Summary
Traditionele methoden voor de beoordeling van de differentiatie van de adipogenic zijn goedkoop en makkelijk te gebruiken, maar zijn niet specifiek voor wijzigingen in genexpressie. Hebben we een test om te kwantificeren mesenchymale celdifferentiatie in volwassen adipocytes met behulp van een specifieke marker van afkomst. Deze bepaling heeft diverse toepassingen in basisonderzoek en klinische geneeskunde.
Abstract
Verschillende kleurstoffen zijn momenteel beschikbaar voor gebruik bij de opsporing van differentiatie van mesenchymale cellen in adipocytes. Kleurstoffen, zoals olie Red O, zijn goedkoop, makkelijk te gebruiken en wijd gebruikt door laboratoria analyseren het adipogenic potentieel van mesenchymale cellen. Nochtans, zijn zij niet specifiek zijn voor veranderingen in gen transcriptie. We hebben een gen-specifieke differentiatie test om te analyseren wanneer een mesenchymale cel zijn lot is overgeschakeld naar een adipogenic afstamming ontwikkeld. Immuno-etikettering tegen vetzuur bindende eiwit-4 (FABP4), een geslacht-specifieke marker van adipogenic differentiatie, visualisatie en kwantificering van gedifferentieerde cellen ingeschakeld. De mogelijkheid om te kwantificeren adipogenic differentiatie mogelijkheden van mesenchymale cellen in de indeling van een 96 goed microplate heeft veelbelovende gevolgen voor een aantal toepassingen. Honderden van klinische proeven wordt gekenmerkt door het gebruik van volwassen mesenchymale stromale cellen en het is momenteel moeilijk te correleren therapeutische resultaten binnen en vooral tussen dergelijke klinische proeven. Deze eenvoudige high-throughput FABP4 assay biedt een kwantitatieve test voor het beoordelen van het potentieel van de differentiatie van patiënt-afgeleide cellen en is een krachtige tool voor het vergelijken van verschillende methoden voor isolatie en expansie. Dit is vooral belangrijk gezien de toenemende erkenning van de heterogeniteit van de cellen wordt toegediend aan patiënten in mesenchymale cel producten. De bepaling heeft ook potentiële nut in hoge-doorvoer drug screening, met name in zwaarlijvigheid en pre diabetes onderzoek.
Introduction
Een van de belangrijkste voorschriften van de internationale vereniging voor cellulaire therapie (ISCT) om een multipotente mesenchymale stromale cel te definiëren is dat de cellen de mogelijkheid hebben moeten om te differentiëren in de adipogenic, osteogenic en de chondrogenic-geslachten 1. conventionele methoden voor het meten van differentiatie in deze drie geslachten is afhankelijk van de opsporing van macromoleculaire producten met behulp van chemische kleurstoffen1. Kleurstoffen zoals olie Red O (die vlekken dikke druppels in cellen die adipogenesis hebben ondergaan), zijn goedkoop en makkelijk te gebruiken; echter verzuimen om de opsporing van de specifieke wijzigingen in genexpressie die optreden wanneer mesenchymale cellen onderscheiden in elke respectieve lineage2. Hier hebben we een differentiatie test die eiwit expressie voor een adipogenic afstamming-specifieke marker, vetzuur bindende eiwit-4 (FABP4)3,4,5 kwantificeert. FABP4 werd in eerste instantie gevonden in lymfkliertest 3T3-L1 adipocytes3 en werd later ontdekt moet worden uitgedrukt in menselijke onderhuids vetweefsel6. Het is een cytosolische eiwit, die fungeert als een chaperone bij vetzuur opname door cellen en is betrokken bij het proces van lipolyse4.
De van voorlopercellen die worden gebruikt voor het testen van de differentiatie waren obesitas afgeleide mesenchymale stromale cellen (ASC's)7,8. ASC's delen vele eigenschappen met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSCs), een grote mesenchymale stamcellen bevolking in volwassenen8,9. ASC's bieden verschillende voordelen ten opzichte van BM-MSCs in een klinische toepassing, zoals meer rendement van cellen geïsoleerd van beter toegankelijk weefsel bronnen8,9 worden kan. Een geïsoleerde celpopulatie moet voldoen aan bepaalde criteria worden gedefinieerd als ASC's. Eerst, moeten ze laten zien van naleving van kunststof weefsel kweekvat in standaard cultuur voorwaarden1. Ze tonen ook moeten specifieke oppervlakte-antigeen expressie1. Onbeschaafd ASC's worden gekenmerkt door positieve surface antigeen uitdrukking van CD34, CD73, CD90, lage uitdrukking van CD105 en negatieve uitdrukking van CD45 en HLA-DR10. ASC's gezuiverd door het kweken op kunststof voor 28 dagen (aanhanger gezuiverd ASC's) tonen positieve uitdrukking van CD73, CD90 en CD105 en negatieve expressie van CD34, CD45 en HLA-DR10. Tot slot moeten cellen behouden de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende geslachten1,-7,8.
Adipogenic differentiatie protocollen induceren opvallende opregulatie van FABP4 expressie onder andere adipocyte lineage genen, zodat we Immunochemie gewend met het visualiseren van FABP4 eiwitten in cellen, en vervolgens gekwantificeerd FABP4 expressie op het niveau van één cel met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende high-content screening Microscoop. Deze methode is voordelig over traditionele kleurstoffen zoals hierdoor zeer specifieke bevestiging van adipocyte-bloedlijn differentiatie. Deze gen specifieke lineage gehaltebepalingen gecombineerd met een hoog gehalte screeningmethoden ook inschakelen kwantificering van het aantal cellen binnen de voorbereiding van een heterogene cel die in staat van differentiatie naar beneden een bepaalde afkomst zijn. In onze studies gebruikten we de bepaling van de FABP4 te bevestigen verlies van adipogenic differentiatie mogelijkheden van vers geïsoleerde ASC's na celkweek.
Protocol
1. voorbereiding ASC's van differentiatie Assays
- Bereiden van weefselkweek reagentia en behandelen van levende cellen in een steriele weefselkweek kap.
- Bereiden van A0 medium: Dulbecco bewerkt Eagle Medium en Ham van F12 Medium (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x penicilline/streptomycine.
- Bereiden van complete ASC medium: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicilline/streptomycine, 10% foetale runderserum.
- Gebruik aanhanger gezuiverd ASC's, uitgebreid in een maatkolf van T75 cultuur. Bevestig de zuiverheid van ASC's met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS)10.
- Loskoppelen cellen door het verwijderen van alle medium uit de T75 cultuur kolf en toevoeging van 2 mL van cel dissociatie enzym.
- Laat de kolf van de cultuur in de incubator (37 ° C, bevochtigde, 5% CO2) voor 5-10 min. Neem de erlenmeyer van de cultuur uit de incubator en stevig Tik op de kant van de kolf. Controleer als de cellen hebben losgemaakt van de kolf van de cultuur met behulp van een omgekeerde Microscoop.
- Voeg 13 mL van A0 medium over in een maatkolf van T75 cultuur.
- Breng 15 mL in een tube van 15 mL centrifuge en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van volledige ASC medium.
- Het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 25.000 cellen mL-1 in volledige ASC medium.
- Breng 200 µL van A0 medium in alle putjes van de periferie van de 96 goed plaat (platte bodem). Dit vermindert de verdampingssnelheid van de putten met cellen in het midden.
- 200 µL celsuspensie overbrengen in een plaat van de microwell te bereiken van een definitieve celdichtheid van 5 x 103 cellen per putje. Vier putten zijn nodig voor elke groep van de behandeling (drievoudige technische herhalingen en een primair antilichaam oncontroleerbaar voor immunocytochemie (ICC)).
- Laat microwell plaat in de incubator (37 ° C, bevochtigde, 5% CO2) tot cellen bereik samenvloeiing (3-4 dagen).
2. inducerende differentiatie van ASC 's
- Voorbereiden adipogenic differentiatie medium door volledige ASC medium met 1 µM dexamethasome, 10 µM insuline en 200 µM indomethacin aan te vullen. Het medium van volledige differentiatie is stabiel bij 4 ° C gedurende 1 maand, dus alleen maken als vereiste voor 1 assay. Winkel bij 4 ° C en zonodig Verwarm een aliquoot gedeelte tot 37 ° C in waterbad.
- Na 3-4 dagen, neem microwell plaat uit incubator en vervang de helft van het kweekmedium met adipogenic differentiatie medium.
- Het uitvoeren van een middelgrote veranderen elke 2-3 dagen.
Opmerking: Vereist optimale adipogenic differentiatie 14 dagen van de cultuur in differentiatie medium. Gedifferentieerde cellen worden geanalyseerd met behulp van traditionele kleurstof gebaseerd vlekken en gen-specifieke vlekken.
3. kleuring voor differentiatie - gebaseerde traditionele kleurstof vlekken
- Bereiden van 4% formaldehyde oplossing door verdunning van 16% formaldehyde met PBS. Verdun alleen het bedrag dat nodig is voor experiment en winkel strak verzegeld in een centrifugebuis.
Let op: Formaldehyde is een potentieel kankerverwekkend en kan leiden tot irritatie van neus, keel en longen bij inademing. Voer alle procedures met betrekking tot formaldehyde in een zuurkast. - Bereiden olie Red O stockoplossing door ontbinding van 300 mg in 100 mL isopropanol.
- Neem de microwell plaat uit de incubator. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd in een niet-steriele omgeving.
- Verwijder alle medium uit putten en herstellen van cellen met 4% formaldehyde voor 30 min.
- Tijdens de incubatietijd, bereiden olie Red O werkende oplossing. Werkoplossing bestaat uit 6 delen olie Red O materieel met 4 delen gedistilleerd water (dH2van O). Meng goed en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, voor het filteren met behulp van 0,2 µm filter eenheid. Werkoplossing is alleen stabiel gedurende 2 uur.
- Verwijder alle formaldehyde uit putten door pipetteren.
- Wassen cellen eenmaal met 60% isopropanol en laat die de putjes volledig voordat u verdergaat drogen.
- Voeg 50 µL van olie Red O werkoplossing aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Verwijder olie Red O oplossing en onmiddellijk toevoegen dH2O. Wash met dH2O 4 keer eerder bekijken onder lichte Microscoop.
4. vlekken voor differentiatie - gen-specifieke antilichamen
- Stockoplossing Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) voor te bereiden door het oplossen van 80 g NaCl, KCl 2 g en 30 g voor Tris Base tot 1 L dH2O (pH 8). Werkoplossing bereid door verdunning 1:10 met behulp van dH2O. winkel bij kamertemperatuur.
- Voorbereiden van de immunobuffer (IB) (1% foetale runderserum (FBS) in TBS). Label de centrifugebuis 15 mL met datum en bewaren bij 4 ° C. IB kan worden gebruikt voor 1 week na de datum gemaakt.
- Bereiden van 0,25% caseïne blocker door ontbinding van 0,5 g van caseïne en 0,195 g van natriumazide in 200 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Volledig los de bestanddelen door 's nachts roeren. ALIQUOT in 15 mL centrifuge buizen en winkel in een vriezer van-20 ° C. Ontdooide caseïne oplossingen kunnen gedurende 1 maand bij 4 ° C worden bewaard.
- Bereid de DAPI-oplossing door het verdunnen van voorraad DAPI 1:200 in eetlepels winkel bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Bereid de voorraad thimerosal oplossing (10 mg mL-1) door het oplossen van thimerosal in steriele PBS. Bewaren bij 4 ° C en Verdun passende bedragen tot 0.4 mg mL-1 voor gebruik.
- Positiebepaling en permeabilize cellen met ijskoude methanol (96 goed plaat) voor 5 min. Wash cellen eenmaal met 200 µL van eetlepels
- Blok met 50 µL van 0,25% caseïne bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en een keer wassen met eetlepels
- Voeg 50 µL van primaire antilichamen verdund in IB (Zie tabel 1 voor antilichaam details) en incubeer met deksels gesloten voor 1 h.
- Een keer wassen met 200 µL van TBS, en dan 3 keer met TBS voor 5 min met zachte rockende.
- Voeg 50 µL van secundaire antilichamen verdund in IB (Zie tabel 2 voor antilichaam details) met 1:2000 DAPI in elk, incubeer met deksels gesloten voor 1 h. Cover de plaat met folie ter voorkoming van foto-bleken.
- Een keer met TBS, wassen en dan tweemaal met TBS voor 15 min met zachte rockende.
- Verwijder alle TBS en voeg 200 µL van thimerosal oplossing.
- Opslaan plaat bij 4 ° C, beschermd tegen licht tot imaging.
5. beeldvorming cellen met behulp van een High-Throughput Microscoop
- Analyseren van cellen gekleurd met gene specifieke antilichamen en fluorophore geconjugeerd secundaire antilichamen (immunofluorescentie) met behulp van een hoge inhoud screening Microscoop gecontroleerd met bijbehorende software.
- Laad de microwell plaat in het stadium van de Microscoop. Selecteer afbeelding op middellange scala vergroting (10 X objectief) betreffende de beheersing van de overname plaat. Controleer of afbeeldingen zijn afkomstig uit het midden van elk putje, met 50 µm afstand tussen elke site om ervoor te zorgen dat één cel wordt niet weergegeven in twee aangrenzende velden.
- Selecteer de putten om het imago.
- Selecteer het juiste kanaal combinaties, belichtingstijd en z-offset parameters. Zie tabel 3 voor meer gedetailleerde informatie voor elke filters (aanvullende tabel 2).
- De bepaling met behulp van de wizard van de overname (beelden worden automatisch opgeslagen op de databaseserver) verwerven.
- Alternatieve kanaal combinaties gebruiken om het verwerven van platen gekleurd met olie rood O. (aanvullende tabel 3).
6. Analyseer verworven afbeelding
Opmerking: Remote toegang tot de database server maakt het mogelijk snel en eenvoudig evaluatie van de beelden verkregen en het gebruik van de software van de analyse van de afbeelding.
- Open cel scoren module op de analysesoftware.
- Detecteren van celkernen met DAPI kanaal (nucleaire marker) en segment kernen van belang door de gebruiker gedefinieerde parameters voor grootte en signaal intensiteit boven achtergrond.
- FABP4 signaal met FITC kanaal te detecteren. Segment van gedifferentieerde cellen met door de gebruiker gedefinieerde parameters voor grootte en signaal intensiteit boven achtergrond alle FABP4 positieve regio's in elke afbeelding selecteren.
- Open Transfluor-module op de analysesoftware analyseren platen gekleurd met olie rood O.
- Geef de grootte en de intensiteit van olie Red O gekleurd regio's als 'putten'.
Representative Results
In deze studie werden de mogelijkheden van de adipogenic-differentiatie van ASC's met 3 verschillende methoden gemeten. Immunefluorescentie etikettering van FABP4, bleek dat deze markering gelokaliseerd naar het cytoplasma van gedifferentieerde cellen en de etikettering overlapt met DAPI-gelabelde kernen (figuur 1A). Automatische beeldanalyse bleek een 24.6-voudige toename in de map % FABP4 positieve cellen in de gedifferentieerde groep in vroege passage cellen ten opzichte van 6.9-voudige toename in late passage cellen (figuur 1B). Olie Red O kleuring werd gelokaliseerd op dikke druppels verspreid over het cytosol van gedifferentieerde cellen en de etikettering zelden overlappen met de DAPI-gelabelde kernen; echter van visuele inspectie, er zijn minder celkernen gekoppeld aan de dikke druppels olie Red O in de late passage cellen ten opzichte van vroege passage cellen (figuur 2A). Automatische beeldanalyse bleek een 11.1-voudige toename op het gebied van olie Red O kleuring per cel in vroege passage cellen en een 53.9-voudige toename in de kleuring van de oppervlakte per cel in late passage cellen (figuur 2B). Beeldvorming van de beide vlekken werd uitgevoerd, en vervolgens gekwantificeerd aan de hand van cel scoren (FABP4) of Transfluor (olie Red O) module in de software (aanvullende figuur 1, aanvullende tabel 2-5). De opregulatie van FABP4 meningsuiting werd bevestigd door westelijke vlekkenanalyse (Figuur 3, aanvullende figuur 5). Alle 3 analysemethoden is gebleken dat de ASC's vroege passage hogere adipogenic differentiatie potentiële dan laat passage cellen hebben. De differentiatie van de adipogenic beïnvloedde niet de cel Totaal aantal per putje (aanvullende figuur 2, 3). De grootte van de kernen van de FABP4-positieve gedifferentieerde cellen was echter aanmerkelijk kleiner dan de controle cellen voor late passage ASC's alleen (aanvullende figuur 3).
We toonden aan dat als cellen werden uitgebreid in cultuur, of gepasseerd, het percentage cellen binnen de cultuur staat adipogenic differentiatie verminderde, in overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens11. Het is belangrijk op te merken dat factoren zoals leeftijd, index van de lichaamsmassa of eerdere medische geschiedenis12 kon niet worden gecontroleerd voor in deze studie en waarschijnlijk aan de variabiliteit waargenomen tussen verschillende donor monsters (aanvullende tabel 1 bijgedragen).
Figuur 1 : FABP4 immunolabelling toont aan dat vroege passage cellen grotere differentiatie potentiële dan later passage cellen hebben. A) representatieve beelden van vroege en late passage, controle en gedifferentieerde cellen voorzien van de DAPI (nucleaire vlek) en FABP4 staan naast beelden samenvoegen en segmentatie. De segmentatie afbeeldingen weergegeven gedifferentieerde cellen met een groene overlay en ongedifferentieerde cellen met een rode overlay. B) een aanzienlijke toename FABP4 uiten van cellen werd waargenomen met adipogenic differentiatie in vroege en late passage cellen, cellen van vroege passage blijkt echter aanzienlijk grotere stijging van de differentiatie dan laat passage cellen (Mann-Whitney test * duidt P < 0,05 en *** duidt P < 0,001). De gegevens worden weergegeven is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Olie Red O kleuring blijkt dat vroege passage cellen grotere differentiatie potentiële dan later passage cellen hebben. A) de representatieve beelden van de DAPI (nucleaire vlek) en olie Red O (grijs, lipide druppel vlek) staan naast beelden samenvoegen en segmentatie. De segmentatie beelden tonen alle kernen met groene overlay en olie Red O bevlekt lipide druppels met een rode overlay. B) een aanzienlijke toename van de olie Red O kleuring gebied werd waargenomen met adipogenic differentiatie. Vroege passage cellen bleek groter gebied van olie Red O vlek per cel ten opzichte van eind passage cellen. Het gebied van olie Red O kleuring per cel (μm2) wordt gebruikt als maatstaf voor adipogenic differentiatie potentiële hier. De gegevensset die wordt getoond is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM (Mann-Whitney test * duidt P = < 0,05 en *** duidt P = < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Westelijke vlekkenanalyse van FABP4 eiwit expressie niveau van gedifferentieerde vroege en late passage ASC's. Semi-kwantitatieve analyse van de optische dichtheid van FABP4 bands als een verhouding van totale proteïne laden control, bèta actine (ACTB), bleek dat de FABP4 immunolabelling werd aanzienlijk verhoogd in vroege passage en een mindere mate laat passage gedifferentieerd cellen. De gegevensset die wordt getoond is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM (Mann-Whitney test * duidt P = < 0,05 en *** duidt P = < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Doel antigeen | Isotype (kloon) | Soorten | Verdunning |
| FABP4 | Polyclonal | Konijn | 1:100 |
Tabel 1: Primair antilichaam
| Targeting antilichaam | Fluorophore label | Soorten | Verdunning |
| Konijn IgG | Alexa Fluor 488 | Geit | 1:200 |
Tabel 2: Secundair antilichaam
Aanvullende figuur 1: overzicht van de analyse van de virtuele omgeving van afbeelding. De gekleurde cellen werden beeld met behulp van een geautomatiseerde, hoge-doorvoer fluorescente microscoop om te voorkomen dat elke bron van bias. Beelden waren verkregen met behulp van ImageXpress Micro XLS, rechtstreeks aan de Manager van de gegevens van de MDCStore database opgeslagen en beschikbaar gemaakt voor bekijken via verbindingen met virtuele bureaubladen, die gebruikers gebruiken om te optimaliseren en testen hun specifieke analyse gebruikte parameters. Beelden werden geanalyseerd met een speciale 'autorun'-exemplaar waarmee u meerdere verschillende 'jobs' naar de autorun-wachtrij verzenden. Gebruikers kunnen hun gegevens via de virtuele exemplaar ophalen zodra hun 'baan' zijn voltooid. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2: vergelijking van totaal cel tellen per putje van controle en gedifferentieerde putten voor vroege en late passage ASC's, met behulp van de plaat gekleurd FABP4. De gegevens worden weergegeven is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM. Was er geen statistisch significant verschil tussen het besturingselement en gedifferentieerde cellen voor zowel de vroege en de late passage ASC's. Er waren meer cellen per putje voor vroege passage cellen ten opzichte van eind passage cellen. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 3: vergelijking van totaal cel tellen per putje van controle en gedifferentieerde putten voor vroege en late passage ASC's, met behulp van olie Red O plaat gekleurd. De gegevens worden weergegeven is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM. Was er geen statistisch significant verschil tussen het besturingselement en gedifferentieerde cellen voor zowel de vroege en de late passage ASC's. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 4: op latere passages, gedifferentieerde cellen die FABP4 positieve waren had aanzienlijk kleinere kernen gebied dan cellen in de controleputjes. Er was geen statistisch significant verschil in kernen ruimte tussen het besturingselement en gedifferentieerde cellen in vroege passage. De gegevens worden weergegeven is de gemiddelde over vroege passage (p4; n = 8) of laat passage (p10; n = 4) donor monsters, ± SEM. (ongepaarde t test *** duidt P = < 0,001). Gemiddelde ± SEM worden weergegeven.) Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 5: afbeeldingen of Western blot gels. Rode kanaal toont bèta-actine. Groene kanaal toont FABP4 immunolabelling. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: Clinicopathological informatie van donors Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende tabel 2: Imaging instellingen (FABP4) Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende tabel 3: Imaging instellingen (olie Red O) Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende tabel 4: tabel van de analyse gebruikte parameters gebruikt (FABP4). Cel Scoring module. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende tabel 5: tabel van de analyse gebruikte parameters gebruikt (olie Red O). Trans Fluor module. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Discussion
Deze paper toont het nut en de voordelen van FABP4 immunolabelling voor het nauwkeurig detecteren en kwantificeren van de volwassen adipocytes afgeleid van mesenchymale stromale cellen. FABP4 is het kundig voor speurder veranderingen in de expressie een geslacht specifieke proteïne3,,4,5 in volwassen adipocytes, in tegenstelling tot andere vaak gebruikte kleurstoffen welk label macromoleculaire13,14 verandert zoals olie Red O15, Nijl rood16 en Sudan Black17. FABP4 immunolabelling zorgt voor visualisatie en analyse van de veranderingen in de cellulaire morfologie. Dit is een onderscheidend voordeel ten opzichte van eerder beschreven methoden gebruiken van kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) die wijzigingen op het transcript-niveau zonder enige visualisatie5,18,19 analyseert ,20, of stroom cytometry waarvoor cellen in schorsing20, of westelijke bevlekken dat vereist cellen worden lysed eiwit19,20te isoleren. FABP4 immunolabelling is stabiel in vaste cellen, niet in oplossing doet uitlekken en wordt een cytosolische eiwit wanneer geëtiketteerd in een aanhangend enkelgelaagde van cellen, zal overlappen met de kern waardoor voor eenvoudige visualisatie en nauwkeurigheid toegevoegd in de geautomatiseerde analyse.
Hoge-content screening is voordelig, want het is snel, accuraat, reproduceerbare en objectieve. Het biedt een platform voor kosteneffectieve gebruik van reagentia en onderzoeker tijd, aangezien Beeldacquisitie en analyse minimale handmatige manipulatie vereist en op de automatische verwerking van het instrument vertrouwen. Verschillende factoren werden geïdentificeerd als kritiek aan de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de screening van hoge-inhoud testen31. De kwantificering van antigeen expressie is afhankelijk van de beeldkwaliteit. Voor succesvolle beeldanalyse, beelden van elk kanaal per putje moeten worden in focus en een optimale dynamisch bereik vallen voor grijswaarden (Auto bloot instellingen zijn ideaal). Out of focus of verzadigde beelden leiden tot onjuiste resultaten.
Enkele mogelijke beperkingen van de in dit artikel beschreven methoden omvatten de volgende. De eis voor gespecialiseerde apparatuur en analyse imagingsoftware. Terwijl het buiten het bestek van dit artikel, kunnen alternatieve opensource softwareopties (bijvoorbeeld ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) worden gebruikt voor het uitvoeren van gelijkaardige beeldsegmentatie taken; echter hebben zij de vaardigheden om te downloaden en online op maat van macro's beschikbaar of het schrijven van macro's / opdrachten voor hun specifieke analyse pijpleidingen nodig. Die inherent zijn aan alle geautomatiseerde imaging analyse pijpleidingen is een niveau van achtergrondgeluiden. Dit kan grotendeels worden toegeschreven aan puin, slechte beeld kwaliteit of analyse fout, benadrukken de noodzaak voorzichtig monstervoorbereiding en zorgvuldige set-up van de beeldvorming en analyse platform. Het label van de FABP4 in muizen is gebleken om te detecteren ongedifferentieerde progenitoren30; terwijl de controles in deze studie (die bestaan voor ongedifferentieerde cellen) verstoken van specifieke FABP4 kleuring zijn. Deze geringe scoort de noodzaak van het controleren van FABP4 expressie gedifferentieerdeproductie progenitoren in elke biologische context waar de assay werkzaam is.
Om geldige vergelijkingen tussen de FABP4 etikettering en olie Red O kleuring, de metingen van de uitvoer van beeldanalyse moest biologisch relevant zijn. Dus de meting, '% positieve cellen' werd gebruikt voor FABP4, en "ruimte van kleuring per cel" werd gebruikt voor olie rood O. Het is opmerkelijk dat de maatregel '% positieve cellen' niet werd gebruikt voor olie Red O geëtiketteerd cellen in onze studie, want het was niet mogelijk om de gelabelde dikke druppels nauwkeurig toeschrijven aan een bepaalde kern; de dikke druppels gevarieerd aanzienlijk in grootte, aantal en de verdeling over de cel lichaam en zelden overlappen met de kern. Olie Red O kleuring variabiliteit bestaat tussen cellen afgeleid uit verschillende weefsel bronnen; terwijl de % positieve cellen maatregel was niet geschikt is voor de huidige studie, een andere groep heeft het met succes gebruikt te kwantificeren adipocytes afgeleid van menselijke klier stamcellen22 waar de olie Red O kleuring verscheen als één grote dikke druppel die overspannen de cytoplasma en overlappende met kernen en waardoor de gegevens worden gepresenteerd als % positieve cellen.
Daarentegen is de morfologie van FABP4 immunolabelling consequent adipocytes afgeleid van allerlei verschillende weefsel bronnen23,24,25. De mogelijkheid om te kwantificeren van het aantal cellen binnen een cultuur staat differentiatie heeft een aantal toepassingen. Volwassen mesenchymale stromale cellen houdt belangrijke belofte voor een breed scala aan therapeutische toepassingen. Een belangrijke kwestie die is ontstaan met klinische vertaling is de inherente variabiliteit in het vermogen van deze cellen tussen patiënten26, tussen sites van isolatie27,28, en tussen de methoden voor de isolatie12 en uitbreiding van cel nummers12 voor therapeutisch gebruik. Het heeft aangetoond eerder dat culturen van aanhangend stromale cellen zijn vaak heterogene, met sommige cellen staat van differentiatie en sommige niet 12,17 als onze FABP4 toont assay voor ASC culturen. Testen zoals dit, in combinatie met de technieken van de verrijking, zal helpen bij het identificeren van de subpopulatie binnen heterogene culturen staat van geslacht-specifieke differentiatie. Met een gestandaardiseerde, kwantificeerbare assay zoals deze FABP4 assay biedt een eenvoudige methode voor vergelijking tussen al deze variabelen, en het potentieel om te evalueren van therapeutische resultaten binnen en tussen de klinische proeven.
De kwantificering van FABP4 in een semi-automatische mode objectiviteit en reproduceerbaarheid in analyse mogelijk maakt, in heel veel gevallen van de donor en monsters. Bovendien als het label cytoplasmatische is, het kan potentieel worden gebruikt om te analyseren hypertrofie (uitbreiding van adipocyte grootte) naast hyperplasie (toename in adipocyte nummer), een onderscheid dat is van groot belang in obesitas onderzoek, waar hypertrofie is sterk geassocieerd met obesitas dysfunctie in zwaarlijvige individuen21. De obesitas-epidemie heeft aangespoord een significante hoeveelheid van belang bij het identificeren van de drugs kunnen regelen van lipide-opslag. Deze FABP4 assay voorziet ook in een eenvoudige uitlezing screenen duizenden compounds voor hun vermogen om te remmen lipide accumulatie.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan de donoren van het vetweefsel en de onderzoek-professionals die verzamelen en deze bron aan ons verstrekt voor gebruik in onderzoek. Wij willen erkennen financiering ondersteuning door Allergan. Wij zijn ook dankbaar aan de Universiteit van Auckland, Faculteit van de medische en Health Sciences prestaties gebaseerd onderzoek Fund voor de financiering van de kosten van videoing en bewerken voor de indiening van dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
