना विभिन्न दाता नमूने (अनुपूरक तालिका 1) के बीच मनाया परिवर्तनशीलता के लिए योगदान दिया.

Figure 1
चित्र 1 : FABP4 immunolabelling से पता चलता है कि जल्दी यात्रा कोशिकाओं को अधिक से अधिक अंतर बाद में पारित कोशिकाओं की क्षमता है । एक) जल्दी और देर बीतने के प्रतिनिधि छवियों, नियंत्रण और विभेदित कोशिकाओं DAPI के साथ लेबल (परमाणु दाग) और FABP4 विलय और विभाजन छवियों के साथ दिखाया जाता है । विभाजन छवियां एक हरे रंग के ओवरले और एक लाल ओवरले के साथ विभेदित कोशिकाओं के साथ विभेदित कोशिकाओं को प्रदर्शित करती है । ख) FABP4 व्यक्त कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि जल्दी और देर से बीतने के लिए कोशिकाओं में adipogenic भेदभाव के साथ मनाया गया था, तथापि, जल्दी बीतने कोशिकाओं देर बीतने कोशिकाओं से भेदभाव में काफी अधिक वृद्धि का प्रदर्शन किया (मान Whitney परीक्षण * नोट p < 0.05 और * * * नोट p < 0.001) । दिखाया डेटा जल्दी बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : तेल लाल हे दाग से पता चलता है कि जल्दी यात्रा कोशिकाओं को अधिक से अधिक अंतर बाद में पारित कोशिकाओं की क्षमता है । क) DAPI (परमाणु दाग) और तेल लाल ओ (ग्रे, लिपिड छोटी बूंद दाग) के प्रतिनिधि छवियों विलय और विभाजन छवियों के साथ दिखाया जाता है । विभाजन छवियों को एक लाल ओवरले के साथ हरे ओवरले और तेल लाल हे सना हुआ लिपिड बूंदों के साथ सभी नाभिक चित्रण । ख) तेल लाल ओ धुंधला क्षेत्र में एक उल्लेखनीय वृद्धि adipogenic भेदभाव के साथ मनाया गया । जल्दी बीतने कोशिकाओं देर बीतने कोशिकाओं की तुलना में सेल प्रति तेल लाल ओ दाग के अधिक से अधिक क्षेत्र दिखाया । सेल (माइक्रोन2) प्रति तेल लाल ओ धुंधला के क्षेत्र यहां adipogenic विभेद क्षमता के एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है । दिखाया गया डेटा जल्दी बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM (मान Whitney test * renotes p = < 0.05 और * * * नोट p = < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : FABP4 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के पश्चिमी दाग विश्लेषण जल्दी और देर बीतने ASCs विभेदित । अर्द्ध कुल प्रोटीन लोड हो रहा है नियंत्रण के अनुपात के रूप में FABP4 बैंड के ऑप्टिकल घनत्व के मात्रात्मक विश्लेषण, बीटा actin (ACTB), पता चला है कि FABP4 immunolabelling काफी जल्दी बीतने में वृद्धि हुई थी और एक कम डिग्री देर से पारित विभेदित करने के लिए कोशिकाओं. दिखाया गया डेटा जल्दी बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM (मान Whitney test * renotes p = < 0.05 और * * * नोट p = < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लक्ष्य antigen Isotype (क्लोन) प्रजातियों पतलापन
FABP4 Polyclonal खरगोश 1:100

तालिका 1: प्राथमिक एंटीबॉडी

लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी Fluorophore लेबल प्रजातियों पतलापन
खरगोश आईजीजी Alexa fluoro 488 बकरी 1:200

तालिका 2: द्वितीयक एंटीबॉडी

अनुपूरक चित्रा 1: छवि विश्लेषण आभासी पर्यावरण का अवलोकन. सना हुआ कोशिकाओं को एक स्वचालित, उच्च-प्रवाह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए पूर्वाग्रह के किसी भी स्रोत से बचने imaged थे । छवियां ImageXpress माइक्रो XLS का उपयोग कर अधिग्रहीत, सीधे MDCStore डेटा प्रबंधक डेटाबेस को बचाया गया, और आभासी डेस्कटॉप कनेक्शन है, जो उपयोगकर्ताओं को अनुकूलित और उनके विशिष्ट विश्लेषण पैरामीटर परीक्षण का उपयोग के माध्यम से देखने के लिए उपलब्ध कराया । छवियां एक समर्पित ' स्वतः चलाएं ' आवृत्ति जो एकाधिक भिंन उपयोगकर्ताओं को स्वतः चलाएं पंक्ति में ' कार्य ' भेजने के लिए सक्षम बनाता है के साथ विश्लेषण किया गया । उपयोगकर्ताओं को अपने ' नौकरियां ' पूरा कर रहे है एक बार आभासी उदाहरण के माध्यम से अपने डेटा प्राप्त कर सकते हैं । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: नियंत्रण और जल्दी और देर बीतने ASCs के लिए विभेदित कुओं के प्रति अच्छी तरह से कुल सेल गिनती की तुलना, FABP4 दाग प्लेट का उपयोग कर । दिखाया गया डेटा प्रारंभिक बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM । दोनों जल्दी और देर बीतने ASCs के लिए नियंत्रण और विभेदित कोशिकाओं के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था । देर बीतने कोशिकाओं की तुलना में जल्दी बीतने कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से प्रति अधिक कोशिकाओं थे । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 3: जल्दी और देर बीतने ASCs के लिए नियंत्रण और विभेदित कुओं के प्रति अच्छी तरह से कुल सेल गिनती की तुलना, तेल लाल ओ दाग प्लेट का उपयोग कर । दिखाया गया डेटा प्रारंभिक बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM । दोनों जल्दी और देर बीतने ASCs के लिए नियंत्रण और विभेदित कोशिकाओं के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 4: बाद के मार्ग में, विभेदित कोशिकाओं है कि सकारात्मक FABP4 थे काफी छोटे नियंत्रण कुओं में कोशिकाओं की तुलना में नाभिक क्षेत्र । जल्दी बीतने में नियंत्रण और विभेदित कोशिकाओं के बीच नाभिक क्षेत्र में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं था । दिखाया गया डेटा जल्दी बीतने के पार औसत है (पी 4; एन = 8) या देर बीतने (p10; n = 4) दाता नमूने, ± SEM. (ख़राब t test. * * * नोट P = < 0.001) । मतलब ± SEM दिखाया जाता है.) इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 5: पश्चिमी ब्लाटर जैल की छवियां । लाल चैनल बीटा-actin दर्शाया गया है । ग्रीन चैनल में FABP4 immunolabelling को दर्शाया गया है. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: दानदाताओं की Clinicopathological जानकारी इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: इमेजिंग सेटिंग्स (FABP4) इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 3: इमेजिंग सेटिंग्स (तेल लाल O) इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 4: उपयोग किए गए विश्लेषण पैरामीटर्स की तालिका (FABP4). सेल स्कोरिंग मॉड्यूल । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 5: विश्लेषण पैरामीटर (तेल लाल हे) इस्तेमाल की मेज । ट्रांस Fluor मॉड्यूल । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह कागज उपयोगिता और FABP4 immunolabelling के लाभ को सही पता चलता है और परिपक्व mesenchymal stromal कोशिकाओं से व्युत्पंन adipocytes मात्रा बढ़ाता है दर्शाता है । FABP4 एक वंश विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है3,4,5 परिपक्व adipocytes में, अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया रंजक जो लेबल macromolecular परिवर्तन13,14 के विपरीत जैसे तेल लाल हे15, नील लाल16 और सूडान काले17। FABP4 immunolabelling दृश्य और सेलुलर आकृति विज्ञान में परिवर्तन के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । यह पहले वर्णित मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-qPCR) है कि किसी भी दृश्य के बिना प्रतिलिपि स्तर पर परिवर्तन का विश्लेषण करती है पर एक विशिष्ट लाभ है,18,19 ,20, या प्रवाह cytometry कि कोशिकाओं को निलंबन20, या पश्चिमी सोख्ता है कि कोशिकाओं को प्रोटीन19,20को अलग करने के लिए लीजड ड होने की आवश्यकता है में होना चाहिए । FABP4 immunolabelling तय कोशिकाओं में स्थिर है, समाधान में रिसाव नहीं है और एक cytosolic प्रोटीन होने के नाते जब कोशिकाओं की एक अनुयाई monolayer में लेबल, आसान दृश्य के लिए अनुमति नाभिक के साथ ओवरलैप और स्वचालित विश्लेषण में सटीकता जोड़ा जाएगा ।

उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग लाभप्रद है क्योंकि यह तेजी से, सटीक, reproducible और उद्देश्य है । यह एजेंट और शोधकर्ता समय की लागत प्रभावी उपयोग के लिए एक मंच प्रदान करता है, के बाद से छवि अधिग्रहण और विश्लेषण ंयूनतम मैनुअल हेरफेर की आवश्यकता है और साधन के स्वत: प्रसंस्करण पर निर्भर करते हैं । कई कारकों सटीकता और उच्च सामग्री जांच परख31के reproducibility के लिए महत्वपूर्ण के रूप में पहचान की गई । ठहराव antigen अभिव्यक्ति की छवि गुणवत्ता पर निर्भर करता है । सफल छवि विश्लेषण के लिए, एक अच्छी तरह से प्रति चैनल से छवियां ध्यान में होना चाहिए और भूरे रंग के मूल्यों के लिए एक इष्टतम गतिशील रेंज के भीतर गिर (ऑटो सेटिंग्स को बेनकाब आदर्श हैं) । ध्यान से या संतृप्त छवियों गलत परिणाम के लिए सीसा ।

इस आलेख में वर्णित विधियों की कुछ संभावित सीमाओं में निंन शामिल हैं । विशेष इमेजिंग उपकरण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए आवश्यकता । इस अनुच्छेद के दायरे के बाहर रहते हुए, वैकल्पिक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर विकल्प (उदाहरण के लिए, ImageJ32,33, फिजी34, CellProfiler32,35) समान छवि विभाजन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कार्य; हालांकि वे कौशल की आवश्यकता होती है या तो डाउनलोड और दर्जी ऑनलाइन उपलब्ध मैक्रोज़ या उनके विशिष्ट विश्लेषण पाइपलाइनों के लिए मैक्रोज़/आदेश लिखें । सभी स्वचालित इमेजिंग विश्लेषण पाइपलाइनों के लिए अंतर्निहित पृष्ठभूमि शोर का एक स्तर है । यह काफी हद तक मलबे के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, खराब छवि गुणवत्ता या विश्लेषण त्रुटि, सावधान नमूना तैयारी और सावधान स्थापित इमेजिंग और विश्लेषण मंच के लिए की जरूरत पर बल । चूहों में FABP4 लेबल में विभेदित progenitors का पता लगाने के लिए पाया गया है30; जबकि इस अध्ययन में नियंत्रण (जो विभेदित कोशिकाओं से मिलकर बनता है) विशिष्ट FABP4 धुंधला से रहित हैं । इस के तहत स्कोर प्रत्येक जैविक संदर्भ जहां परख कार्यरत है में विभेदित progenitors में FABP4 अभिव्यक्ति की जांच की आवश्यकता है ।

आदेश में FABP4 लेबलिंग और तेल लाल हे धुंधला के बीच वैध तुलना आकर्षित करने के लिए, छवि विश्लेषण से उत्पादन माप को जैविक रूप से प्रासंगिक होने की जरूरत है । नतीजतन, माप, '% सकारात्मक कोशिकाओं ' FABP4 के लिए इस्तेमाल किया गया था, और ' प्रति सेल धुंधला के क्षेत्र ' तेल लाल ओ के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह उल्लेखनीय है कि माप '% सकारात्मक कोशिकाओं ' हमारे अध्ययन में तेल लाल ओ लेबल वाले कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था क्योंकि यह लेबल वसा बूंदों सही करने के लिए एक दिया नाभिक को विशेषता के लिए संभव नहीं था; वसा बूंदें काफी आकार, संख्या और वितरण में सेल शरीर भर में और शायद ही कभी नाभिक के साथ छा विविध । तेल लाल हे धुंधला परिवर्तनशीलता विभिंन ऊतक स्रोतों से व्युत्पंन कोशिकाओं के बीच मौजूद है; जबकि% सकारात्मक कोशिकाओं को मापने के वर्तमान अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं था, एक और समूह यह प्रयोग किया जाता है सफलतापूर्वक मानव ग्रंथि स्टेम सेल22 से व्युत्पंन adipocytes जहां तेल लाल हे धुंधला एक बड़ी मोटी छोटी बूंद जो फैले के रूप में दिखाई कोशिका द्रव्य और नाभिक के साथ छा और सक्षम करने के लिए डेटा% सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में प्रस्तुत किया जाएगा ।

इसके विपरीत, FABP4 immunolabelling की आकृति विज्ञान विभिन्न ऊतक स्रोतों23,24,25की एक सीमा से व्युत्पंन adipocytes में संगत है. एक भिंनता में सक्षम संस्कृति के भीतर कोशिकाओं के अनुपात को यों तो क्षमता आवेदनों की एक संख्या है । वयस्क mesenchymal stromal कोशिकाओं चिकित्सकीय उपयोग करता है की एक विविध रेंज के लिए महत्वपूर्ण वादा पकड़ो । नैदानिक अनुवाद के साथ उत्पंन हुआ है एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि रोगियों के बीच इन कोशिकाओं की क्षमता में निहित परिवर्तनशीलता है26, अलगाव की साइटों के बीच27,28, और अलगाव के लिए तरीकों के बीच12 और चिकित्सीय उपयोग के लिए कक्ष संख्या12 का विस्तार । यह पहले से दिखाया गया है कि अनुयाई stromal कोशिकाओं की संस्कृतियों अक्सर विषम हैं, कुछ भिंनता के सक्षम कोशिकाओं के साथ और कुछ नहीं 12,17 के रूप में हमारे FABP4 परख ए एस सी संस्कृतियों के लिए प्रदर्शित करता है । इस तरह परख, संवर्धन तकनीक के साथ संयुक्त, मदद करेंगे उप की पहचान विषम वंश-विशिष्ट भेदभाव के सक्षम संस्कृतियों के भीतर आबादी । इस FABP4 परख के रूप में एक मानकीकृत, quantifiable परख होने इन सभी चर के बीच तुलना के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है, और के भीतर और नैदानिक परीक्षणों के बीच चिकित्सीय परिणामों का मूल्यांकन करने की क्षमता ।

एक अर्द्ध स्वचालित फैशन में FABP4 के ठहराव निष्पक्षता और कई दाता मामलों और नमूनों के पार विश्लेषण में reproducibility सक्षम बनाता है । इसके अलावा के रूप में लेबल cytoplasmic है, यह संभवतः अतिवृद्धि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (adipocyte आकार के इज़ाफ़ा) हाइपरप्लासिया के अलावा (adipocyte संख्या में वृद्धि), एक अंतर है कि मोटापा अनुसंधान में काफी महत्व का है, जहां अतिवृद्धि दृढ़ता से मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों में वसा शिथिलता के साथ जुड़ा हुआ है21. मोटापा महामारी प्रेरित लिपिड भंडारण को नियंत्रित करने में सक्षम दवाओं की पहचान करने में ब्याज की एक महत्वपूर्ण राशि है । इस FABP4 परख भी अपने लिपिड संचय को बाधित करने की क्षमता के लिए यौगिकों के हजारों स्क्रीनिंग के लिए एक सरल readout प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

हम वसा ऊतकों और अनुसंधान पेशेवरों जो इकट्ठा करने और अनुसंधान के उपयोग के लिए हमारे लिए इस संसाधन प्रदान करने के दाताओं के लिए आभारी हैं । हम Allergan द्वारा धन के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं । हम भी इस लेख के प्रस्तुत करने के लिए वीडियो और संपादन की लागत के वित्तपोषण के लिए चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान प्रदर्शन आधारित अनुसंधान कोष के संकाय, ऑकलैंड विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Base Invitrogen 15504-020 Tris buffered saline
Sodium Chloride Merck 1064041000 Tris buffered saline
Potassium Chloride Merck 1049360500 Tris buffered saline
Sodium Azide Scharlau SO0091 Casein blocker solution
Casein Sigma C7078-500G Casein blocker solution
PBS tablet Sigma P4417-100TAB Phosphate buffered saline
DMEM/F12 Gibco 11330-032 Cell culture
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140-122 Cell culture
Glutamax Gibco 35050-061 Cell culture
Fetal bovine serum Gibco 10091-148 Cell culture
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Gibco 12563-029 Cell dissociation enzyme
96 well plate (flat bottom) Falcon FAL353072 Cell culture equipment
T75 culture flask, with filter cap Greiner 658175 Cell culture equipment
Insulin Sigma  19278-5ML Adipogenic differentiation media
dexamethasone Sigma D2915-100MG Adipogenic differentiation media
indomethacin sigma I7378-5G Adipogenic differentiation media
Oil-Red O Sigma O-0625 Classic stain for adipogenesis
Isopropanol Merck 1.09634 Classic stain for adipogenesis
16% formaldehyde Pierce 28908 Cell fixation
Acetone Merck 100983 Cell fixation
DAPI Sigma D9542 Immunocytochemistry
Anti rabbit IgG alexa 488 Molecular Probes A11008 Immunocytochemistry
Thimerosal Sigma T5125-10G Immunocytochemistry
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody Cayman Chemicals 10004944 Marker of adipogenesis
Centrifuge tubes (15mL) Greiner GR188271 General
Centrifuge tubes (50mL) Greiner GR227261-P General
ImageXpress Micro XLS Molecular Devices high content screening machine
MetaXpress Molecular Devices high content screening software, version 5.4.01

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जीव विज्ञान अंक 133 वसा व्युत्पंन stromal कोशिकाओं विभेद adipogenesis इमेजिंग immunocytochemistry इम्यूनोफ्लोरेसेंस ठहराव उच्च सामग्री स्क्रीनिंग
एक वंश विशिष्ट मार्कर के साथ Mesenchymal कोशिका Adipogenic विभेदक क्षमता का विज़ुअलाइज़ेशन और ठहराव
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Eom, J., Feisst, V., Ranjard, L., Loomes, K., Damani, T., Jackson-Patel, V., Locke, M., Sheppard, H., Narayan, P., Dunbar, P. R. Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker. J. Vis. Exp. (133), e57153, doi:10.3791/57153 (2018).

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